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肿瘤干细胞的分选技术
引言
肿瘤干细胞是在最近的十年间成为癌症研究的热点领域的,然而它并非是一个全新的概念,最早关于肿瘤干细胞的假设可以溯源至百年以前。
虽然最近数十年间也有对肿瘤中存在“干细胞”的推断,但长时间地停留在没有充分实验证据支持的假说阶段。
直到上世纪九十年代,Dick和他的同事们分离纯化出CD34+CD38-表型的白血病肿瘤细胞,才首次验证了肿瘤干细胞的理论。
肿瘤干细胞的发现是肿瘤和干细胞领域多年研究积累、汇集的成果,而其中有一项实验技术的贡献非常关键,也即本章所讨论的细胞分选技术。
众所周知,肿瘤并非是一群混沌的细胞,而更像是一个畸形的器官,构成肿瘤的细胞群体非常地多样和复杂,也即肿瘤异质性理论所表述的内容。
然而,要将肿瘤的各个细胞群体分离出来研究其特性,缺少细胞分选技术的介入恐怕是非常困难的。
事实上,肿瘤干细胞的研究更好地诠释了肿瘤的异质性,并且也可能是肿瘤领域将细胞分选技术运用得淋漓尽致的典范。
细胞种类不同,分选技术的内容也是非常丰富,因为细胞分选就是基于细胞的各种特性。
目前分选技术的运用大致可以归入这样几类:
一、针对细胞的物理特性,比如细胞的大小,密度,粘附性,折光性,携带电荷等,包括密度梯度离心,荧光激活细胞分选和细胞电泳等方法;二、针对细胞的表面抗原表型,通常可以采用荧光激活细胞分选、免疫吸附和免疫磁珠分离法;三、针对细胞的功能特性,如染料外排,钙离子浓度,pH,荧光蛋白表达,目前最常用的是依靠荧光激活细胞分选。
本章内容将简介常规细胞分选的工作流程,重点介绍目前应用较多的分选策略。
一/肿瘤样本取材和细胞分离
无论采用何种分选方式,分选之前的工作内容是相似的。
流程的第一步是从获得肿瘤标本。
绝大部分研究的样本都采集自外科手术,因此应获得伦理机构的许可和患者的知情同意文件,并记录患者的详细资料和核实最终的病理诊断结果。
一般认为,从手术中获得的样本到细胞分选的时间越短越好,故取材时必须与手术医生配合良好,取得标本后应尽早置于低温(4°C或冰上)。
通常在肉眼下,即可观察到肿瘤各部分组织具有一定异质性,取材应获取代表性的瘤块,并尽量避开坏死的区域。
样本可浸入RMPI1640和M199等培养基或Hank’s平衡盐溶液,可参考所研究肿瘤的特性选取。
一般情况下,低Ca2+浓度可减少细胞损伤和细胞间粘附,有利于下一步细胞分离;另外,HEPES缓冲体系多用来平衡体外环境的pH,抗生素的加入可以抵抗可能的污染。
这样取得的样本一般可直接进入实验室行下一步分选,亦有研究者采取先异种移植到免疫缺陷的NOD/SCID小鼠然后再行细胞分选的策略。
细胞分选的必要条件是制备单细胞悬液并尽可能地保留细胞的活力和功能状态,这一点对血液肿瘤不是问题,而对实体肿瘤而言可能是主要障碍。
不同肿瘤采用的分离手段都不尽相同,但一般采用机械分离加酶消化的方法。
瘤块可以置于低温Hank’s液中充分洗涤并用锋利的器械切割成2~4mm的小块,然后将小瘤块至于37°C含有消化酶的培养基中并适当的振荡,同时保持稳定O2、CO2和pH。
酶的使用至关重要,不恰当地使用可能导致细胞无法分离或是消化过度,而后者的结果可能是细胞表面蛋白的丢失和细胞损伤。
一般常用酶的消化能力由强到弱的排序依次是胰蛋白酶(Trypsin),木瓜蛋白酶(Papain),弹性蛋白酶(Elastase),透明质酸酶(Hyaluronidase),胶原酶(Collagenase)II、I、IV、III,离散酶(Dispase)和脱氧核糖核酸酶(DNase)I。
各种消化酶,各有优缺点,一般来说,效果较强的酶可能造成细胞损伤,效果较弱的酶对细胞损伤相对较小。
粗制的酶效果较强,选择性差,精制的酶效果较弱,特异性好,毒性小。
从近年的文献报道来看,组织分离中胰蛋白酶使用较少,而胶原酶使用较多,尤其对细胞表面受体损伤较小的IV和III型胶原酶。
另外胶原酶可以联合其他的酶使用以发挥最好的效果,如透明质酸酶可以增加结缔组织细胞间基质的解离,离散酶可以促进成纤维细胞的解离等。
胶原酶的作用时间可以很长,可大于48小时,但近来文献多报道酶的作用时间在2-4小时,以肿瘤类型不同而有所差异,在肝癌组织中(IV型胶原酶100IU/ml)甚至有15分钟见效的报道。
酶作用之后的组织消化液一般需要通过40-100μm的筛网以除去未消化完全的团块,沉淀细胞,除去上清,使细胞重悬于合适的培养基或平衡盐溶液。
操作过程要注意动作轻柔,沉淀细胞可以通过重力沉降或低速离心的方法,但需注意高速离心可能造成脆弱的细胞破裂。
收集到的细胞可以做计数和做活性染色,可以得到细胞的得率和存活率,这通常是必要的,有助于整个实验过程的质量控制。
事实上,分离得到的细胞的得率和存活率通常是不可兼得,只能追求一个合适的平衡点。
对于肿瘤干细胞的研究而言,对细胞的活力的要求是相当苛刻的,因为这将直接影响成瘤实验的结果。
二/荧光激活细胞分选
流式细胞仪的基本原理
流式细胞术(flowcytometry)是一种检测流体状态下的细胞或颗粒特征的技术,它可以在细胞流通过光电检测装置时实时地分析细胞的多个参数,包括细胞大小,颗粒度,荧光染色,免疫荧光标记等。
荧光激活细胞分选(Fluorescence-activatedcellsorting,FACS)则是特殊的流式细胞术,需要在专门的流式细胞仪上进行细胞分选的操作,流式细胞仪种类很多,图1是其中一种可用于细胞分选、分析的大型流式细胞仪。
图1BeckmanCoulter公司EpicsAltra型流式细胞分选分析系统
荧光激活细胞分选术是融合了光学,物理学,电子学和生物学多个学科知识的产物,其研发历经二十余年,到目前还在不断地改进以适应生物医学研究的需要。
流式细胞分选仪基本可以分为三大系统,即流体学系统(fluidics)、光学系统(optics)和电子系统(electronics),其产生也是由这三部分的技术并行地发展而造就的。
读者可以通过回顾流式细胞分选仪的发展历程来了解其系统的构造和细胞分选的原理。
流体系统的基本作用是带动单个细胞快速地通过检测器并把相应的细胞从中分离出来,该系统的发明和目前仍广为使用的Coulter血球计数仪密切相关。
Coulter机器体现了现代流式细胞仪的几个基本思想:
把细胞的特征(通过Coulter裂孔测得的电阻代表细胞体积)转化为电信号,快速并逐一检测单个细胞,并自动化地处理大量的细胞信号。
有趣的是,当时Coulter机器上检测到血液中存在两群体积大小不同的红细胞,Fulwyler等为了研究红细胞是否大小均一的问题时想到了首次采用了分选红细胞的办法,并造就了第一台流式细胞仪的原型(同时证明了红细胞双峰现象是伪象)。
他在Coulter计数仪上引入了喷墨打印机的喷墨技术,其基本原理仍然沿用至今:
高频振荡的喷嘴,将流动室流出的水柱断裂成均匀的水滴(drop),根据Coulter机器所检测的细胞大小的信号来使包含特定细胞的水滴带电,再利用偏转板形成的高压电场使其下落方向发生偏转,并落入相应的收集管中。
另外,Crosland-Taylor利用层流原理,让微小的细胞流束包裹在大量鞘液流中,从而使其“聚焦”于整个流体的中央,使细胞快速、单个地流动,解决了多个细胞同时通过检测口带来错误信号的问题。
至此,这两个发现奠定了流体细胞分选的基石。
然而,Coulter机器并没有真正的发展成为实用的流式细胞分选仪,可能的原因也许是它仅仅只能获得细胞体积的信号,应用的范围受到了限制。
在生物医学研究中,用显微镜来仔细观察细胞的形态特征并获得非常精细的图像显然是最经典的方法,但是要用这种方式来分析记录大量的细胞的特征则耗时费力。
事实上,早在Coulter机器之前,很多学者就在考虑用一种“流式系统”来弥补光学显微镜动态能力上的不足,而且随着荧光染料和单克隆抗体研究的发展,这种需求终于促成了现代流式细胞仪的诞生。
上世纪六十年代以后,洛斯阿拉莫斯实验室的MarvinVanDilla和斯坦福大学的Herzenberg教授各自引入了光学及电子系统的设计发明了用荧光来检测分选细胞的方法,荧光激活细胞分选这个术语即是由Herzenberg教授创造,而他也因在这个领域的重要贡献获得2006年京都奖。
概况的说,流式细胞仪的光学和电子系统的工作方式就是将激光束持续入射到液流中,当细胞或颗粒快速通过激光束时,会产生前向散射光(Forwardscatter)、侧向散射光(Sidescatter)和多种波长的荧光,这些光信号经过透镜和滤镜组之后被光电倍增管等电子系统分别接收并转换为电子脉冲。
而分选系统再根据这些信号和操作时的设定参数(门的设置)决定给特定细胞的液滴带上不同的电荷使其被分选出来(图2)。
图2流式分析原理图
荧光激活细胞分选的应用是非常广泛,因为细胞流式术可以检测的细胞的多种参数,如细胞的大小(前向散射光)、细胞的颗粒度(侧向散射光)、荧光染料的染色深浅、免疫荧光的抗体标记和细胞内的荧光蛋白量等。
从分选的方式上来讲,可以正性选择(阳性标记的细胞),可以负向选择(阴性标记的细胞),亦可以同时选择两个甚至多个细胞群体(视具体机器功能)。
再肿瘤干细胞的分选中,应用较为广泛的是利用免疫表型的分选和利用Hoechst33342拒染特性的侧群细胞分选。
免疫表型的荧光染色
免疫表型检测是从血液学和免疫学研究中发展起来,原理就是用荧光染料偶联的抗体标记细胞膜表面的分化抗原。
通常免疫荧光标记的方式包括直接标记和间接标记,一般流程如图3所示.具体的细节由分选的细胞和操作者的习惯有所不同,本章中着重介绍实际操作中的一些体会与经验,与同行交流、供读者参考。
图3免疫表型的荧光染色流程
首先,一般来说,整个抗体标记反应必需在冰浴上进行,洗涤、离心等步骤也要保持低温。
这样有助于增加细胞的存活率,而且低温下细胞膜的内吞活动大大减少,有利于抗原表位的检测。
细胞始终处于合适的平衡盐缓冲液如Hank’s液,磷酸盐缓冲液等,其中添加适度(2%)的血清可以减少细胞损伤和损失。
承载细胞悬液的容器宜选择聚丙烯材质的离心管,可以减少频繁离心洗涤过程中细胞的损失。
其次,封闭液中要包含第二抗体宿主(动物)的免疫球蛋白,主要防止细胞表面Fc段的受体非特异性的吸附抗体,这对血液中的单个核细胞尤其重要,长期培养的实体瘤细胞系可以视具体情况而定。
如果用间接法标记,第二抗体应尽量选择F(ab’)2段的抗体。
再次,一般情况下,直接标记法操作简单,染色效果更佳,也更有利于保持细胞活性,但是在多色标记的情况下,研究者务必先考虑好联合使用的方案(主要是针对拟使用的流式细胞仪的激光器、荧光通道选择可以搭配使用的不同荧光素标记的抗体)再购买抗体。
间接标记法使用灵活,可以搭配不同的一抗,有利于在研究初步检测和摸索条件,需要注意两点:
一是一抗、二抗之间的宿主免疫球蛋白的交叉反应,而是不同激发波长、发射波长的二抗标记荧光素。
另外,在分选过程中,免疫荧光标记必须有足够的分辨率,也即阳性细胞的荧光强度高,而阴性细胞的背景荧光弱。
这与抗体的质量和使用的浓度相关,抗体浓度过高在背景荧光过强,浓度太低则阳性信号太弱。
一般供应厂商会提供参考的抗体工作浓度(抗体稀释度),但事实上在使用时要自己摸索最适条件。
对直接标记的荧光一抗,一种可靠的方法是设立阳性和阴性对照,倍比稀释抗体测定不同浓度下阳性细胞群(signal)和阴性细胞群(noise)的平均荧光强度的比值(S/N),以S/N比值大为优。
质量优异的抗体可以在0.01-1.0μg/ml的浓度下得到S/N>3的效果。
一般情况下,0.5μg的抗体(免疫球蛋白)即足够用于100μl悬液中的1×106个细胞。
侧群细胞检测的Hoechst33342染色
侧群细胞(sidepopulation,SP)是一群具有外排染料特性的细胞群,在多种正常组织、肿瘤组织及肿瘤细胞系中都可检测到,分选到的侧群细胞中富集了正常干细胞或肿瘤干细胞。
侧群细胞在组
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