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(二)實驗藥品
1.麻醉藥(chloralhydrate)
2.神經毒素(6-hydroxyldopamine,6-OHDA)
3.生理食鹽水(normalsaline)
4.甲基安非他命
5.4﹪福馬林固定液
6.30﹪蔗糖溶液
7.包埋劑(O.C.T)
8.0.1M磷酸鹽緩衝生理食鹽水溶液(phosphatebuffersaline.PBS)
9.30﹪山羊血清(normalgoatserum)
10.0.04%tritonX-100
11.酪胺酸水解酵素(tyrosinehydroxylase,TH)
12.c-fos
13.reducednicotinamideAdenineDinucleotidePhosphate(NADPH,Sigma,St.Louis,MO.,USA)
14.NitroBlueTetrazolium(NBT,Sigma,St.Louis,MO.,USA)
15.次級抗體(biotinylatedgoatanti-rabbitIgG,VectorLab.,CA,USA)
16.明膠(gelatin)
17.0.5﹪甲基綠(methylgreen)
18.二甲苯(Xylene)
19.70%、95﹪、100﹪酒精
20.封片膠(Permount,FisherCo.,PA.,USA)
21.avidin-biotin-peroxidasecomplexABC(VectorLab,CA,USA)
四﹑研究過程及方式
(一)實驗動物
大白鼠(Sprague-Dawley)體重200至250公克,飼養於室溫之動物室中。
(二)動物手術
實驗動物於手術前停止餵食物及水2小時,先將動物秤重並計算所需麻醉藥量(400毫克/100公克),由腹腔注入麻醉藥後,將大白鼠放入籠內約5~10分鐘;
待其深度麻醉後,即可用剃刀將其頭部上方的毛剃除。
將老鼠置放於立體定位儀,首先以耳棒穿入外耳道,並將上下頷分開以固定夾將頭部水平固定。
以優碘消毒其頭部後,再以70%酒精清洗乾淨,以手術刀劃開頭皮,並將皮下組織及肌肉清除,以十字縫為參考點,將針尖在十字縫的位置向右移動1.2毫米,並向後移動4.5毫米,其下便為內側前腦束上方(medialforebrainbundle,MFB)之所在,即為入針的位置。
以電鑽接上小鑽頭將頭骨鑽開。
需以探針看是否已將頭骨鑽開;
否則易鑽破硬腦膜及腦組織。
將微量注射器以硬腦膜為參考點向下插至7.8毫米的MFB處,以每分鐘1微升的速度注入4微升可破壞兒茶酚胺的神經毒素6-OHDA,注射完後等5分鐘,才將注射器向上旋出,以減輕腦內壓力過大將所注入毒物壓擠出。
注射後,將動物頭皮縫合,並打上耳號,擦上優碘即完成手術步驟。
對照組微量注射器內的藥品改以溶解藥物含0.02%維他命C磷酸鹽緩衝液代替。
(三)測試動物注入6-OHDA後的運動行為反應
手術後的大白鼠送回動物室飼養3天及2週後,測試手術是否成功。
由老鼠的腹腔注入安非他命(5毫克/100公克),令其在動物旋轉儀中旋轉。
由電腦紀錄轉圈數,判斷手術位置是否正確。
(四)犧牲動物
準備約200毫升的生理食鹽水及500毫升含4%福馬林的固定液(甲醛溶解在0.1莫耳,酸鹼度7.4磷酸鹽緩衝液),分開置放於通風煙櫥中。
由大白鼠的腹腔注入過量麻醉劑,待老鼠深度麻醉後,在通風煙櫥內將大白鼠固定在木板上,夾起胸骨箭突處的毛皮並以剪刀剪開皮膚,夾起箭突,將胸骨剪斷,以手術剪沿著箭突兩側外緣肋軟處剪開,避免傷及內胸動脈。
再以大型蚊狀手術鑷,夾住箭突,向外翻後,以小手術剪,剪開心包膜,露出心臟,用平滑手術鑷夾住心臟後,再以預先備妥內裝有生理鹽水的鈍型針頭插入左心室,深入到主動脈處,以小蚊狀鑷夾住針頭後,打開灌流幫浦,並將右心耳剪開,讓血液流出。
待200毫升的生理食鹽水灌流完畢,將灌流幫浦接到福馬林固定液處並灌流。
(五)切片
所使用的是冷凍切片機;
鼠腦由30%的蔗糖溶液取出後,先用刀片在左大腦上方輕劃一刀做記號。
將鼠腦豎立在標本座的底座上;
腦的周圍淋上包埋劑(O.C.T.,製作冷凍切片標本固定及保護)並放入攝氏零下二十度的切片機中,待其腦組織凝固至適當溫度,即可將標本座置放在切片機上,調整刀座及防卷片,進行冷凍切片(-20℃),切片厚度為30微米,並以毛筆將切片收集並保存於磷酸鹽緩衝生理鹽水溶液(0.1M,pH7.4,phosphatebuffersaline《PBS》)中。
切及黑質及紋狀體時,將切片厚度調至16微米,並直接以載玻片黏取,存於零下四度冰箱中,預做DAPI染色的準備。
(六)免疫組織化學(Immunohistochemistry)及組織化學反應(histochemistry)
1.免疫組織化學反應
實驗所用的免疫組織化學技術,採用自由懸浮法(Hsu,etal.,1981)。
將保存於PBS中的切片先以PBS清洗2次(各約5分鐘);
吸去PBS後,加入30%normalgoatserum及0.04%tritonX-100的PBS中(1%-GS-PBS-T)30分鐘;
吸出後加入酥胺酸水解酵素(TH,1:
1000)或c-fos(1:
5000-7000)的初級抗體。
置於室溫中輕微振盪,培養24小時。
吸去初級抗體,以0.1MPBS洗2次;
吸去PBS,加入次級抗體(biotinylatedgoatanti-rabbitIgG)於室溫中反應45分鐘後,吸去次級抗體,並以0.1MPBS洗2次;
吸去PBS,加入avidin-biotin-peroxidasecomplex(ABC)試劑,於室溫下作用45分鐘,以0.1MPBS清洗1次,再加入Tris緩衝液(pH7.6),後以0.05%3.3‘-diaminobenzidine(DAB)作為過氧酵素的基質,及含0.03%的過氧化氫作呈色反應(約10分鐘),標本經反應後會略呈棕紅色,至適當呈色反應後,吸出DAB反應液,加入蒸餾水清洗1~2次,再以0.1MPBS清洗2次。
2.組織化學反應
煙鹼醯胺腺嘌呤二核咁磷酸去雙磷酸酵素
將經TH或c-fos免疫組織化學反應後的腦組織切片(進行雙重染色),或未經染色的附近一組腦組織切片進行NOS組織化學反應。
將組織切片加入預先配妥每10毫升0.1M磷酸鹽緩衝液(PBS,pH7.4)含10毫克reducednicotinamideadeninedinucleotidephosphate(NADPH)及1.0毫克nitrobluetetrazolium混合溶液,在攝氏37度下的水浴中反應30至60分鐘。
反應結束後,以0.1MPBS清洗2至3次。
(七)鋪片與封片
鋪片的載玻片要事先即以明膠(gelatin)處理;
處理過程如下:
先將載玻片(75㎜×
25㎜)浸入含有清潔劑的水中一小時,再用自來水沖洗一天後,放入經過濾後的明膠中,使其沾附於載玻片後,即可放入60℃的烤箱中,待其乾燥後,取出重覆浸入明膠再經烘乾後,再取出、冷卻後儲存備用。
染好色的標本撈出置於裝有PBS的塑膠盤內,依前後、左右順序將標本鋪於載玻片上。
鋪好的載玻片置於烘片機以低溫烘乾,待其乾燥後即可行脫水、透明及封片步驟。
封片前還要進行對比染色及脫水與透明手續,先將載玻片浸入蒸餾水中2~3分鐘後,將多餘的鹽份清除,放入0.5%的甲基綠(methylgreen)內約30秒到1分鐘,在以蒸餾水洗去多餘染色劑;
並將標本進行退染步驟,把載玻片浸入含冰醋酸的70%酒精內,得適當退染。
因最後要用不與水互溶的二甲苯(xylene)進行透明作用;
將退染後標本漸進放入70%(一次)、95%(二次)、100%(二次)的酒精中,每次2~3分鐘,進行脫水作用。
最後放入二甲苯中(二次)使標本透明無水;
即可以手術鑷夾起載玻片,置放於紙巾上。
以滴了封片膠的蓋玻片緩緩蓋上標本,並擠出其中的小氣泡即可晾乾。
待玻片晾乾後,即可以光學顯微鏡觀察,記錄並照相。
(八)統計分析
本實驗每隻動物以30微米厚度切片,切片保存於pH=7.4、0.1MPBS的試管中。
試管總共30管,切片依序放入,每隔六管分成一組,共分為五組,選取三組分別進行TH、c-fos及NOS染色。
在40倍物鏡視野下選取同一隻動物(各五片,相隔200微米)位於相似區域的紋狀體及黑質,計算其範圍內所有具陽性反應的細胞數總和。
本實驗觀察計算所得神經細胞數目,以Student’st-test比較實驗側與對照側之差異。
五﹑研究結果
神經毒素6-OHDA注入MFB一小時後,將動物犧牲進行TH和c-fos組織免疫化學反應及NOS組織化學反應。
結果發現c-fos在紋狀體及皮質區(由其梨狀皮質區)明顯地增加,而TH及NOS在紋狀體及黑質區其實驗側與對照側並無明顯差異。
神經毒素6-OHDA注入MFB三天後,施以皮下注射安非他命(5毫克/100克重)無法誘發大白鼠定向旋轉行為。
大白鼠立即犧牲,發現實驗側紋狀體c-fos反應增強,而實驗側與對照側黑質區皆未發現含c-fos及NOS細胞。
而TH在實驗側紋狀體反應明顯減弱,在黑質區的TH反應與對照側不俱明顯差異。
神經毒素6-OHDA注入MFB二星期以上後,施以皮下注射安非他命(5毫克/100克重)旋轉紀錄發現大白鼠逆時針定向旋轉,每分鐘達六次以上。
實驗側的紋狀體及黑質區TH反應都明顯降低。
表:
黑質、紋狀體經6-OHDA注入MFB後動物旋轉次數、TH、c-fos及NOS神經元數目統計表
犧牲
老鼠
旋轉
觀察
TH
c-fos
NOS
時間
隻數
次數
部位
實驗側
對照側
1小時
4
※※※
紋狀體
+++++
623+232
390+171
1264+95
1109+116
實
黑質
520+53
571+48
5<
驗
3天
3
128+51
+++
7534+65*
6538+100
973+279
1020+265
組
523+18
643+29
21天
560+94
+
933+88*
310+15
615+13
578+11
以上
72+12*
327+15
830+197
698+132
P
647+43
698+41
B
1053+119
1032+159
S
572+46
596+55
1000+104
967+109
523+47
560+35
附註:
計算黑質和紋狀體區TH、c-fos免疫組織化學反應及NOS組織化學反應神經細胞體數目(平均值+標準誤),在40倍物鏡視野下選取同一隻動物(各五片標本,相隔200微米)位於相似區域的神經組織,計算其範圍具陽性反應神經胞體總合,以Student’sT-test比較實驗側與對照側之差異(*為p值<0.05);
「※※※」表示未觀察;
「+」表示紋狀體中TH神經末梢的反應濃度。
六﹑討論及應用
神經毒素6-OHDA注入MFB三天後,TH在實驗側紋狀體反應明顯減弱,施以皮下注射安非他命(5毫克/100克重)無法誘發大白鼠定向旋轉行為,這乃由於實驗側紋狀體中多巴胺第一型受器(D1receptor)對於早期多巴胺神經末梢退化超敏感化(supersensitization)所致。
在黑質區的TH反應與對照側尚不俱明顯差異;
二星期以上後,施以皮下注射安非他命(5毫克/100克重)旋轉紀錄發現大白鼠逆時針定向旋轉,平均每小時達560次以上,且實驗側的紋狀體及黑質區TH反應都明顯降低,以上所得結果與本研究實驗室及國內外其他學者實驗結果相吻合。
黑質區中的c-fos與NOS無論在實驗組(實驗側與對照側)及對照組,各個時期均無改便,這結果顯示c-fos與NO與由6-OHDA誘發黑質區多巴胺神經元退化,可能沒有直接關係。
實驗組c-fos在紋狀體不論神經毒素6-OHDA注入後之時間長短皆增加,這其中表示有三種意義,在第一小時為立即反應基因(immediateearlygene)的表現;
在第三天為立即反應基因與慢速反應基因(lateresponsegene)同時存在;
二十一天以後為慢速反應基因繼續表現。
至於造成實驗組對照側c-fos也有表現的原因,可能是由於在注入6-OHDA時經由擴散到對側的內側前腦束使然。
神經毒素6-OHDA誘發實驗組實驗側紋狀體中c-fos持續顯著的表現,這可能與紋狀體中其它神經傳遞物增加表現有密切關係。
七﹑結論
(1)本研究結果發現NO與c-fos似乎和6-OHDA造成黑質神經細胞退化無直接關聯。
(2)c-fos在黑質紋狀體系統損傷後,長時期持續增強表現,很可能擔負紋狀體可塑性重要角色。
八﹑參考文獻及其他
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