分子生物学研究法下PPT格式课件下载.ppt
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5.4.1SNP概述单倍型:
是指位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点。
SNP分类:
cSNP同义cSNP非同义cSNPpSNPrSNP基因调控区基因调控区SNP基因间随机非编码区基因间随机非编码区SNP基因编码区基因编码区SNP5.4.2SNPs经典检测方法一大类是以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法,如:
1.限制性片段长度多态性法PCR-RFLP;
2.单链构象多态性法PCR-SSCP;
3.变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgeleletrophoresisDGGE);
4.等位基因特异性PCR(allelespecificPCR,ASPCR)等等PCR-RFLP方法原理:
原理:
利用限制性内切酶的酶切位点的特异性,用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片断,如果存在SNP位点,酶切片断的长度和数量则会出现差异,根据电泳的结果就可以判断是否SNP位点。
特点:
该技术应用的前提是SNP的位点必须含有该限制内切酶的识别位点,它是SNP筛查中最经典的方法之一.PCR-RFLP原理图单链构象多态性(SSCP)原理:
单链DNA在中性条件下会形成二级结构,不同的二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。
这种二级结构依赖于碱基的组成,单个碱基的改变也会影响其构象,最终会导致在凝胶上迁移速度的改变。
在非变性聚丙烯酰胺凝胶上,短的单链DNA和RNA分子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象,这样在凝胶上的迁移速率不同,出现不同的条带,检测SNP。
由于该方法简单快速,因而被广泛运用于未知基因突变的检测。
这种方法的弊端在于不能确定突变类型和具体位置。
变性梯度凝胶电泳(DGGE)原理:
是利用长度相同的双链DNA片段解链温度不同的原理,通过梯度变性胶将DNA片段分开的电泳技术。
电泳开始时,DNA在胶中的迁移速率仅与分子大小有关,而一旦DNA泳动到某一点时,即到达该DNA变性浓度位置时,使得DNA双链开始分开,从而大大降低了迁移速率。
当迁移阻力与电场力平衡时,DNA片段在凝胶中基本停止迁移。
由于不同的DNA片段的碱基组成有差异,使得其变性条件产生差异,从而在凝胶上形成不同的条带。
等位基因特异PCR(AS-PCR)原理:
根据SNP位点设计特异引物,其中一条链(特异链)的3末端与SNP位点的碱基互补(或相同),另一条链(普通链)按常规方法进行设计,因此,AS-PCR技术是一种基于SNP的PCR标记。
因为特异引物在一种基因型中有扩增产物,在另一种基因型中没有扩增产物,用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增产物的有无,从而确定基因型的SNP。
5.4.3SNPs高通量的检测方法另一大类检测方法是近些年来发展起来的,高通量、自动化程度较高的检测SNPs的方法,较为常用的有:
1.DNA测序法;
2.DNA芯片检测;
3.飞行质谱仪(MALDI-TOFMS)检测;
4.变性高效液相色谱(DHPLC)法等等DNA测序法直接测序是最容易实施的SNP检测方法。
原理原理:
通过对不同个体同一基因或基因片段进行测序和序列比较,以确定所研究的碱基是否变异,其检出率可达100%。
可以得到SNP的类型及其准确位置等SNP分型所需要的重要参数。
基因芯片技术(Genechips)原理原理:
是将具有特定碱基序列的探针固定在特殊的载体上,待测基因经提取、荧光标记后,与固定好的探针进行杂交,最后根据荧光的强度和种类测出待测序列的碱基类别。
基因芯片具有信息量大和自动化程度高的突出优点。
但它也存在若干问题:
芯片造价高昂,所需设备贵重,不利于普及应用。
MALDI-TOF原理:
是将变性的单链PCR产物通过与硅芯片上的化合物共价结合后,在硅芯片上进行引物的退火,延伸反应,突变部位配对的碱基与正常配对的碱基不相同。
根据引物在延伸反应中所结合的不同碱基的不同质量在质谱仪上显示不同峰而检测SNP。
变性高效液相色谱(DHPLC)原理:
目标核酸片段PCR扩增,部分加热变性后,含有突变碱基的DNA序列由于错配碱基与正常碱基不能配对而形成异源双链。
因包含错配碱基的杂合异源双链区比完全配对的同源配对区和固定相的亲和力弱,更易被从分离柱上洗脱下来,从而达到分离的目的。
SNPs的有无最终表现为色谱峰的峰形或数目差异,依据此现象可很容易从色谱图中判断出突变的碱基。
特特点点:
使用高效液相色谱检测SNPs具有检测效率高,便于自动化的优点,对未知SNPs的准确率可达95%以上。
但DHPLC检测对所用试剂和环境要求较高,容易产生误差,不能检测出纯合突变。
SNP及突变研究的最新工具高分辨率熔解曲线(HighResolutionMelting)HighResolutionDNAMelting(HRM)是基于有序列变化的是基于有序列变化的Amplicon之间微弱的之间微弱的Tm值差异,通过值差异,通过DNA片段熔解曲线的差异进行突变检测,比如:
片段熔解曲线的差异进行突变检测,比如:
5.4.4SNP的应用1.人类基因单体型图的绘制人类基因单体型图的绘制2.SNP与疾病易感基因的相关性分析与疾病易感基因的相关性分析3.指导用药与药物设计指导用药与药物设计GeneSNPbybioinformatics真核生物基因组庞大,含有大量重复序列。
真核生物基因组庞大,含有大量重复序列。
无论是电泳分离技术还是通过杂交的方法,无论是电泳分离技术还是通过杂交的方法,都难以直接分离到目的基因片段。
都难以直接分离到目的基因片段。
尽管高等生物一般具有尽管高等生物一般具有3-5万种左右不同的万种左右不同的基因,在单个细胞或组织的特定时间段中,基因,在单个细胞或组织的特定时间段中,仅有仅有15-20%左右的基因得以表达。
左右的基因得以表达。
5.5基因克隆技术cDNA克隆的基本过程是通过一系列酶催作克隆的基本过程是通过一系列酶催作用,使总用,使总poly(A)mRNA转变成双链转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上,转群体并插入到适当的载体分子上,转化大肠杆菌寄主菌株细胞,构成包含所有化大肠杆菌寄主菌株细胞,构成包含所有基因编码序列的基因编码序列的cDNA基因文库。
基因文库。
基因工程基本步骤目的DNA制备;
载体DNA选择DNA体外重组技术(DNA酶切实验、连接实验)重组DNA的转化(转染)试验重组克隆的筛选与鉴定(重组体的表型筛选,(重组体的表型筛选,指纹图谱法,PCR方法,探针杂交法)目的基因表达产物的筛选与鉴定(遗传互补法,免疫化学法遗传互补法,免疫化学法Western印杂交法,微细胞法微细胞法(microcellmethod)基因工程流程示意图基因工程流程示意图5.5.1RACE(cDNA末端快速扩增末端快速扩增)是用于从已知是用于从已知cDNA片段扩增全长基因的方片段扩增全长基因的方法,它根据已知序列设计基因片段内部特法,它根据已知序列设计基因片段内部特异引物,由该片段向外侧进行异引物,由该片段向外侧进行PCR扩增得扩增得到目的序列。
用于扩增到目的序列。
用于扩增5端的方法称为端的方法称为5RACE,用于扩增,用于扩增3端的称为端的称为3RACE。
5RACE1.在反转录酶的作用下,以已在反转录酶的作用下,以已知基因片段内部。
特异性引物知基因片段内部。
特异性引物启始启始cDNA第一条链的合成第一条链的合成2.RNase混合物降解模板混合物降解模板mRNA,纯化,纯化cDNA第一条链。
第一条链。
3.用末端转移酶在用末端转移酶在cDNA链链3端端加入连续的加入连续的dCTP4.以连有以连有oligo(dG)的锚定引的锚定引物和基因片段内部特异的物和基因片段内部特异的nested引物进行引物进行PCR扩增,以扩增,以期得到目的片段,并可用期得到目的片段,并可用nestPCR进行检测。
进行检测。
3RACE3RACE1.1.在反转录酶的作用下,以连在反转录酶的作用下,以连在反转录酶的作用下,以连在反转录酶的作用下,以连有可以和有可以和有可以和有可以和polyApolyA配对的配对的配对的配对的oligo(dToligo(dT)的锚定引物启始的锚定引物启始的锚定引物启始的锚定引物启始cDNAcDNA第一条链的合成。
第一条链的合成。
2.2.用用用用RNaseHRNaseH降解模板降解模板降解模板降解模板mRNAmRNA。
3.3.用通用锚定引物和基因片段用通用锚定引物和基因片段用通用锚定引物和基因片段用通用锚定引物和基因片段内部特异引物进行内部特异引物进行内部特异引物进行内部特异引物进行PCRPCR扩增扩增扩增扩增得到目的得到目的得到目的得到目的33片段,并可用片段,并可用片段,并可用片段,并可用nestnestPCRPCR的方法继续进行检测和的方法继续进行检测和的方法继续进行检测和的方法继续进行检测和扩增。
扩增。
5.5.2应用应用cDNA差示分析法克隆基因差示分析法克隆基因该法通过降低该法通过降低cDNA群体复杂性和更换群体复杂性和更换cDNA两端接头等两端接头等方法,特异性扩增目的基因片段。
因为方法,特异性扩增目的基因片段。
因为Tester和和Driver在在接受差示分析前均经一个接受差示分析前均经一个4碱基切割酶处理,形成平均长碱基切割酶处理,形成平均长度度256bp的代表群,保证绝大部分遗传信息能被扩增。
的代表群,保证绝大部分遗传信息能被扩增。
每次每次T减减D反应后仅设置反应后仅设置72复性与延伸,复性与延伸,94变性这两变性这两个参数共个参数共20个个PCR循环,循环,PCR产物的特异性和所得探针产物的特异性和所得探针的纯度非常高。
的纯度非常高。
RDA流程图。
5.5.3TA载体载体TopoTA载体载体InvitrogenProprietary&
Confidential38Differentwaystogeneratetheentryclone2.TOPOCloningTOPOBPClonase1.BPCloningPCRProduct+TOPO-ActivatedEntryVectorL1L2Gene+attBPCRProductB2GeneB1DonorVectorP2ccdBP1EntryCloneL2GeneL1+digestedDNAFragmentGeneB1digestedEntryVectorL2L14.Pre-madeentryclone5.Custom-madeentrycloneLigase3.Restriction/LigaseCloningORFCollectionL2ORFL1MultiSiteGateway-ExtendingtheapplicationsYourApplicationGene1Gene2Gene3Gene4YourApplicationGeneProteinLocalizationGeneGeneProteinPurificationGeneRNAiGeneCell-FreeGeneProteininteractionGeneGeneEntryClonePCRGenesynthesisORFco
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- 分子生物学 研究