腺病毒提取与纯化_精品文档资料下载.pdf
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#342412外盖;
#342412中盖,BackmanCat:
#342883;
3、热封盖:
#342412热封盖,消毒;
4、其他物品:
MiniQ:
2L,消毒;
大烧杯(1L):
2个,消毒;
中号镊子,小号镊子:
1把中号和3把小号,消毒;
无菌注射器:
1ml、5ml、10ml,若干;
移液枪:
1把;
移液管:
2ml、10ml,若干;
废液缸:
1个;
无菌手套:
若干;
酒精、棉球;
Marker笔;
二、配液:
1、CsCl:
1.25g/ml:
9.04gCsCl+25mlPBS;
1.35g/ml:
12.8gCsCl+25mlPBS;
1.40g/ml:
15.5gCsCl+25mlPBS;
配好后过滤。
2、Viruslysisbuffer(pH7.4,50ml):
0.1%SDS0.05g10mMTrisbase0.0606g1mMEDTA0.0186g3、Dialysisbuffer(pH7.6,1.5L):
10mMTrisbase1.82g135mMNaCl11.83g1mMMgCl20.143g50%Glycerol750ml三、裂解扩增了腺病毒的293细胞:
1、从-80冰箱中取出以前扩增好的感染病毒的293细胞沉淀,解冻后用4mlPBS重悬,并转移到置于冰上的50ml离心管中;
2、用绳子拴好50ml离心管,置于液氮中30分钟;
3、取出后置于37水浴,摇至溶解,最大速度vortex一分钟,离心,5000rpm,10分钟;
4、转移上清到一个15ml的离心管中;
5、向下层沉淀中加入3ml的PBS,vortex混匀,再放于液氮中,再反复冻融两次,收集到的裂解液不超过9ml为宜;
6、把收集到的上清再离心5000rpm,10分钟(上清可暂时不取出,节省步骤),放于冰上。
四、正式实验:
预冷转头至4(BackmanSW41Ti及其离心管套,BackmanVTi90),热封仪充电。
1、UV消毒超净台,检查离心机配件:
转头SW41Ti及离心管套、离心管(Cat:
#331372)、离心管盖、离心管盖固定器、离心管架;
2、取出消毒好的离心管放在专用的离心管架上,用移液枪分别加2ml1.25g/mlCsCl,再在液体的底部缓慢加入1ml1.40g/mlCsCl;
注:
加入时将移液管伸入到离心管底部,将移液枪调到最低档缓慢加入,拔出移液枪时也要慢,加好后可以看到不同浓度的CsCl之间有明显的分层。
4、用移液枪将293裂解液缓慢加满,配平,按1-4,2-5,3-6的顺序;
管子要注意做好标记。
5、用酒精擦离心管套,把装好样本的离心管轻轻放入,放上消毒好的盖子,用离心管盖固定器拧紧;
离心时6个离心管套都要挂上,空的离心管套也需盖上盖子并拧紧,并挂在相应的挂钩上,注意平衡。
6、离心36000rpm,65min,4;
设置参数:
36000rpmenter65minenter4enterenter+star;
当真空750时,开始加速,约3min可达36000rpm。
7、离心时,检查下一步离心所需配件:
转头BackmanVTi90、离心管(Cat:
#342412)、离心管架、离心管外盖、离心管中盖(Cat:
#342883)、专用螺丝、专用扳手、专用离心管加夹;
8、离心完成后,小心取下离心管套,拧开盖子,用镊子取出离心管,找到要抽取的完整病毒带;
9、穿刺病毒带:
用5ml注射器从病毒带下方约1ml处缓慢向斜上放刺入,抽取病毒带,抽完后用手堵住离心管上口,再将枕头抽出;
穿刺处先用酒精消毒,刺入时旋转,不要太用力,针头平面向上,注意不要回打,抽到病毒约1ml。
FromAdEasyVectorSystem,Qbiogene,Inc.10、将抽出来的病毒转移到5.1ml离心管(Cat:
#342412)中,用1.35g/mlCsCl填满;
加CsCl时要轻轻弹一弹管壁以清除气泡,加CsCl时针头应在液面以下,以减少气泡的产生,若残留气泡容易导致离心时不平衡,离心管变形。
11、热封:
用消毒好的热封盖盖好离心管口,用热封仪(cat358314)加热,垂直轻轻下压到离心管颈部与管身交界处(约30sec),用冷却管套住热封管盖冷却;
12、将热封好的离心管放入到转头BackmanVTi90的对称位置,依次加入内盖、外盖,先用专用螺丝拧,再用专用扳手拧紧(用力到扳手指针达120即可);
13、离心:
转头BackmanVTi90,72300rpm,3h,4;
14、离心时,用75酒精消毒透析袋(剪成约5cm一个,不要太短)、夹子(要配套,一个带磁铁和一个不带磁铁),30min以上;
15、离心完后,用专用的离心管夹取出离心管后置于架子上;
16、第二次穿刺:
用10ml注射器针头导气,用1ml针管配5ml的针头穿刺病毒带(从病毒带下方约0.5cm处斜向上刺入),方法同前;
17、病毒带抽完后,抽出注射器,用针头套套住针头,标记好至于冰上;
18、透析:
取出浸泡于酒精中的透析袋,用牙签撑开透析袋,用消毒的milli-Q水冲净其上的酒精,再末端折叠一下,用夹子夹好。
将注射器中的液体注射入袋中,折叠上端,用夹子夹住,放于透析液中,隔1小时换液一次,反复3次。
最后一次的透析缓冲液保存至下次使用;
小心针头不要刺穿透析袋,夹子要做好标记。
19、收集病毒:
取出透析袋,用消毒milli-Q冲洗透析袋,用酒精棉球擦夹子内缘,在夹子内缘剪开透析袋,用200ul枪吸出液体转移到标记好的1.5mlEP管中-20保存;
20、测浓度:
1)、要用复温好的Viruslysisbuffe裂解腺病毒:
取6ul病毒加入54ulViruslysisbuffe,第三次透析液为空白对照,做好标记;
2)、水浴裂解:
56,10min;
3)、测dsDNA,OD260:
首先用空白对照调零,然后放入样本读数,若在0.1-1.0之间,则可以准确反映病毒浓度,否则需要稀释或加浓。
21、计算腺病毒浓度:
公式:
VP/ml=(OD260)稀释倍数1.11012
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