外周血细胞形态学检验及技巧报告文档格式.docx
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细胞发育的不同阶段有一定形态结构特点。
在造血系统疾病中,如果造血功能发生紊乱,就会从血细胞形态学的量变和质变中
反映出来。
血细胞形态学检查应包括外周血和骨髓两部分组成,必须平行进行检查。
因为,外
周血的血细胞改变往往反映骨髓病变的信息,才有利于诊断。
三.血细胞染色
(一)
细胞染色机制
:
染色是将细胞经染色剂的物理及化学作用,使
其清楚
显示
细胞各个组成部分,有利辨识细胞形态。
染色可分二个步骤:
1
.染料受相应物质吸附而附着于物质表面;
2
.固着作用,即染色粒子进入细胞内起化学反应(染料透过细胞膜的学说很多,尚
无定论),与相应的物质形成溶解度很低的盐固着于细胞内而显色。
染色剂皆有选择作用,
其染色不是将细胞全部一齐着色,而只是将其中一部分染色,多余的被冲洗掉。
目前多以
吸附学说(电力吸附、机械吸附、化学吸附)来解释。
一般染色方法由两种染色剂(酸性、碱性)组成,通常细胞核及浆
碱性粒体为
碱
性,细胞浆为酸性。
酸性染料可和带正电荷的(碱性)物质结合,这种物质称嗜酸性物质,
对酸性染料具有亲和力,因此嗜酸性粒细胞之颗粒本身为碱性物质;
碱性染料可和带负电
荷的(酸性)物质相结合,这种物质称嗜碱性物质,对碱性染色粒具有亲和力,因此嗜碱
性粒细胞之颗粒本身为酸性物质。
另一种蛋白质在
pH6.4
呈等电状态
,本身所含的正
/
负电荷相等,因此,既能和酸性染料又能和碱性染料结合,这种物质称中性物质,如中性
粒细胞之颗粒。
一般用
PBS
来稀释染液,使每次染色都在同一
pH
中进行,让细胞在恒定
条件下着色,使染色效果趋于一致。
作者:
198585912005-5-27
19:
51
回复此发言
--------------------------------------------------------------------------------
2
染液过碱时,蛋白质带有负电荷,对
次甲蓝有色
部分的正电荷吸附力强,因此染成
的细胞一般着色较蓝,说明
不适合。
染色与固定亦有极大关系,因细胞
经固定
后,其蛋白质的电力吸附(电附)可能
有变化,有些固定液能将细胞某部分的电附加强,使其染色更为容易。
因此,这种固定剂
不仅有固定作用,
也有媒染作用
Mordunt
),染色极为容易。
因此,
电附是
染色过
程中最重要的作用。
机械吸附在染色过程中也参与作用,如用苏木液和伊红染色,细胞核
不是纯蓝色,蓝色中略有红色,胞浆也不能尽为红色,红色中略有蓝色或
两者皆带些
紫
色。
这是因为伊红与胞核
虽无电附仍有
机械吸附,故也能染上少量红色,苏木液与胞浆
虽无电附但也有
机械吸附,因而胞浆略显蓝色。
化学吸附(作用)在染色中应用,最早应
用于金属染色剂(氯化金、硝酸银等)的金属与细胞内物质起化学作用,使金属在细胞内
变成沉淀物或死亡物,显示细胞结构或物质。
近年来此原理用于细胞酶化学染色。
血细胞的染色多采用瑞氏染色和
姬姆萨
染色两种,但作者取其两种染色的优点,
采用瑞氏和
混合染色法,比单用一种染色法更佳。
但近年来也出现一些快速和改
良染色方法及染色液商品化,对血细胞形态染色不一定适用。
(二)瑞氏(
Wright
'
s
staim
;
美蓝-伊红Y)染色:
.瑞氏染料是由碱性染料美蓝(
Methvlem
blue
)和酸性染料黄色伊红(
Eostm
Y
)合称伊红美蓝
染料即瑞氏
(美蓝-伊红Y)染料。
伊红钠盐的有色部分为阴离子,无色部分为阳离子,其有色部分为酸性,故称伊红为
酸性染料。
美蓝通常为氯盐是碱性的,美蓝的中间产物结晶为三氯化镁复盐,其有色部分
为阳离子,无色部分为阴离子,恰与伊红钠盐相反。
.用
甲醇作瑞氏
染料溶剂,即成瑞氏染液。
甲醇是瑞氏染料良好溶剂,有两种作
用:
(
1
)甲醇使瑞氏染料中美蓝(
M
)与伊红(
E
)在溶液中离解,可使细胞成分
选择性吸附其中的有色物质而着色。
甲
醇
ME
(瑞氏染料)——
——
→
+
-
在配制的瑞氏染液中美蓝如放置过久即可氧化而含有天青,美蓝天青与伊红化合物能
使核染成紫红色,但不能使胞浆染为蓝色,多余
美蓝就可以
使胞浆染成蓝色,染色主要
是化学作用,是离子彼此结合的反应。
)甲醇具有强大的脱水力,可将细胞固定在一定形态及增加细胞结构的表面积,
提高细胞对染料吸收作用,同时由于甲醇吸附染色液中的水,使染色液升温,加速染色反
应。
3.
瑞氏染液配制:
(1)
瑞氏染料
830gm
或
1g
甲醇(
AR
)
500ml
600ml
先称干燥(事先放入温箱干燥过夜)瑞氏染料放置乳钵内,
用乳棒轻轻
敲碎染料成
粉末,再行研磨至听不到
研芝麻声
即呈细粉末,加少许甘油或甲醇溶解研磨,使染料在
乳缸内显“一面镜”光泽,而无染料粉粒沉着,再加较多量甲醇研磨呈一面镜光亮,静置
片刻,将上层液体倒入
一
清洁储存瓶内(最好用甲醇空瓶),再加甲醇研磨,重复数次,
直至乳钵内染料及甲醇用完为止,摇匀,密封瓶口,存室温暗处,储存愈久,则染料溶解、
分解就越好,一般储存
3
个月以上为佳。
(2)
缓冲液:
1)
缓冲液作用:
染色对氢离子浓度是十分敏感的,据观察
值的改变,可使蛋白
质与染料形成的化合物重新离解。
缓冲液须保持
一定的
使染色稳定,
的
pH
一般在
6.4~6.8
,偏碱性染料可与缓冲液中
酸基起
中和作用,偏酸性染料则与缓冲液中
的碱基起中和作用,使
恒定。
2)
缓冲液配制(
pH6.4~6.8
,弱酸性):
配方
配方
1%
KH
PO
4
30ml
M/15
73.5
ml
Na
HPO
20ml
26.5ml
H
O(
新鲜
加至
1000ml
置室温黑暗处,瓶口密封,防止霉菌污染,如有污染则应报废。
(四)姬
姆萨
Giemsa
stain
天青
-
伊红)染色
1.
姬
姆萨染料是天青(蓝)
号伊红
AzurII
Eqsin)
和天青(蓝)
号合成的。
2.
姆萨红染料(
Giemsa,
伊红)染液配制:
姬
姆萨红染料(粉末)
0.5g
7.5g
33ml
500ml
甘油(
先将姬姆萨染料放入乳钵中,逐渐倒甘油研磨溶于甘油中,置于56
℃水温箱内,
~
120
分钟,然后加入甲醇,摇匀后放置数天,过滤后或不过滤即可使用。
此染液放
置室温阴暗处,时间越长越好。
使用染液
9
临时配置):
姆萨染液
1ml
,加
DDH
O10ml
混匀。
即可使用。
3.
染色步骤:
)先用甲醇固定
分钟。
)将血或骨髓涂片放置
姆萨使用液
15
30
)涂片用自来水冲洗,在室温中干燥待查。
(五)瑞
氏及姬姆萨
染色液的鉴定:
刚配好或放置一个月以上的染液可进行下列鉴
定:
.取
滴染液于乳白
玻
板上,自行迅速扩散开,其颜色变紫红色,且有伪足形成。
滴染液加
滴缓冲液,染液由深蓝
色立即
变为紫红色。
3
.取血片或骨髓片
进行试染检查
,观察染色后各类细胞的胞核、胞浆及颗粒着色
情况,
是否合适及染色合适时间。
如有上述变化,表明染液合格,可供使用。
(六)瑞氏染色
(Wright
s)-
姆萨(
)混合染色:
瑞氏染色的染料配方浓度对细胞核着色程度适中
细胞核结构和色泽清晰艳丽
对核
结构的识别较佳
但对胞浆着色偏酸
色泽偏红
对细胞浆内颗粒特别是嗜天青颗粒及
嗜中性颗粒着色较差
而姬姆萨染色对胞浆着色能较好的显示胞浆的嗜碱性程度
特别对
嗜天青、嗜酸性、嗜碱性颗粒着色较清晰
色泽纯正
而对胞核着色偏深
核结构显示
较差
故采用以瑞氏染液为主
姆萨染液为辅的混合染色。
染色步骤
:
1.
先用瑞氏染液将涂膜面充分覆盖;
2.
稍等片刻再加姬
染液
2-3
滴加减
根据涂片上细胞多少及增升程度酌情而
定
稍等
1-2
分钟后
再加磷酸盐缓冲液
加时应缓慢地
滴一滴加在涂片膜上
直至膜面上染色
液形成
表面张力而终止染色液加入;
4.
染色
30-40
分钟;
5.
分色:
用自来水缓缓冲洗至少
分钟以上
待干,勿用滤纸吸干
以免滤纸纤维
污染涂片。
四.血液学及血细胞形态学内容及自身特点:
(一)血常规检查(
Hb
、
RBC
WBC
Plt
、血细胞比积、
RBC-MCV
、
MCH
MCHC
及血小板容积曲线),用自动化仪器提高工作效率,为使结果准确可靠,
必须建立监测方法,搞好质控,此属数值质控。
我国已较普遍开展全国、省、市(地区)
质控。
但普遍存在应付质
控质量
的问题,并未能切实解决自身质控问题。
(二)白细胞分类:
白细胞分类的自动化已普遍应用,只能为患者普查与筛选之用。
遇有问题应用显微镜观察,弥补自动化仪器缺陷。
一般医院显微镜档次偏低,分辨率低,
正确使用和维修欠缺,因而要更好地发挥光镜的观察效应。
(三)骨髓、外周血细胞形态学及分类,是血液病及临床各科患者基本检查及诊断依
据。
反映继发性疾病的血液学表现,了解机体状况、感染(细菌、病毒、寄生虫等)等改
变。
(四)血细胞涂片自身的特点:
.涂片不易均匀:
由于血液是混悬液,其中白细胞、有核细胞、
、血小板的
形态大小、比重及生物活性和血浆成分等的不同和制片技术差异、质量分布不均匀性差异
颇大。
.细胞分布和检查的非随机性:
细胞分类标准与观念不一;
采样和计数
100~200
个白细胞的局限性;
(3)
细胞分布的生理变动;
与疾病的相关性;
室内、室间分类不一致性,开展室间质控也是促进形态学提高重要手段。
(五)血细胞形态学(外周血及骨髓)质控:
自
1983
年以来,澳大利亚皇家病理学
质控中心和英国皇家进修学院
质控中心及最近美国洛杉矶质控中心,国内:
全国及
省地市也普遍开展,由质控标本涂片发展图片指定细胞识别。
五.血细胞形态学采样、制片染色与检查要求:
采样、制片及染色,三道工序至关重要,是细胞形态学检查的成败关键。
要得
到合格的涂片标本,做好上述工序,应注意以下要求:
采样、制片:
片要求:
国内
1.0mm
×
26mm
76mm
±
0.5
,美国
NCCLS
规定
1.0mm
25mm
75mm
,要严格清洁,接近中性
.
推片:
选择优质推片,
推片两端
边缘整齐、平滑。
也可选用有机玻璃,其大小、
厚度
与坡片相同
,两端之边缘
应加工
光滑,
以利推片用
采外周
血(样),擦去第一滴血,迅速采血,量适中,如绿豆粒大小,具有
一定
推片技术
,
推片倾斜
45
°
,推成血膜长度
35mm
,宽度
18
20mm
,
血膜四周留有空隙区,血膜
终尾离玻
片终端至少
10mm
,血膜均匀,薄如蝉翼,尾端
形如弧状,迅速扇(摇)干,血膜具有头、体、
尾不同
厚薄区域。
此外,涂片时,还要
考虑患者的血液状态,如贫血程度、血液粘稠度、
或有核细胞多少等因素,
调整
推片技巧
(4)
如若采用静脉血推片,用
K
-EDTA
或肝素抗凝,
推制血
片应尽早进行(最迟在
1
小时内)。
(二)染色:
是识别细胞形态的重要标记工序:
常规瑞氏
姬姆萨染色要点:
.要得到满意、漂亮的血细胞染色标本,新鲜涂片迅速染色是很重要的。
.染色液配制要合格;
.涂片切勿用甲醛固定,否则不着色;
4
.染色的好坏与染色液、缓冲液的质量及比例、加液间隔时间、保持
片染色液
面的张力等染色技巧均有重大关系。
染液要覆盖涂膜面,再加缓冲液(
1:
),其量要充
足、混均,染色时间要
分钟以上。
5
.
细胞着色的观察:
(1)当染液与缓冲液混合后,甲醛吸水液温升高,发生剧烈反应,直至液膜表面的
“染色粒”呈均匀分布,随染色时间的推延,“染色粒”由“染色小粒”聚集成“染色大粒”
,逐渐由外缘向内缘推进至
染色面
中心(此过程需要
20-30
分钟以上),则表明细胞着
色已完成,
(2)再用自来水缓流冲洗,使染色液沉渣及染色粒浮去,使其充分起分色作用,去除
细胞染色中浮色,显示出胞核结构及细胞清晰形态,待干,镜检。
六.外周血细胞形态检查技巧:
外周血中三种血细胞数与形态学表现是:
反映骨髓造血状态及血液病和其他疾病的
厨窗
是检查与观察疾病的重要指标;
形态学诊断技巧:
数值准确性估计:
(1)目前自动化计数仪时有出现结果的偏差,低倍镜观察血涂片可以粗略估计
数值及分布。
低倍视野
数:
正常约
3~5
个,增多
6
个以上,减低
个以
下。
如推至片尾,分布不均,估计将有一定难度。
较大的细胞如单核、异
淋及中性粒细胞及不成熟细胞多在片尾,体部则多为较小的淋巴细胞,使分类造成偏差,
所以分类部位在适当调整。
白细胞计数值限度分级:
正常范围:
4.0~10.0
10
/L;
正常限度以下
轻度减少
(<
4.0
3.0
/L),
中度减少
2.0
极度减少
/L);
5
正常高限度以上
分轻度增多
(>
10.0
20.0
中度增多
40.0
明显增多
80.0
/L)
极度增多
/L)
以此与所测知
计数值作粗略对比,推断
计数值的准确性。
)如在血片分类计数过程中发现较多有核红细胞时,
计出血片中有核红所占
%
率,即以校正原
计数值减去有核红所占比例,
求出外周血中
总数值,
另作
分类计
100
个过程中遇到多少有核红细胞,即有核红细胞
个
/100
或作血片有核细胞分类计数(包括有核红细胞),计出有核红细胞所占
率。
分类正常范围及其病理性改变:
分类正常范围:
新生儿出生后最初
24
小时白细胞数高,主要为中性粒细胞
至第
周,
中性粒细胞与淋巴细胞比例倒转,直至
岁淋巴细胞比例仍多。
表
白细胞分类正常范围由于民族、地区、年龄、性别及其生理性变化的影响,以及检
查本身的技术差异,即使一人同次取材不同涂片、一张涂片多次分类计数结果也不可能完
全一致,但不可差异太大。
分类中占大比例的中性粒细胞或淋巴细胞呈正态分布,占小比例的嗜酸
/
嗜碱性
粒细胞及单核细胞则为
Poisson
分布。
病理性形态学改变:
①中性粒细胞:
中性粒细胞分叶分化程度,被认为从干细胞至粒细胞生成是否正常及与粒细胞年龄
相关;
如核分叶不良,
Pelger-huet
现象;
核仅一叶
或二叶,其百分率增加时谓之“左
移”,反之,多数细胞四叶以上谓之右移,一般认为正常中性粒细胞胞核分叶情况:
叶者为
25%
40
50%
20
40%
<
5%
血象中如有多个
叶以上者提示有巨幼细胞性贫血的可能。
右移现象
—多见于巨幼细胞性贫血、肝脏疾患,并可以
叶与
叶所占比例计算,得出简单
实用的分叶指数:
分
叶指数
=5
叶
/4
100%
正常核分叶指数:
0
17%
—还见于
缺铁性贫血、类风湿性关节炎、遗传性高分叶症(显性遗传)及某些败血症(以
左移多见)。
左移—见于感染、败血症、出血、小儿慢性中性粒细胞减少症等。
中性粒细胞毒性颗粒及空泡改变:
中性粒细胞由于受到外来刺激(包括感染及应激
反应)引起颗粒变性,粗大
着色深染
及浆内空泡等病理性改变。
上述改变及白细胞数增
多和出现幼稚及原始细胞则为类白血病反应。
慢性粒细胞白血病(
CML
)的中性成熟粒细胞一般胞浆颗粒较正常稀少,但无
空泡及毒性颗粒,而慢性中性粒细胞白血病(
CNL
)的中性成熟粒细胞则与类白血病反
应形态相似。
假性嗜酸性颗粒—在某些干细胞疾病如
MDS
、粒细胞缺乏症、肾性贫血某些患
者中性粒细胞的颗粒增多,形态异常,类似嗜酸性样颗粒的出现。
遗传性白细胞异常疾病:
是先天性白细胞异常疾病,临床上虽罕见,但为了提高辨
别的能力,应有所认识。
Pelger-Huer
白细胞异常:
属于显性遗传,其白细胞形态特点:
核分叶不良,不分叶,
核呈花生形、
亚铃形等
形状,无核丝形成,胞浆正常,此外,还有假性(
即继发
性)
白细胞异常应加以鉴别,后者常见于急性肠炎、伤寒、疟疾、流感,无家族史,
但在原发病得到治疗后白细胞形态恢复正常。
Alder-Reilly
颗粒异常:
常染色体隐性遗传性多糖代谢障碍性疾病,常伴有软骨畸形、
肝、脾肿大等,中性、嗜酸性及嗜碱性粒细胞含有多量嗜天青颗粒遮盖整个细胞,单核细
胞亦有类似改变。
May-Hegglin异常:
为常染色体显性遗传疾病,在中性及嗜酸性粒细胞浆内含有
Dunle小体,常伴有巨血小板及血小板减少、紫癜,由于细胞的游走功能差,故病人常出
现感染症状。
继发性也可见于猩红热、球菌性感染、烧伤早期等某些病例。
②嗜酸性粒细胞:
此种细胞在人体每日规律性变动,晨至午下降,午后始升,午夜至
次晨
时达高峰数值,哮喘患者及夜间工作者其规律与正常相反,晨
至
12
时达高峰。
临床上嗜酸性粒细胞增多见于:
过敏性疾病,如血管神经性水肿、哮喘、食物及药物过敏、血清病、荨麻疹、枯燥热
等。
寄生虫病:
常见于血丝虫、钩虫、包囊虫、肺吸虫、蛔虫、
吕弗
氏(
Lofllers
)综
合征、蛲虫、旋毛虫、疟疾(偶见)及血吸虫等。
皮肤病:
如湿疹、剥脱性皮炎、天疱疮、牛皮癣、疟疾、
疥
、感染、猩红热早期等。
血液病:
高嗜酸性粒细胞综合症、CML、嗜酸性粒细胞白血病、何杰金氏病(占
10%病例)、嗜酸性肉芽肿、家族性嗜酸性细胞增多症、热带嗜酸性细胞增多症、甲状腺
癌及播散性结缔组织病。
与化学药物有关:
镍(致皮肤炎)、青霉素、
PAS
、苯、呋喃妥因、磺胺等。
③嗜碱性粒细胞:
在正常人血液中为数甚少,该细胞嗜碱性颗
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- 血细胞 形态学 检验 技巧 报告