第五章分子生物学技术上PPT推荐.ppt
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一、20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质,解决了遗传的物质基础问题。
二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题。
三、50年代末至60年代,相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码,阐明了遗传信息的流动与表达机制。
重组DNA技术发展史上的三大里程碑:
u半保留复制半保留复制u复制的半不连续性复制的半不连续性半保留复制动画半保留复制动画重组DNA技术发展史上的三大里程碑:
CrickCrick于于19541954年所提出的遗传信息传递规律(即中心法则)。
年所提出的遗传信息传递规律(即中心法则)。
中心法则动画中心法则动画5.15.1基因操作的基本工具基因操作的基本工具
(一)限制性核酸内切酶
(一)限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。
第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的,它能特异性识别GAATTC序列,将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有5粘性末端的小片段。
目前NEB公司售卖234种ResRE随机切割DNA分子(假定4种碱基在DNA中均匀分布)的概率由该酶所识别的碱基数目按照4n来计算,如一个6碱基切割酶平均每4096bpDNA有一个酶切位点,而一个4碱基切割酶平均每256bpDNA就有一个酶切位点。
图5-1几种主要几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端内切酶所识别的序列及其酶切末端。
WernerArber,HamiltonSmithandDanielNathanswereawardedthe1978NobelPrizefortheirworkonREs.重组重组DNADNA实验中常见的主要工具酶实验中常见的主要工具酶仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组,还不能满足基因工程的要求,只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上,才能在寄主细胞中进行繁殖。
具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体分子克隆的载体(vectorvector)。
)。
病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。
获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA分子后,还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中,才能保证重组DNA分子的增殖(图5-3)。
(二)基因克隆的载体一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性:
(1)分子量小、具有自我复制能力;
(2)具有多种常用的限制性内切酶的单切点;
(3)能插入较大的外源DNA片段;
(4)具有两个以上的遗传标记物,便于鉴定和筛选。
(5)对宿主细胞无害。
大肠杆菌质粒载体大肠杆菌质粒载体:
1、pSC101质粒载体质粒载体第一个真核基因克隆载体。
长9.09kb,带有四环素抗性基因(tetr)及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的单酶切位点,在HindIII、BamHI和SalI等3个位点插入外源基因,会导致tetr失活。
缺点:
它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒,平均每个寄主细胞仅有12个拷贝,从带有该质粒的寄主细胞中提取pSC101DNA,产量很低。
2、ColE1质粒载体质粒载体质粒在细胞内的复制一般有两种类型:
1.严紧控制型(Stringentcontrol)只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。
2.松弛控制型(Relaxedcontrol)在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如ColE1质粒。
一般情况下,当培养基中氨基酸被耗尽,或是在细胞培养物中加入氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制均受到抑制,细胞的生长也随之停止。
松弛型质粒DNA继续复制数小时,使每个寄主细胞中ColE1质粒的拷贝数达到10003000个,占细胞总DNA的50%左右。
3、pBR322质粒载体质粒载体由三个不同来源的部分组成的:
第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因(AmpR)第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因(tetr)第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点(ori)。
优点:
具有较小的分子量(4363bp),易于纯化。
即使携带了6-8kb的外源DNA片段,操作仍较便利。
有两种抗生素抗性基因作为转化子的选择标记。
有较高的拷贝数,经过氯霉素扩增,每个细胞可累积10003000个拷贝,便于制备重组体DNA。
44、pUCpUC质粒载体:
质粒载体:
来自pBR322质粒的复制起点(ori)以及氨苄青霉素抗性基因(ampr)大肠杆菌-半乳糖酶基因(lacZ)启动子及编码-肽链的DNA序列。
特称为lacZ基因LacZ编码-半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸的-肽,IPTG(异丙基-D-硫代半乳糖苷)诱导该基因表达,所合成的-半乳糖苷酶-肽与宿主细胞编码的缺陷型-半乳糖苷酶互补,产生有活性的-半乳糖苷酶,水解培养基中的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷),生成蓝色的溴氯吲哚。
位于lacZ基因5-端的一段多克隆位点(MCS)外源基因插入破坏lacZ基因功能,含X-gal培养基中非重组DNA分子转化菌落呈蓝色,含有重组DNA分子的菌落为白色。
1.更小的分子量和更高的拷贝数在pBR322基础上构建pUC质粒载体时,仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点,其分子小了许多,pUC8为2750bp,pUC18为2686bp。
由于缺失rop基因,pUC质粒不经氯霉素扩增时,平均每个细胞即可达500700个拷贝。
2.具有多克隆位点MCS区段可以把具两种不同粘性末端(如EcoRI和BamHI)的外源DNA片段直接克隆到pUC8质粒载体上。
3.易于重组体转化子的筛选pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因,所编码的-肽链可参与-互补作用。
因此,可用X-gal显色法实现对重组体转化子的鉴定。
含X-gal培养基中非重组体转化子转化菌落呈蓝色,含有重组DNA分子的菌落为白色。
5、pGEM-3Z质粒:
质粒:
长度为2743bp,编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ基因。
含有两个噬菌体启动子(T7和SP6),为RNA聚合酶的附着提供了特异性识别位点。
加入T7或SP6RNA聚合酶,所克隆的外源基因便会转录出相应的mRNA。
66、穿梭质粒载体(、穿梭质粒载体(shuttleplasmidvector)由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号,可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。
这类质粒载体可保证外源DNA序列在不同物种(原核和真核)的细胞间得到扩增,用途广泛。
7、pBluescriptpBluescript噬菌粒载体:
噬菌粒载体:
pBluescript是一类从pUC载体派生而来的噬菌粒载体,简称为pBS(+/-),如今则更多地叫作pBluescriptKS(+/-)或pBluescriptSK(+/-)。
SK表示多克隆位点区的取向,即lacZ基因是按照SacIKpnI的方向转录;
(+/-)表示单链噬菌体f1复制起点的两种相反的取向。
f1(+)起点表示当pBluescript噬菌粒载体和辅助噬菌体共感染寄主细胞时,能够回收到lacZ基因的有意义链DNA;
而f1(-)起点则表示当pBluesript噬菌粒载体与辅助噬菌体共感染寄主细胞时,可回收到lacZ基因的无意义链DNA。
1.在多克隆位点区(MCS)的两侧,存在一对T3和T7噬菌体的启动子,用以定向指导插入在多克隆位点上的外源基因的转录活动;
2.具有单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点,保证pBluescript噬菌粒载体在有或无辅助噬菌体共感染的不同情况下,按照不同的复制形式分别合成出单链或双链DNA;
3.编码有一个氨苄青霉素抗性基因,作为转化子克隆的选择标记;
4.含有一个lacZ基因,可以按照X-gal-IPTG组织化学显色法筛选噬菌粒载体的重组子。
特点:
图5-2DNA连接酶能把不同的连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体片段连接成一个整体12PvuII仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶和DNA连接酶连接酶进行DNA的切割的切割和重组,还不能满足基因工程的要和重组,还不能满足基因工程的要求,只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上,才能在寄主细胞中进行繁殖。
具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体分子就是分子克隆的载体(vector)。
病病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。
获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA分子后,还必须通过一个被称为细菌转化细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中,才能保证重组DNA分子的增殖(图5-3)。
图5-3重组重组DNA操作过程示意图操作过程示意图Plasmid_CloningPlasmid_Cloning动画动画5.2DNA操作技术操作技术5.2.15.2.1核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳自从琼脂糖(agarose)和聚丙烯酰胺(polyacrylamide)凝胶被引入核酸研究以来,按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术,已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。
一种分子被放置到电场中,它就会以一定的速度移向适当的电极。
我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度,叫做电泳的迁移率,它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比,与片段大小成反比。
生理条件下,核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态,所以,DNA和RNA又被称为多聚阴离子(polyanions),在电场中向正电极的方向迁移。
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.250kb之间。
聚丙
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