分子实验室细胞实验室常用配方.docx
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分子实验室细胞实验室常用配方
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分子实验室细胞实验室常用配方
(一)WB相关试剂及常用缓冲液
●RIPA(100mI)(最后要调pH为)
终浓度
分子量
称取
Tris-HCI
50mM
NaCI
150mM
TritonX-100
1%
1mI
脱氧胆酸钠
1%
1g
EDTA
1mM
SDS
%
PMSF(100mM)
使用时每1ml加10ul
●10%过硫酸铵溶液AP(分装保存于-20度)
AP粉末1g
ddH2010ml
●10%SDS(十二烷基硫酸钠):
SDS粉末10g
ddH20定容到100ml
注意:
用磁力搅拌器搅拌不会容易起泡泡
●6X蛋白质samplebuffer
Tris-HCl(1M,30mL
SDS10g
甘油30mL
DTT()
溴酚蓝
ddH20定容至100mL
●10XPBS缓冲液的配制:
NaCl80g
KCl2g
Na2HPO4(十二水合36g)
KH2PO40
加800mLddH2O,根据开始的pH用NaOH或HCL调pH到,调好pH再定容到1升。
配好后用高压蒸气灭菌后常温保存最好是在4度
●PBST(1X)
PBS(1X)500ml
Tween20500μl
●50×Tris-乙酸(TAE)缓冲液配制1L溶液各成分的用量
●Tris粉末242g
冰醋酸
Na2EDTA·2H2O37.2g
ddH20定容到1L
●封闭液
脱脂奶粉5g
叠氮钠(现配现用时可不加)
PBS定容到100mL
●染色液(室温)
1L
500ml
200ml
100ml
甲醇
500mL
250
100
50
乙酸
100mL
50
20
10
R250考马斯亮蓝
g
g
g
H20
400mL
200
80
40
●脱色液:
(室温)
甲醇165mL
乙酸50mL
H20785mL
●:
(调pH至,4度保存)
100ml
200ml
Tris
18.17g
10%SDS
4mL
8ml
ddH20
定容至100mL
200ml
●Buffer:
(调pH至,4度保存)
100ml
200ml
Tris
6.06g
10%SDS
4mL
8ml
ddH20
定容至100mL
200ml
●转移缓冲液(10×transbuffer):
(常温保存)
1L
2L
甘氨酸
144g
288g
Tris粉末
30.3g
ddH20
定容至1L
定容至2L
使用时甲醇200mL
转移缓冲液(10×)100mL
ddH20700mL
●电泳缓冲液(10×)(runningbuffer):
(常温保存)
1L
2L
甘氨酸
144g
288g
Tris粉末
30.3g
SDS
10g
20g
ddH20
定容至1L
定容至2L
●10Х)TBS:
(常温保存)
NaCl
Tris粉末
ddH20定容至1L
●TBST(1X)
TBS(1X)500ml
Tween20500μl
●Strippingbuffer(可反复利用)温老师组配方
10%SDS10ml
Β-巯基乙醇350μl
Tris-HCI()(加到50mL水)
加入ddH2O至50mL
●Strippingbuffer(可反复利用)郭老师给配方
甘氨酸15g
SDS1g
Tween201ml
ddddH2O1L
作这个buffer洗20min,然后用PBST洗3次,再重新封闭孵抗体。
(二)细胞和细菌培养基、抗生素
●LB培养基(当天灭菌后放4度存放)
1000ml
500ml
300ml
250ml
200ml
氯化钠
10g
5g
3g
2g
蛋白胨
10g
5g
3g
2g
酵母提取物
5g
1g
ddH20
定容至1000ml
定容至500ml
定容至300ml
定容至250ml
定容至200ml
●LB平板:
(当天灭菌后倒平板,放4度存放)
1000ml
500ml
300ml
250ml
200ml
氯化钠
10g
5g
3g
2g
蛋白胨
10g
5g
3g
2g
酵母提取物
5g
1g
琼脂
15g
3g
ddH20
定容至1000ml
定容至500ml
定容至300ml
定容至250ml
定容至200ml
●SOB培养基
将下列组分溶解在0.9L水中:
蛋白胨20g
酵母提取物5g
氯化钠0.5g
1mol/L氯化钾
用水补足体积到1L。
分成100ml的小份,高压灭菌。
培养基冷却到室温后,再在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁
●1MIPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(分子量为))溶液
IPTG粉末
ddH20定容到10ml
用μm滤器过滤除菌,分装成1ml小份贮存于-20℃。
●Amp+(50mg/ml)
Amp+粉末50mg
ddH201ml
注意:
分装保存于-20度,使用时按1000:
1的比例用
●Kana+(50mg/ml)
Kana+粉末50mg
ddH201ml
注意:
分装保存于-20度,使用时按1000:
1的比例用
●胰酶:
抽滤,长期保存可放负20度
粉末0.25g
EDTA-0.03g
1XPBS100ml
●高糖DMEM培养基:
抽滤保存在4度
粉末全部
碳酸氢钠3.7g
ddH20定容到1L(用盐酸调pH值到:
)
●G418母液(100mg/ml)用μM滤菌,分装存于-20度
粉末1g
PBS10ml
●zeocin母液(100mg/ml)用μM滤菌,分装存于-20度
粉末1g
ddH2O10ml
●Blasticidin(100mg/ml)用μM滤菌,分装存于-20度
粉末
PBS10ml
(三)利用His-tag从细菌中纯化蛋白配方
透析液配方
终浓度
母液浓度
量取体积
Tris-HCl(pH:
20mM
1M
20ml
NaCl
20mM
4M
5ml
MgCl2
2mM
1M
2ml
DTT
1mM
1M
1ml
甘油
50%
500ml
ddH2O
472ml
●超声裂解液(lysisbuffer):
2011年做蛋白纯化时用
Na3PO4(164)(50mM)
NaCl17.55g(300mM)
加800mLddH2O溶解,用2MNaOH或者2MHCL调pH到,再定容到1升。
配好后用高压蒸气灭菌后常温保存。
●洗涤液(washbuffer):
2011年做蛋白纯化时用
Na3PO4(50mM)
NaCl17.55g(300mM)
咪唑0.681g(10mM)
加800mLddH2O溶解,根据开始的pH用2MNaOH或者2MHCL调pH到,调好pH再定容到1升
●洗脱液(elutionbuffer):
2011年做蛋白纯化时用
Na3PO4(50mM)
NaCl17.55g(300mM)
咪唑17.025g(250mM)
加800mLddH2O溶解,根据开始的pH用2MNaOH或者2MHCL调pH到,调好pH再定容到1升)
PrepEase®Histidine-TaggedProteinPurificationKits-HighSpecificity
●8XLEWBuffer(Lysis-Equilibrium-WashBuffer):
(室温保存)pH:
6.2404g(400mM)
NaCl14.0256g(2.4M)
dH20定容到100mL(调节pH:
)
●4XElutionBuffer:
(室温保存)pH:
3.1202g(200mM)
NaCl7.0128g(1.2M)
咪唑6.81g(1M)
dH20定容到100mL(调节pH:
)
●EDTA:
(100mM)
EDTA2.923g
dH20定容到100mL
●NiSO4:
NiSO4.6H2O(100mM)
dH20定容到100mL
●溶菌酶:
(使用时1ml溶液加入20ul)
粉末50mg
ddH201mL
(四)利用His-tag从细胞中富集蛋白配方
●磷酸钠缓冲液
按图示比例混合MNa2HPO4溶液和MNaH2PO4溶液,得到两种缓冲液,pH分别调节成为和.
pH
MNa2HPO4体积/mL
MNaH2PO4体积/mL
●细胞裂解液(最好新鲜配制,当天使用)
Celllysisbuffer
终浓度
配10ml
配15ml
配20ml
配40ml
配30ml
盐酸胍(g)
6M
Tris(g)
10mM
pH(ml)
100mM
5
10
20
15
(注意胍盐是有害试剂注意这里用的磷酸钠缓冲液pH必须!
)
(注意二价阳离子螯合剂,还原剂,会导致镍从树脂上的洗脱)
本实验的所有试剂中EDTA浓度不得超过1mM,DTT浓度不超过5mM,巯基乙醇浓度不超过20mM。
●pH的洗脱溶液(最好新鲜配制,当天使用)
pH的washbuffer
终浓度
配100ml
配50ml
配20ml
配40ml
配30ml
Urea尿素(g)
8M
Tris(g)
10mM
(ml)
100mM
50
25
10
20
15
TritonX-100(ul)
%(vol/vol)
100
50
20
40
30
b-mercaptoethanol.巯基乙醇(ul)
5mM
35
7
14
●pHwashbuffer(现配现用)
pH的washbuffer
终浓度
100ml
配50ml
配30ml
pH的washbuffer
Urea尿素(g)
8M
Urea尿素(g)
Tris(g)
10mM
Tris(g)
(ml)
100mM
50
25
15
(ml)
TritonX-100(ul)
%(vol/vol)
100
50
30
TritonX-100(ul)
注意使用pH为的磷酸缓冲液,而且pH不得低于6,pH要精确配制,非常重要!
Histidine的质子化,会导致镍树脂上的解离,所以要精确测定pH
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- 分子 实验室 细胞 常用 配方