第九章核酸的分离与提纯_精品文档PPT推荐.ppt
- 文档编号:15485256
- 上传时间:2022-11-01
- 格式:PPT
- 页数:107
- 大小:14.48MB
第九章核酸的分离与提纯_精品文档PPT推荐.ppt
《第九章核酸的分离与提纯_精品文档PPT推荐.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《第九章核酸的分离与提纯_精品文档PPT推荐.ppt(107页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
因为RNase不但分布广泛,极易污染,而且耐高温,即使加热到蛋白变性,Rnase的活力也不会完全丧失,且具有惊人的回复力,而细胞内的核蛋白又总是和它联在一起,若去除不彻底,它将部分恢复活力,导致RNA降解。
生物降解是RNA提取过程的主要危害,储存的RNA制品也不例外,因此,为了抑制核酸酶的活性,一般在低温下(4或0,甚至-20左右)进行。
进行核酸分离时最好用新鲜生物组织或细胞样品,若不能马上进行提取,应将材料置液氮中或-80冰箱保存。
分离纯化核酸总的原则,一是应保证核酸一级结构的完整性,这是研究核酸结构与功能的最基本要求;
二是要排除蛋白质、脂类、糖类等其他物质的污染。
纯化的样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂或过高浓度的金属离子;
蛋白质、脂类、糖类等的污染应降低到最低程度;
无其他核酸的污染,如提取DNA时,应去除RNA。
2、载体DNA分离载体DNA感染或转染细胞(病毒型)转化细菌细胞(质粒型)分离病毒颗粒培养转化细胞、收集菌体病毒载体DNA分离与纯化破碎细胞质粒DNA分离与纯化,3、DNA片段的分离DNA限制酶切凝胶电泳分离特定DNA片段的回收4、质量评估1)凝胶电泳2)光密度值测定3)限制酶切分析,第二节核酸制备的基本方法,核酸制备的步骤,
(1)抽提组织或细胞的破碎、消融。
抽提核酸必须事先将生物材料破碎或消融,这关系到核酸回收率的高低。
破碎与消融组织细胞,通常有使用匀浆器、捣碎器的机械方法以及温和的反复冻融法,使用表面活性剂或各种酶处理的方法。
(2)抽提核酸,去除与核酸结合的蛋白质、多糖、脂类,去除盐、有机溶剂等杂质,以及去除其他不需要的核酸分子;
(3)核酸的精制纯化。
一、细胞的破碎,一般动物组织的细胞膜较脆弱,易破碎,而植物和微生物的细胞比较牢固。
细胞破碎的方法很多,可根据组织特性和核酸分离目的加以选择。
1物理方法,
(1)机械碾碎对于动物组织(如鼠肝、兔肝等),一般多采用匀浆的方法。
即将组织剪碎置研钵中,研碎。
为了提高研磨效果,可加入一定量的石英砂。
但要注意石英砂对有效成分的吸附作用。
用匀浆器处理,也能把动物细胞破碎,此法较温和,适于实验室应用。
若需大规模生产,则可用电动研磨法,酵母、植物组织的细胞破碎也可用此法。
(2)组织捣碎器法,是一种剧烈的破碎细胞的方法。
捣碎器(8000-10000r/min)处理3045s,植物和动物细胞能完全破碎。
若用它破碎酵母菌和细菌的细胞,则需加入石英砂方才有效。
在捣碎期间必须保持低温,以防温度升高引起有效成分变性,同时捣碎的时间不宜太长。
(3)超声波法,是借助声波的振动力破碎细胞壁和细胞器的有效方法。
由于细菌的外部有一层细胞壁,破壁较为困难,因此用超声波处理细菌和酵母的时问要长一点。
有些菌体破碎需要5l0min或更长,如果在细胞浮液中加石英砂则可缩短时间。
为了防止电器长时间运转产生过多的热量,常采用间歇处理和降低温度的方法进行。
(4)压榨法,是一种温和、彻底破碎细胞的方法。
即用高压迫使几十毫升细胞悬液通过一个小于细胞直径的小孔,致使细胞被挤压破碎。
2溶胀和自溶,
(1)溶胀,概念:
在低渗溶液,如低浓度的稀盐溶液中,由于存在渗透压差,溶剂分子将大量进入细胞,致使细胞膜膨胀破裂的现象称为溶胀。
步骤:
将细胞置低温下冰冻一定时间,然后取出至室温下(或40左右)迅速融解。
如此反复冻融多次,细胞可在形成冰粒和增高胞液盐浓度的同时,发生溶胀,以致破碎。
(2)自溶,概念:
细胞结构在本身所具有的各种水解酶作用下,发生溶解的现象称为自溶。
注意:
应用此法时要特别小心操作,因为水解酶不仅可破坏细胞壁、细胞膜,同时也可使某些有效成分在自溶时分解。
3化学处理,用脂溶性的溶剂(如丙酮、氯仿、甲苯等)或表面活性剂(如十二烷基硫酸钠)处理细胞时,可使细胞壁和细胞膜的结构部分溶解,导致整个细胞破碎。
4生物酶降解,生物酶有降解细菌细胞壁的功能。
在用此法处理细菌细胞时,先是细胞壁消融,随之而来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂,最后导致细胞完全破碎。
二、核酸提取的基本方法,1去垢剂(SDS)法,SDS(sodiumdodecylsulfate):
即十二烷基硫酸钠,是一种有效的细胞消溶剂、核酸酶抑制和蛋白变性剂,也是一种去污剂。
去垢剂法由Marmur于1961年创建,最早用于从细菌中提取DNA。
原理:
抽提核酸时利用SDS的非极性基团破坏蛋白质分子的次级键,使蛋白质变性,达到使核蛋白解联、变性和去除蛋白的目的。
变性后的蛋白仍留在溶液中不生成沉淀。
为了将同时存在于溶液中的核酸和蛋白分开,可在室温条件下加入1/2体积饱和硫酸铵使蛋白沉淀。
特点:
此法得率高,对核酸影响小,但制品中仍残留微量蛋白。
SDS在低温或有两价金属离子或钾离子存在时将形成沉淀,使用时应该注意。
2酚抽提法,酚也是一种蛋白表面变性剂。
球状蛋白在水溶液中其亲水性氨基酸残基的侧链位于外侧,疏水性氨基酸的侧链位于内侧,酚法于1957年为Kirby建立,最早用于DNA的抽提。
酚的作用机制:
可能是插入蛋白结构的内部,破坏各种氨基酸残基侧链基团问的次级键,使蛋白的结构翻转,即原来存在于内侧的疏水性氨基酸残基侧链转向外侧,而外侧的亲水性氨基酸残基侧链则转向内侧,导致蛋白质变性。
酚还能使核酸酶失活。
3CTAB法,CTAB(eetyltriethylammoniumbromide):
即十六烷基三乙基溴化铵,是一种去污剂。
此法相对较为简单,特别适用于植物材料,已成功地从一系列的单子叶和双子叶植物中提取出总DNA。
此法提取植物DNA时,可采用氯仿/异戊醇反复抽提去蛋白,通过高盐缓冲液的选择性沉淀去除多糖类杂质.,机制:
可溶解细胞膜,能与核酸形成复合物,该复合物在高盐溶液中(0.7mol/LNaCl)是可溶的,当溶液盐浓度降低到一定程度(0.3mol/INaCl)时,却会从溶液中沉淀出来,因此通过离心便可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开。
然后将此复合物沉淀溶解于高盐溶液,再加入乙醇使核酸沉淀,因CTAB溶解于乙醇,离心后即可得DNA沉淀。
优点,既适用于新鲜的植物,也可用于经脱水处理的材料,能够很好地去除多糖类杂质,对于含糖较高的植物材料可优先采用。
另一优点是提取的前期能同时得到高含量的DNA及RNA,如果后续实验对两者都有需要,则可分别进行纯化。
如只需要DNA,则加入RNase除去RNA;
若只需RNA,则加入DNase去掉DNA。
该法制得的DNA虽然纯度不很高,但仍能满足限制性内切核酸酶分析、PCR反应以及DNA重组克隆的要求。
4浓盐法,机制:
高浓度的盐可以破坏核酸和蛋白质之间的次级键,使核蛋白解联。
一般先用lmol/LNaCl或lmol/LNaClO4进行抽提,再加入氯仿/异戊醇离心去蛋白,最后用甲醇或异丙醇使核酸沉淀。
其中的氯仿可以使蛋白表面变性,帮助去蛋白。
异戊醇可以消泡以维持离心层的稳定。
该法对核酸的损伤较小,但由于去除蛋白不够彻底,常与其他方法结合使用。
5高通量的RNA分离技术,
(1)微量移液法(micropipeting),由Karrwer等人于1995年建立的一种方法。
此法借助毛细管或微量移液管直接提取细胞的内含物,进行RNA抽提。
操作过程,用激光移液管拉伸器(1aserpipettepuller)将毛细石英管拉成孔径为l0um的微量移液管,将其顶端弯曲23,以便穿透细胞壁。
微量移液管被安装在连接了气泵的微操纵器上,通过负压将大约1ulRNA提取液(100mmol/LTris-HCl,pH8.0;
500mmol/LLiCl;
10mmol/LEDTA;
1%SDS;
5mmol/LDTT)压入微量移液管。
装有提取液的微量移液管被降低到叶片表面,微量移液管顶点的那一小滴提取液在275kPa气压作用下被排出.,一旦微量移液管尖端被清空后,立即供给1.3kPa的负压,这时微量移液管就插入到目的细胞内。
一经插入,细胞内含物就被吸进微量移液管。
可以明显地看到,细胞立刻瘪了下去。
然后,微量移液管离开细胞,内含物被注入到10u1RNA提取液中,用69kPa和1.3kPa正、负压反复作用,以便将微量移液管顶端漂洗干净。
此法可直接从叶片的表皮细胞、防御细胞以及叶肉细胞中提取mRNA,而叶片却不受到损伤。
随后,再加入10u1RNA提取液,其中含有50ug连接了oligo(dT)-的磁力珠,混合均匀,22下静置l0min。
再用2ou11倍的反转录缓冲液(50mmol/Ltris-HCl,pH8.3;
75mmol/LKCl;
3mmol/LMgCl2;
10mmol/LDTT)洗两次,即可将结合在磁力珠上的mRNA洗脱下来。
(2)激光微解剖法(1asercapturemicrodissection,LCM),该法是将一块被冷冻或被石蜡包埋的组织切成薄片,然后所需要的部位被激光解剖下来,再利用黏膜通过静电作用迅速地将其吸附,并立即转移到RNA提取液中。
优点:
它减少了对组织的处理,可避免RNA表达轮廓(profile)的改变;
因为某些实验,特别是对时钟基因的研究,时间因素至关重要,采用此法可减少采样时间对实验的影响。
(3)原生质体分离法(protoplastingandsorting),特点:
是一种快速而准确地从分生组织的细胞中提取RNA的技术,已应用于拟南芥根系全球性基因表达图谱的制作。
原理:
首先需将荧光蛋白基因转入受体细胞,用酶处理破壁后,通过紫外照射使那些表达绿色荧光蛋白的细胞产生荧光,再通过荧光感受分离仪(flurescence-activatedcellsorter,简称FACS)将其从特定组织或区域中分离出来,进而制得RNA,三、核酸的浓缩和沉淀,1核酸的浓缩,若溶液中DNA含量低,而且容积较大时,常需进行浓缩,以便进一步沉淀和纯化。
常用的核酸浓缩方法是真空干燥法。
此法比较温和,特别适用于小量样品的浓缩。
此外,还有以下两种方法:
(1)丁醇抽提浓缩法,正丁醇或仲丁醇能吸收大量水,而DNA不溶于丁醇。
利用该特性,向DNA溶液中反复加入等体积正丁醇或仲丁醇,振荡混合后离心,去除有机相,可显著减少DNA溶液的体积并浓缩DNA。
(2)聚乙二醇(PEG),水沉淀法聚乙二醇同样具有吸水能力。
将DNA溶液装入透析袋,包埋在聚乙二醇(分子量600012000为宜)中,聚乙二醇吸水液化,同时DNA溶液体积减小、可通过更换PEG干粉达到浓缩的
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 第九 核酸 分离 提纯 精品 文档