生物工程下游技术实验讲义Word文档格式.docx
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(二)SephadexG-50凝胶预处理
称取相应质量的干凝胶,加入适量的0.02
mol/L
PBS
在100℃水浴中加热溶胀1小时以上,溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。
用真空干燥器抽尽凝胶中空气,并将凝胶上面过多的溶液倾出。
(3)层析柱的装填
1清洗:
每组取一支层析柱,用清水冲洗干净。
2安装与检查:
检查柱下部烧结滤板是否完好干净。
安装层析柱,让其垂直固定于滴定台架上。
对准出口处,放一只250mL烧杯。
3.关闭层析柱出水口,向柱管内加入约1/4柱容积的缓冲液
4、边搅拌,边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中,使其自然沉降,等凝胶沉降约2-3cm后,打开柱的出口,调节合适的流速,使凝胶继续沉降,并不断加入凝胶液,最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有2-3cm高的缓冲液,关闭出水口。
5、柱子装好后,用缓冲液平衡柱子。
用15ml洗脱剂走柱子使柱床稳定(流速0.5~1
mL/min)
始终保护凝胶上端有一段液体
。
(注意不能干柱、分层、否则需重新装柱)
(四)凝胶柱柱效测定
1肉眼观察,柱子填装是否均匀,无纹路,无气泡
2用0.5ml2mg/mL的蓝色葡聚糖-2000上柱,如果色带狭窄、平整、均匀下降,表明柱中的凝胶填装情况较好,可以用来进行样品分离。
如果色带分散,歪曲,则需重新装柱。
(五)凝胶再生
鉴定完毕,打开出水口,继续用2~3倍床体积洗脱剂洗脱,洗脱后关闭出口,以备下次使用。
五、注意事项
1.
装柱要均匀,既不过松,也不过紧,流速不宜过快,避免因此压紧凝胶。
2.
始终保持柱内液面高于凝胶表面,否则水分蒸发,凝胶变干。
也要防止液体流干,使凝胶混入大量气泡,影响液体在柱内的流动。
3.
所用凝胶比较昂贵,需小心操作,实验后回收,尽量避免浪费和损失
六、背景资料
凝胶层析的使用
(一)
层析柱
层析柱是凝胶层析技术中的主体,一般用玻璃管或有机玻璃管,柱的直径与长度根据经验,组别分离时,大多采用
20-30cm
长的层析柱,分级分离时,一般需要
100cm
左右长的层析柱,其直径在
1-5cm
范围内,小于
1cm
产生管壁效应,大于
5cm
则稀释现象严重。
由于层析柱的直径大小不影响分离度,所以样品量大时可用大直径的层析柱
(一般制备用凝胶柱,直径大于
2cm
但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上
)
分离度取决于柱高,为分离不同组分,凝胶柱床必须有适宜的高度,分离度与柱高的平方根相关,但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞,一般不超过
1m。
⑴
分组分离时用短柱,一般凝胶柱长
20-30cm
,柱高与直径的比较
5:
1─10:
1
,样品溶液体积应小于
凝胶床体积为的
20%
⑵
分级分离时柱高与直径之线为
20:
1─100:
(层析柱滤板下的死体积应尽可能的小,如果支撑滤板下的死体积大,被分离组分之间重新混合的可能性就大,其结果是影响洗脱峰形,出现拖尾出象,降低分辩力。
在精确分离时,死体积不能超过总床体积的
1/1000
),样品溶液体积
应小于
5
%
⑶
脱盐:
高分子(如蛋白质、核酸、多糖等)溶液中的低分子量杂质,可以用凝胶层析法除去,这一操作称为脱盐。
适用的凝胶为
SephadexG-10、15、25
或
Bio-Gel-p-2、4、6
柱长与直径之比为
5-15
,样品体积可达柱床体积的
20-25%
,为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上,一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡,然后加入样品,再用同样缓冲液洗脱,收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。
(二)凝胶的类型
常用凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。
具体的种类型号及性能列表如下:
种类及主要用途
化学组成
部分型号
颗粒大小(/目数)
分离性能(Da)
溶胀时间/h
20-25℃
90-100℃
葡聚糖凝胶(Sephadex
G-)
由葡聚糖和甘油基通过醚桥交联而成
G-10
100-200
<700
3
G-15
120-200
<1500
1
G-25
50-400
100-5,000
G-50
500-30,000
G-75
120-400
1,000-8,000
24
G-100
1,000-15,000
72
G-150
1,000-30000
G-200
1,000-60,000
聚丙烯酰胺凝胶(Bio-gel
p-)
由丙烯酰胺和双丙烯酰胺共聚而成
P-2
200-1,800
4
2
P-4
800-4,000
P-6
1,000-6,000
P-10
1,500-20,000
P-30
50-200
2,500-40,000
12
P-60
3,000-60,000
P-100
5,000-100,000
5
P-150
15,000-150,000
P-200
50,000-20,000
48
P-300
60,000-400,000
琼脂糖凝胶(Sepharose
gio-gel
由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接而成,为中性琼脂糖
A
0.5m
<10,000-500,000
1.5m
<10,000-1,500,000
5m
10,000-5,000,000
15m
10,000-15,000,000
50m
100,000-50,000,000
150m
1,000,000-150,000,000
(三)凝胶的选择
根据所需凝胶体积,估计所需干胶的量。
一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍,例如
Sephadex
的吸水量为20,1克Sephadex
G─200
吸水后形成的凝胶体积约
40mL
凝胶的粒度也可影响层析分离效果。
粒度细分离效果好,但阻力大,流速慢。
一般实验室分离蛋白质采用
号筛目的的
效果好;
脱盐用
G-25、G-50,用粗粒,短柱,流速快。
(四)凝胶的制备
商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。
为了加速膨胀,可用加热法,即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸,这样可大大加速膨胀,通常1-2小时内即可完成。
特别是在使用软胶时,自然膨胀需24小时至数天,而用加热法在几小时内就可完成。
这种方法不但节约时间,而且还可消毒,除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。
(五)样品溶液的处理
样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去,如含脂类可高速离心或通过
G-15短柱除去。
样品的粘度不能太大,否则影响分离效果。
上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。
(六)防止微生物的污染
交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质,防止微生物的生长,在凝胶层析中十分重要,常用的抑菌剂有:
(1)叠氨钠(NaN3)
在凝胶层析中只要用
0.02%叠氮钠已足够防止微生物的生长,叠氮钠易溶于水,在20℃时约为40%。
它不与蛋白质或碳水化合物相互作用,因此叠氮钠不影响抗体活力;
不会改变蛋白质和碳水化合物的层析特性,但可干扰荧光标记蛋白质。
(2)可乐酮
[Cl
3C-C(OH)(CH3)2
]
在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02%
在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳,在强碱性溶液中或温度高于60℃
时易引起分解而失效。
(3)乙基汞代巯基水杨酸钠
在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为
0.05-0.01
%。
在微酸性溶液中最为有效。
重金属离子可使乙基代巯基的物质结合,因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。
(4)苯基汞代盐
在凝胶层析中使用浓度为
0.001%-0.01
在微碱性溶液中抑效果最佳,长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀;
还原剂可引起此化合物分解;
含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。
(六)凝胶回收
如果不再使用可将其回收,一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干,依次用
70%、90%、95%乙醇脱水平衡至乙醇浓度达
90%以上,滤干,再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。
湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性,密封后高压灭菌保存。
实验二溶菌酶的粗提取
一、实验目的
1.掌握等电点沉淀法进行初级分离的操作方法和注意事项;
2.能针对不同的目标产物选择恰当的初级分离方法,锻炼应用生物分离技术知识分析、解决实际问题的能力。
溶菌酶是一种有效的抗菌剂,全称为1,4-β-N-溶菌酶,又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。
是一种糖苷水解酶,能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖与N-乙酰胞壁酸间的β-1,4糖苷键,由129氨基酸残基构成,由于其中含有较多碱性氨基酸残基,所以其等电点高达10.8左右,最适温度为50℃,最适PH为6~7左右。
溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内,鸡蛋(含量约为2%~4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源,目前,溶菌酶仍属于紧销的生化物质,鸡蛋的蛋清中含有丰富的上述物质,本实验以鸡蛋蛋清为原料,对溶菌酶进行提取。
溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性,在中性条件下溶菌酶带正电荷,因此在分离制备时,先采用等电点法粗分离。
721型分光光度计、摇床、高速离心机,200mL烧杯、玻璃棒、漏斗、定性快速滤纸、200mL量筒、50mL离心管,鸡蛋一个、0.02mol/LPBS(pH8.0),40%甘油
四、实验步骤
溶菌酶的粗提取(约两个半小时)
1.拿1个鸡蛋破壳取蛋清置于250mL烧杯中,轻轻搅拌5分钟,使其的稠度均匀,去除脐带和蛋壳。
记录其体积V1
2.加入1.5倍体积的pH8.0PBS缓
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