蛋白质水解度的测定方法_精品文档资料下载.pdf
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DifferentmethodsareusedtodeterminatethedegreeofhydrolysisofproteinTheyarebasedonthreeessentiaIprinciples:
thedeterminationoftheamountofnitrogenreleasedduringprotelnhydrolysisthedeterminationofthefreec-aminogroupsandtitrationofthereleasedprotonsThispaperreviewsthosemethodsusedforthedeterminationofthehydrolysisdegreeKeywere:
protein:
degreeofhydrolysis:
determination中图分类号:
TS20121文献标识码:
A文章编号:
10020306(2005)070l7403蛋白质的水解是利用化学方法或酶法对天然蛋白质进行催化水解,水解后的蛋白质的一些功能性质发生了改变,如溶解性、乳化性质、发泡性质等】,因而可广泛的应用于食品工业,但在蛋白质的酶水解过程中蛋白质水解程度的控制是十分重要的参数,因为过度的水解会产生苦味肽,使蛋白质的风味改变,影响水解蛋白在食品中的应用。
水解度的测定方法很多,本文对这些方法进行了综述。
1水解度的定义蛋白质水解过程中被裂解的肽键数h(mmolg蛋白质)与给定蛋白质的总肽键数h。
(mmolg蛋白质)之比称为水解度(thedegreeofhydrolysis)。
DH=100h对于某一特定的蛋白质来讲是一个常数,它可以由组成该蛋白质的氨基酸的含量计算出,例如对于大豆蛋白,其h。
=78mmolg,所以只要测出水解后蛋白质被裂解的肽键数(h值)就可以计算出相应的DH值。
收稿日期:
20o50l一05作者简介:
檀志芬(1978一),女,硕士,从事乳品科学方面的研究。
基金项目:
“十五”国家重大科技专项(2002BA518A05)。
2水解度的测定方法测定蛋白质水解度的方法很多,它们都是依据以下三个原则:
E4定释放出的质子、可溶性蛋白质、游离氨基酸和SNTCA指数法。
21滴定水解中释放出的质子3-5(pHstat法)Adler-nisseel1979年用pHstat技术滴定水解过程中释放的质子而测定蛋白质的水解度。
蛋白质水解时总是伴随着质子的释放与吸收,这个反应发生在中性和微碱性介质中,如果反应时pH在氨基和羧基的pK值范围之外,而反应体系要维持pH恒定,则必须随时加入一定量的酸或碱。
pH一定时,加碱物质的量与水解肽链物质的量成正比关系,比例常数即为NH的解离常数仅。
记录不同时刻为维持反应体系pH恒定而消耗的碱液的毫升数,消耗的碱的量即可表征蛋白质水解的程度。
这种方法的优点是不变性,由于它的简单、快速和可重复性,通常被用于水解度的在线测定。
然而,通过这种方法获得的水解度需要通过其它方法(0PA或TNBS)来校正。
国外常用pHstat法,但由于该方法需要特别的仪器,普通实验室没有这一整套设备,国内很少采用这种方法进行水解度的测定。
袁斌等人嘲在pHstat法的基础上进行了变通,提出了一种简单易行的蛋白质水解度的测定方法,适应于不需要恒定pH的水解反应。
22游离氨基氦(自由a一氨基)蛋白质水解液中游离氨基的量会随着水解的进行而增加,因此水解液中游离氨基氮的含量也可以表征蛋白质水解的程度,常用的方法有三硝基苯磺酸法(TNBS)、甲醛滴定法、茚三酮法、OPA和荧光胺法等。
221三硝基苯磺酸法(TNBS)Adler-Nissenrl979年用三硝基苯磺酸法分析蛋白质水解物的水解度。
这种方法需要将样品在37反应lh,在室温冷却30min,接着测其在420nm处的吸光度值。
这种方法的不利之处是所需时间长,被苦味酸污染的试剂的空白值很高,降低了糖和氨基的相互作用,并且脯氨酸和羟脯氨酸之间缺少相互关系,而亮氨酸的s一氨基能够维普资讯http:
/和TNBS发生反应,改变测定结果,并且该法中所需的试剂在一般试验室不太常见,测定时间也较长。
222甲醛滴定法甲醛滴定法81是被广泛应用的一种方法,这个方法是基于甲醛与氨基酸反应,通过释放质子而降低一氨基的含量。
这个方法在实际中应用的最大不方便是确定理想的参数是困难的。
法国官方的方法是调整测试液的pH到70,接着用碱液滴定到酚酞的颜色改变(pH92);
美国官方的方法是调整测试液的pH到70,加入甲醛溶液,接着用碱性溶液滴定到90。
美国AoAC的方法似乎更合理,因为pH92(酚酞的变色范围)是甲醛反应的最佳pH平衡点。
甲醛滴定方法不同导致的结果是不同的。
特别是对于微弱的水解物。
通过这种方法测定的一氨基氮和总氮的比率可能会高于实际值。
22_3茚三酮法应用茚三酮方法来测定水解物的水解度是一种比较古老的方法l】21。
茚三酮和一氨基产生蓝色化合物。
这种方法是非常灵敏的,但是一般配制成的显色剂的稳定性较差(试剂对氧非常敏感),利用AOAC(1980版)”Ol中采用的显色剂,则可弥补这个不足,显色剂在冰箱中可以保存一周。
氨基的相互作用和空白具有很高的值,并且由于需要形成发色基团,分析时加热和冷却都需要很长时间。
郭兴风】对此方法进行了改进,利用待水解原料的完全水解液作为标准,消除了由于不同氨基酸与茚三酮结合产物的呈色度不同对测定结果造成的误差。
224oPA和荧光胺法I13-161OPA方法是一个快速而简单的测定蛋白质水解物水解度的方法,不需要很长时间的反应。
OPA测定水解度依靠水解的底物,在OPA和半胱氨酸之间发生一个弱且不稳定的反应,这种方法不适合用于半胱氨酸丰富的底物中,且脯氨酸和oPA不反应。
荧光方法lI有很高的灵敏性,反应产生的荧光不同影响其准确性。
氨基酸衍生物的低稳定性是这种方法的一个缺点。
23可溶性蛋白质随着水解的进行,蛋白质的长链逐渐被切断,溶解度增加,所以蛋白质水解液中可溶性蛋白质的含量在一定程度上也可以表征蛋白质水解的程度。
测定水解液中可溶性蛋白质的方法有凯氏定氮法、Folin一酚法、双缩脲法、紫外分光光度法、考马斯亮蓝G-250染色法等17181。
24SNTCA指数法SNTCA指数的定义是:
在特定条件下,三氯乙酸(TCA)水溶液中可溶性氮的物质的量分数。
常采用的是10的三氯乙酸,SNTCA指数反映了水解产物的溶解性能,同时也表明了水解产物物质量的分布,在一定程度上也是蛋白质水解程度的一种表征。
三氯乙酸(TCA)是一种蛋白质沉淀剂,它可以沉淀蛋
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