木叶抑菌活性成分提取分离与检测资料下载.pdf
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因此,本文建立的方法是分析吴茱萸水溶性成分较好的方法。
5.2吴茱萸为临床常用中药,具有许多药理作用,国内外学者对其进行了广泛深入的研究。
但这些研究多限于对其脂溶性成分及其药理作用的研究,对其水溶性成分研究得很少。
我们实验过程中发现吴茱萸水提液中含有大量的绿原酸,并建立了用HPLC法分析测定的方法。
5.3研究结果表明,不同批次的吴茱萸中绿原酸的含量相差较大,最高的为1.165,最低的为0.402。
说明吴茱萸中绿原酸的含量受产地,环境,气候的影响较大。
参考文献:
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696.木叶抑菌活性成分提取分离与检测卢成英,徐东翔,杜勇,黄早成,钟维(湖南省林产化工工程重点实验室,吉首大学张家界校区,湖南张家界427000)收稿日期:
2004212220基金项目:
湖南省教育厅自然科学基金项目(编号02C020)作者简介:
卢成英(1952),女,土家族,教授,研究方向:
医学微生物学,电话:
074428201399,E2mail:
。
关键词:
木叶;
抑菌活性;
提取;
柱层析中图分类号:
R284.2文献标识码:
B文章编号:
100121528(2006)0120132202木Loropetalumchinese(R.Br.)Oliv又名坚漆、柴、刀脂木等,为金缕梅科(Hamamelidaceae)落叶灌木或小乔木,我国湘西地区藏量十分丰富。
有文献报道木含鞣质、脂肪酸、槲皮素、异槲皮苷、黄酮类、酚性物质及有机酸,具有止血、止泻、生肌、消炎、镇痛等作用,可用其治疗烧伤、子宫出血、外伤出血、腹痛腹泻等病症1,2湘西民间常用木鲜叶煎服治腹泻,有奇效。
本研究通过抑菌实验确定木抑菌活性及其抑菌活性成分的最佳提取、分离纯化条件3,为木叶抑菌活性物质的开发利用提供参考。
1材料与方法1.1材料木叶本实验所用木叶2004年4月采于校园后山,并经徐东翔教授鉴定,晾干、粉碎,备用。
实验菌种金黄色葡萄球菌(Staphylococlusaureus、大肠杆菌(Escheichiacoli)、痢疾杆菌(Shigelladysenteroae),购自湖南疾病预防控制中心,我室冷冻保藏。
试剂实验试剂均为国产分析纯试剂;
对照品为黄连素(本室制备);
大孔吸附树脂、离子交换树脂、硅胶树脂、聚酰胺树脂购于西安蓝深公司。
培养基牛肉膏蛋白胨培养基、沙氏培养基制备无菌试管斜面、平板备用。
仪器旋转蒸发仪(RE540yamato)、pH计(HM22052312006年1月第28卷第1期中成药ChineseTraditionalPatentMedicineJanuary2006Vol.28No.1TOA)、冷冻干燥机(FD21)、培养箱(PW/102002)、超净工作台(CCV21311)、紫外分光光度计(UV2160A)、高压蒸汽灭菌器(SM252)、万分之一天平(AEG2220)。
1.2木叶抑菌活性物的提取3用乙醇作提取溶剂,L9(34)正交表设计正交实验。
木叶粉加入定量溶剂回流提取,滤液减压缩至含生药浓度1g/mL),检测各提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌生长的抑制活性,经方差分析得最佳提取条件。
表1木叶抑菌活性物提取因素水平表水平因素A乙醇浓度()B提取温度()C提取时间(h)1304512606023907531.3抑菌实验46提取液0.5mL置无菌小瓶,加入R1R2,即因素C(提取时间)的影响最大,A(溶剂浓度)、B(提取温度)次之,最佳条件为A2B1C2,即60乙醇、45、2h。
方差分析结果表明,因素A、B、C影响无显著性差异,均方离差可见因素影响的主次顺序仍为C、A、B,结果提示在木叶抑菌成分提取时乙醇浓度、提取时间与温度均应适当控制。
表2正交试验结果分析表试验号因素ABCS.aE.cS.dTt1111-0212223-24473133-1717421228312685522326-266231-2323731329-29832124-249332-0M1j6411447M2j13497132M3j534085m1j21.33338.00015.667m2j44.66732.33344.000m3j17.66713.33324.000Rj27.00024.66728.333注:
S.a金黄色葡萄球菌、E.c大肠杆菌、S.d痢疾杆菌、“-”无明显抑菌圈。
表3正交试验方差分析表变异来源离差平方和自由度均方F值临界值显著性A1286.8892643.4451.285F0.1(2,2)=9.000-B1001.5562500.7781.000F0.05(2,2)=19.000-C1272.2222636.1111.270-误差1001.562总变异4562.21782.2木叶高抑菌活性提取物柱层析洗脱液抑菌活性检测结果大孔树脂柱层析水洗脱液对金葡、痢疾杆菌生长的抑制作用最佳,30、60乙醇洗脱液抑菌效果明显下降,90乙醇洗脱液无抑菌作用,且所有洗脱液对大肠杆菌无抑制作用;
聚酰胺树脂柱层析4种洗脱液对3种菌均有抑制作用,以水洗脱液抑菌效果最好,30、60乙醇洗脱液抑菌效果较差,90乙醇洗脱液的抑菌效果稍好;
离子交换树脂柱层析水洗脱液对金葡、痢疾杆菌生长的抑制作用较好,乙醇洗脱液无抑菌作用,同样所有洗脱液对大肠杆菌无抑制作用;
硅胶树脂柱水洗脱液和90乙醇洗脱液的抑菌效果大致相当,60乙醇洗脱液抑菌作用很弱,30乙醇洗脱液则无抑菌作用,结果见表4。
表4不同树脂柱不同洗脱物的抑菌效果单位:
mm菌种大孔吸附树脂洗脱物水30乙醇60乙醇90乙醇离子交换树脂洗脱物水30乙醇60乙醇90乙醇聚酰胺树脂洗脱物水30乙醇60乙醇90乙醇硅胶树脂洗脱物水30乙醇60乙醇90乙醇金黄色葡萄球菌291111-15-25981216-813大肠杆菌-24891313-911痢疾杆菌3311-12-26891614-815注:
“-”无明显抑菌圈。
2.3木叶抑菌活性成分的化学检识3取木叶提取物过聚酰胺柱的水洗脱液和90乙醇洗3312006年1月第28卷第1期中成药ChineseTraditionalPatentMedicineJanuary2006Vol.28No.1脱液,采用化学试剂对其所含化合物初步定性,二者均未检出苯醌类衍生物和蛋白质;
水洗脱液所含香豆素在90乙醇洗脱液中未检测出;
90乙醇洗脱液所含皂苷、黄酮类则未从水洗脱液中检到;
90乙醇洗脱液中生物碱、酚类和鞣质类含量较高。
结合水洗脱液抑菌活性明显高于90乙醇洗脱液的试验结果分析木叶多种化合物具抑菌活性,其中香豆素可能为高抑菌活性物质,见表5。
表5木叶抑菌成分化学检识结果检识类型木叶提取物聚酰胺树脂洗脱物水洗脱液90乙醇洗脱液香豆素类微蓝黑色(+)无色(-)皂苷无色(-)兰紫色(+)酚类淡黄色(+)黄色(+)鞣质沉淀不明显(+)沉淀较明显(+)有机酸pH值为6(+)pH值为6(+)苯醌类衍生物无色(-)无色(-)黄酮类无色/无色(-)淡蓝色/兰紫色(+)生物碱浅黄色(+)深黄色(+)蛋白质无沉淀(-)无沉淀(-)3结语与讨论以乙醇作溶剂对木叶抑菌活性成分提取条件进行研究,发现提取温度和溶剂浓度对提取物的抑菌活性影响显著,提示在木叶抑菌成分提取时应注意控制乙醇浓度和提取温度。
正交实验得到最佳提取条件为60乙醇、60、2h,该条件下的提取物对细菌生长的抑制活性最高。
抑菌活性成分柱层析分离结果表明:
聚酰胺树脂对木叶抑菌活性物吸附及解吸作用较佳,其以水洗脱液的抑菌效果较好,对三种菌均有很强的抑制作用;
大孔吸际树脂柱层析中水洗脱液对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌生长的抑制作用最强,但对大肠杆菌无抑制作用;
硅胶、离子交换树脂柱层析几种洗脱液抑菌效果相对较差,提示木叶高抑菌活性集中在大孔吸附树脂和聚酰胺树脂柱的水洗脱部位,乙醇洗脱部位的抑菌活性很弱,其是否与水洗脱部位为同类物质有待研究。
木叶最佳条件提取物过聚酰胺柱的水洗脱液和90乙醇洗脱液的化学定性检识表明,水洗脱液所含仅香豆素类在90乙醇洗脱液中未检测出,提示香豆素类可能系木叶的高抑菌活性物,据国内外文献报道香豆素类存在于多种植物中,具有抗炎镇痛、抗氧化、抗癌、抗菌抗病毒、抗心律失常、抗血栓形成、抗过敏性疾病等多种功能79,对木叶中香豆素类化学组分与功能的研究尚待深入。
该试验还提示90乙醇洗脱液中的生物碱、酚类、鞣质、皂苷、黄酮类抑菌活性较低,其是否与提取方法、产地有关,拟深入研究。
本项研究亦显示不同提取时间、温度、溶剂浓度和不同柱层析所得提取物抗菌谱不同。
如75、1h的60乙醇提取物对痢疾杆菌的生长有很高的抑制效果:
45、3h、90乙醇提取物仅对金葡有高效:
60、2h的30乙醇提取物对金葡、痢疾杆菌有高效;
45、2h、60乙醇提取物对金葡、大肠、痢疾杆菌均有高效;
大孔树脂柱层析水洗脱液对金葡、痢疾杆菌生长的抑制作用最佳;
聚酰胺树脂柱层析的水洗脱液抑菌范围较广,对三种菌受试菌均有较好的抑制作用,提示可望采用不同提取时间、温度、溶剂浓度和不同柱层析获得不同抗菌谱的提取物以适于防病治病或食品防腐保鲜等各类需要。
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