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10,质粒的结构不稳定:
是DNA从质粒上丢失或碱基重排,缺失所致工程菌性能的改变
11,连续培养:
是指以一定的速率向发酵液中添加新鲜培养基的同时,以相同的速率流出培养液,从而使发酵罐内的液量维持恒定不变,使培养物在近似恒定状态下生长的培养方法。
12,补料分批培养:
补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养,经过一段时间后间歇或连续地补加新鲜培养基,使菌体进一步生长的方法。
13,包含体:
指细菌表达的蛋白在细胞内凝集,形成无活性的固体颗粒。
14,悬浮培养:
指在液体培养基中能保持良好分散性的细胞和小的细胞聚集体的培养。
15,继代培养:
对来自于外植体所增殖的培养物(包括细胞,组织或其切段)通过更换新鲜培养基及不断切割或分离,进行连续多代的培养,就称为继代培养。
16,植物细胞的全能性:
指任何具有完整细胞核的植物细胞,所具有的形成一个完整植株所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。
17,外植体:
指用于植物组织(细胞)培养的器官或组织(的切段)。
18,愈伤组织:
是指植物细胞在组织培养过程中形成的无一定结构的组织团块,在适宜的条件下,该组织可再分化,形成芽,根,再生成植株。
19,脱分化:
又称去分化。
是指分化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细胞特性的过程。
20,再分化:
经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可有转变为各种不同细胞类型的能力。
21,细胞后含物:
是细胞代谢过程中产生的非生命物质的总称。
包括生物碱,糖苷类,挥发油,有机酸。
22,融合蛋白:
以原核多肽和真核蛋白结合在一起称融合蛋白,其氨基端是原核序列,羧基端是真核序列。
23,非融合蛋白:
指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为-起始,在其氨基端不含细菌多肽序列。
24,最适发酵温度:
是指最适合产生菌生长的温度和最适合药物合成的温度。
25,植物杀菌素:
是指在植物防御系统内能对抗微生物进攻的某些次级代谢产物。
26,无性繁殖系:
又称克隆,是指使用母体培养物反复进行继代培养时,通过同种外植体而获得越来越多的无性繁殖后代。
27,新鲜冰冻血浆(FFP):
指在采血后6—8小事内,经4℃离心后将血浆分出,并在-20℃或更低的温度下快速冰冻保存的血浆。
适用于血友病甲型及乙型,肝功能不全等。
28,转输蛋白:
这是一类能在血液循环中对机体的营养物质,代谢产物,激素,药物等进行转输的血浆蛋白。
29,血清学反应:
抗原抗体在体外结合的反应,因实施反应的某些重要因素是含抗体的动物血清,故名血清学反应。
血清学反应具有严格的特异性和较高的敏感性,因此可用抗原或抗体的已知一方检测未知的另一方,作为传染病的辅助诊断和微生物的鉴定。
30,放射免疫技术(RIA):
是将放射性核素分析的高度敏感性与抗原抗体反应的特异性结合起来建立的检测技术。
31,高密度发酵:
一般指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上,理论最高值可达200gDCW/L。
影响高密度发酵的因素:
培养基,溶氧浓度,pH,温度,代谢副产物。
32,贴壁细胞:
细胞生长须有贴附于支持物表面,细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长,增殖。
有两种形态:
成纤维样细胞型:
来源于中胚层细胞。
上皮样细胞型:
来源于外胚层和内胚层组织的细胞。
33,植物生理活性物质:
是一类对植物细胞内的生化反应和生理活动起调节作用的物质的总称。
包括酶,维生素,植物激素,抗生素,植物杀菌素。
34,固定化细胞:
将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。
被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞,它与固定化酶同被称为固定化生物催化剂。
二、问答题
1,生物药物的药理学特性。
答:
(1),治疗的针对性强,治疗的生理生化机制合理,疗效可靠;
(2),药理活性高;
(3),毒副作用小,营养价值高;
(4),生理副作用常有发生。
2,生物药物原料选择原则。
(1),有效成分含量高,原料新鲜;
(2)原料来源丰富,易得,原料产地距药物生产基地较近;
(3),原料中杂质含量少;
(4),原料成本低等,但是同时具备多种有利因素的原料不多,生产研究者可酌情选择,但第一条是最重要的。
3,最佳的基因表达体系应具有哪些特征?
a,目的基因的表达产量高;
b,表达产物稳定;
c,生物活性高;
d,表达产物容易分离纯化。
4,单克隆抗体(McAb)的定义和制备。
定义:
杂交瘤技术把在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与Ag免疫后的纯系小鼠脾细胞融合,称为杂交细胞系,将这种杂交瘤作单个细胞培养,所形成单细胞系即利用培养或小鼠腹腔接种的方法,使能得到大量的,高浓度的,非常均一的单抗。
制备:
(1),杂交瘤细胞的选育;
(2),杂交瘤细胞的培育;
(3),单抗的分离纯化。
5,lg与Ab的区别
(具有Ab活性或化学结构与Ab相似的球蛋白统称为免疫球蛋白Ig)。
Ig=Ab+化学结构类似物,Ab=Ig,Ig≠Ab,所以Ig是化学结构的概念,而Ab是生物学功能的概念。
6,发酵工程制药的特点。
(1),具有严格的无菌生长环境:
(无菌技术)包括发酵开始前采用高温高压对发酵罐以及各种连接管道进行灭菌的技术;
在发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空气的空气过滤技术;
(2)在发酵过程中根据细胞生长要求控制加料速度的计算机控制技术;
(3)种子培养和生产培养的不同工艺技术;
(4),在进行任何大规模工业发酵前,必须在实验室规模的小发酵罐进行大量的实验,得到产物形成的动力学模型,并根据这个模型设计中试的发酵要求,最后从中数据再设计更大规模生产的动力学模型;
(5)由于反应的复杂性,在从实验室到中试,从中试到大规模生产过程中会出现许多问题,这就是发酵工程工艺的大问题。
7,基因工程药物分离纯化的技术要求
(1),技术条件温和,能保持产物生物活性;
(2),选择性好,能从复杂的混合物中有效的将目的产物分离,达到较高的纯化倍数;
(3),收率要高;
(4),两个技术间能直接衔接,不需要对物料加以处理;
(5),纯化过程要快,满足高生产率的要求。
8,动物细胞大规模培养的方法
悬浮培养,贴壁培养,贴壁—悬浮培养
9,固定化酶的定义及特点
固定化酶指限制或固定于特定空间位置的酶。
具体讲是指经物理或化学方法处理,使酶变成不易随水流失即运动受到限制,而又能发挥催化作用的酶制剂。
制备固定化酶的过程称为酶的固定化。
固定化所采用的酶,可以是纯化的酶,也可以是结合在菌体(死细胞)或细胞碎片上的酶或酶系。
特点:
(1),可多次使用,酶的稳定性提高;
(2)反应后,E与S和P易于分开,产物中几乎无残留酶,易于纯化产物;
(3),反应条件易于控制;
(4),酶的利用率高,单位酶催化的底物量增加,用酶量少;
(5),比水溶性酶更适合于多酶反应。
10,人来来源药物的特点与研究意义。
特点:
(1),安全性好;
(2),效价高,疗效可靠;
(3),稳定性好
研究意义:
(1),资源的有限性由于受到法律的严格保护或伦理的制约,人类来源的药物原料是有限的。
现能用于生产的原料主要有血液,胎盘,尿液等少数几个原料品种。
(2),研究的重要意义尽管制药原料来源有限,但科学家们还是积极对人体内活性物质的提纯,结构和功能开展越来越深入的研究,并取得了重大成果。
研究人体来源药物对于医学具有重大意义:
从药学角度研究清楚人体来源药物的结构和功能,对于使用现代生物技术生产药物具有重大意义,如知道了人胰岛素结构,就可用基因工程技术生产人胰岛素。
11,生物药物检验上的特殊性。
由于生物药物具有特殊的生理功能,因此生物药物不仅要有理化检验指标,这也是生物药物生产的关键。
12,噬菌体抗体库技术的基本方法。
(1),获取目的基因:
提取RNA,经RT—PCR获取抗体某一特定基因区段;
(2),抗体库技术的载体:
普遍使用噬菌粒载体;
(3),淘筛:
用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛,淘汰非目的克隆,使目的克隆大量扩增;
(4),表达与鉴定:
目的克隆经过鉴定后,再导入感受态菌株,进行可溶性表达,其产物用Westernbiot分析确定后,就完成了全过程。
13,适合目的基因表达的hostcell(宿主细胞)应满足一下要求
(1),容易获得较高浓度的细胞;
(2),能利用易得廉价原料;
(3),不致病,不产生内毒素;
(4),发热量低,需氧低,适当的发酵温度和细胞形态;
(5),容易进行代谢调控;
(6),容易进行DNA重组技术操作;
(7),产物的产量,产率高;
(8),产物容易提取纯化。
14,哺乳动物细胞作为基因表达体系的宿主细胞的优缺点。
优点:
表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中,纯化容易。
产物是糖基化的,接近天然物。
缺点:
生长慢,生产率低,培养条件苛刻,费用高,培养液浓度稀。
15,动物细胞中的基因表达的优缺点。
(1),哺乳动物细胞外源基因表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中,使产物易纯化;
(2),基因产物糖基化接近天然产物。
缺点:
(1),细胞生长慢,生产率低;
(2),条件苛刻,费用高;
(3),培养液浓度较小;
(4),表达的外源细胞均为传代细胞;
(5),表达产物是否致癌尚有疑问。
16,干细胞的定义及分类。
干细胞,即起源细胞。
在在细胞的分化过程中,细胞往往由于高度分化而完全丧失了再分裂的能力,最终衰老死亡。
机体在发展适应过程中为了弥补这一不足,保留了一部分未分化的原始细胞。
因此,干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。
分类:
全能干细胞:
具有形成完整个体的分化潜能。
如胚胎干细胞(ES细胞);
多能干细胞:
具有分化出多种细胞组织的潜能。
如造血干细胞,神经细胞;
单能干细胞:
只能向一种或两种密切相关的细胞类型分化。
如上皮组织基底层的干细胞,肌肉中的成肌细胞。
17,生化制药中试放大工艺特点和需注意,解决事项。
中试放大是由小试转入工业化生产的过度性研究工作,对小试工艺能否成功地进入规模生产至关重要。
这些研究工作都是围绕如何提高收率,改进操作,提高质量,形成批量生产等方面进行。
中试放大验证实验室工艺路线的可行性以及在实验室阶段难以解决或尚未发现的问题。
在考查工艺条件的研究阶段中,必须注意和解决:
(1),原辅材料规格的过度试验:
在小试时,一般采用的原辅材料(如原料,试剂,溶剂,纯化载体)规格较高,目的是为了排除原料中所含杂质的不良影响,从而保证实验结果的准确性。
但是当工艺路线确定之后,在进一步考查工艺条件时,应尽量改用大规模生产时容易得到的原辅材料。
过渡试验。
(2),设备选型与材质质量试验:
在小试阶段,大部分试验是在小型玻璃仪器中进行,但在工业生产中,物料要接触到各种设备材料,如微生物发酵罐,细胞培养罐,固定化生物反应器,多种层析材料以及产品后处理的过滤浓缩,结晶,干燥设备等。
(3),反应条件限度试验:
反应条件限度试验可以找到最适宜的工艺条件(如培养基种类,反应温度,压力,pH等),一般均有一个许可范围。
有些反应对工艺条件要求很严,超过一定限度后,就会造成严重损失。
进行工艺条件限度试验,全面掌握反应规律。
(4),原辅材料,中间体及产品质量分析方法研究;
(5),下游工艺的研究:
尽量简化下游工艺操作,采用新工艺,新技术,新设备等。
18,生化制药中中试放大的研究内容
(1),工艺路线与各步反应方法的最后确定;
(2),设备材质与型号的选择;
(3),反应器的规模选择及反应搅拌器型式与搅拌速度的考查;
(4),生产反应条件的研究;
(5),工艺流程与操作方法的确定;
(6),物料衡算;
(7),安全生产与三废防治措施研究;
(8),原辅材料,中间体的物理性质和化工常数的测定;
(9),原辅材料,中间体质量标准的制定。
(10)消耗定额:
原料成本,操作工时与生产周期计算。
19,两步培养法及其作用
第一步:
生长培养基,适于细胞生长;
第二步:
生产培养基,适于次生代谢物的合成。
20,GMPGoodManufacturingPractice优良的制造标准
21,制药用水的分类
饮用水,纯化水,注射用水,灭菌注射用水
22,转录法
转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA,再反转录成cDNA,然后进行cDNA的克隆表达。
23,RNA的纯化
RNA的3’端常含有—polyA组成的末端,长达10—250个Nt,足以吸附于寡聚胸苷OligodT—纤维素上,从而可以用亲和层析法将mRNA从细胞总RNA上分离出来,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异地吸附在Oligo(dT)纤维素上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下。
2,cDNA第一条链的合成,目前采用较多的逆转录酶,主要有两种:
(1),是从禽逆转录病毒颗粒纯化得到的禽逆转录酶(AMV);
(2),是从克隆有Molonly鼠白血病病毒转录酶基因的大肠杆菌中分离的鼠源逆转录酶(M-MLV)。
3,cDNA第二链的合成:
(1),自我引导合成;
(2),RNaseII酶降解取代法;
(3),外加引物合成法。
4,cDNA的克隆:
cDNA片段与载体的连接方法:
加人工接头连接;
引物—接头连接;
同聚尾接头。
5,将重组体导入宿主细胞;
6,cDNA文库的鉴定;
7,目的cDNA克隆的分离和鉴定
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