疟原虫检验技术4.ppt
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疟原虫检验技术4.ppt
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疟原虫检验技术疟原虫检验技术重庆市疾病控制中心地寄所重庆市疾病控制中心地寄所课件责任人课件责任人课件责任人课件责任人蒋诗国蒋诗国蒋诗国蒋诗国2010201020102010年年年年9999月月月月血血涂涂片片检检查查疟疟原原虫虫是是诊诊断断和和鉴鉴定定疟疟原原虫虫种种别别的的主主要要方方法法,也也是是疟疟疾疾流流行行病病学学调调查查的的重重要要部部分分,血血涂涂片片制制作作和和染染色色的的好好坏坏足足以以影影响检查的结果,必须把握好响检查的结果,必须把握好“三关三关”。
玻玻片片清清洁洁。
清清洁洁的的玻玻片片无无油油脂脂,无无划划痕痕,无无灰灰尘尘,玻玻片片上上有有油油迹迹,使使厚厚血血膜膜容容易易脱脱落落,薄薄血血膜膜涂涂布布不不均均匀匀。
在在用用手手指指持持玻玻片片时时,只只能能夹夹持持玻玻片片的的两两侧侧边边缘缘,不不要要接接触触玻玻片片的的表表面,以避免手指上的油污染玻片。
面,以避免手指上的油污染玻片。
一、玻片清洁一、玻片清洁新新的的载载玻玻片片先先用用热热肥肥皂皂水水洗洗涤涤,再再用用清清水冲洗,然后用软而洁净的毛巾擦干待用。
水冲洗,然后用软而洁净的毛巾擦干待用。
(一一)新的载玻片的洗涤新的载玻片的洗涤5%5%的肥皂水煮沸法:
的肥皂水煮沸法:
将洗衣肥皂削成小片,加水配成约将洗衣肥皂削成小片,加水配成约5%5%的的肥皂水,煮沸后将玻片一张一张地平放进肥肥皂水,煮沸后将玻片一张一张地平放进肥皂水内,微火煮约一刻钟,然后灭火待肥皂皂水内,微火煮约一刻钟,然后灭火待肥皂水稍冷后,将洁干毛巾擦净后待用。
水稍冷后,将洁干毛巾擦净后待用。
(二二)使用过的载玻片的清洁方法有两种:
使用过的载玻片的清洁方法有两种:
清洁液浸泡法:
清洁液浸泡法:
清洁液配制如下:
清洁液配制如下:
重铬酸钾重铬酸钾8080g浓硫酸浓硫酸100ml100ml水水(清净水清净水)1000ml)1000ml配制时须先将重铬酸钾研细放入水中,慢配制时须先将重铬酸钾研细放入水中,慢配制时须先将重铬酸钾研细放入水中,慢配制时须先将重铬酸钾研细放入水中,慢慢加温到全部溶解为止,然后缓缓加入浓硫酸,慢加温到全部溶解为止,然后缓缓加入浓硫酸,慢加温到全部溶解为止,然后缓缓加入浓硫酸,慢加温到全部溶解为止,然后缓缓加入浓硫酸,待溶液冷却后倒入有盖的大口玻璃缸内。
清洁待溶液冷却后倒入有盖的大口玻璃缸内。
清洁待溶液冷却后倒入有盖的大口玻璃缸内。
清洁待溶液冷却后倒入有盖的大口玻璃缸内。
清洁玻片时,将待洗的玻片逐张放入清洁中浸泡一玻片时,将待洗的玻片逐张放入清洁中浸泡一玻片时,将待洗的玻片逐张放入清洁中浸泡一玻片时,将待洗的玻片逐张放入清洁中浸泡一两天后,取出清水冲洗至完全没有黄色为止。
两天后,取出清水冲洗至完全没有黄色为止。
两天后,取出清水冲洗至完全没有黄色为止。
两天后,取出清水冲洗至完全没有黄色为止。
浸泡前最好用二甲笨除去镜油,清洁液颜色变浸泡前最好用二甲笨除去镜油,清洁液颜色变浸泡前最好用二甲笨除去镜油,清洁液颜色变浸泡前最好用二甲笨除去镜油,清洁液颜色变为墨绿色后即失去清洁作用,不能再用。
为墨绿色后即失去清洁作用,不能再用。
为墨绿色后即失去清洁作用,不能再用。
为墨绿色后即失去清洁作用,不能再用。
二、制片二、制片1.1.薄血膜涂制薄血膜涂制2.2.厚血膜涂制厚血膜涂制薄血膜薄血膜厚血膜厚血膜标记处标记处1.1.薄血膜涂制:
薄血膜涂制:
1.1.薄血膜涂制薄血膜涂制
(1)
(1)先用先用75%75%酒精棉球将耳垂消毒,待酒精干后用采酒精棉球将耳垂消毒,待酒精干后用采血针迅速刺入耳垂近下端边缘处。
血针迅速刺入耳垂近下端边缘处。
(2)
(2)用左手的拇指与食指以及右手的中指向相对的方用左手的拇指与食指以及右手的中指向相对的方向将耳垂轻轻挤压出血。
向将耳垂轻轻挤压出血。
(3)(3)取一张洁净的载玻片,将它的左取一张洁净的载玻片,将它的左1/31/3的表面接触的表面接触耳垂上的血滴(不要将玻片接触耳垂上的皮肤),耳垂上的血滴(不要将玻片接触耳垂上的皮肤),使一小滴血在玻片上。
血量使一小滴血在玻片上。
血量1-1.51-1.5mmmm33.1/4.1/4火柴头火柴头大小。
大小。
(4)(4)(4)(4)将推片置于血溶之前与血液相接触,待血液沿推将推片置于血溶之前与血液相接触,待血液沿推将推片置于血溶之前与血液相接触,待血液沿推将推片置于血溶之前与血液相接触,待血液沿推片边缘展开后,将推片与载玻片保持片边缘展开后,将推片与载玻片保持片边缘展开后,将推片与载玻片保持片边缘展开后,将推片与载玻片保持30303030角度,用力角度,用力角度,用力角度,用力均匀迅速将推片由右向左推出而制成薄血膜。
涂制均匀迅速将推片由右向左推出而制成薄血膜。
涂制均匀迅速将推片由右向左推出而制成薄血膜。
涂制均匀迅速将推片由右向左推出而制成薄血膜。
涂制得较好的薄血膜只有一层血球,血球的分布排列比得较好的薄血膜只有一层血球,血球的分布排列比得较好的薄血膜只有一层血球,血球的分布排列比得较好的薄血膜只有一层血球,血球的分布排列比较均匀,血膜的末端突出如舌状。
较均匀,血膜的末端突出如舌状。
较均匀,血膜的末端突出如舌状。
较均匀,血膜的末端突出如舌状。
若取的血滴太大,则涂制的血膜太宽太厚;若若取的血滴太大,则涂制的血膜太宽太厚;若若取的血滴太大,则涂制的血膜太宽太厚;若若取的血滴太大,则涂制的血膜太宽太厚;若推时用力不均匀,则易成梯田状推时用力不均匀,则易成梯田状推时用力不均匀,则易成梯田状推时用力不均匀,则易成梯田状.若用力太大,则血膜两端过厚,若涂片上有油若用力太大,则血膜两端过厚,若涂片上有油若用力太大,则血膜两端过厚,若涂片上有油若用力太大,则血膜两端过厚,若涂片上有油污,则血膜成多孔状。
污,则血膜成多孔状。
污,则血膜成多孔状。
污,则血膜成多孔状。
薄血膜涂好后,再轻挤耳垂挤出约火柴头大一血薄血膜涂好后,再轻挤耳垂挤出约火柴头大一血滴,将这一滴血滴在玻片的中心滴,将这一滴血滴在玻片的中心1/31/3处然后用推片的处然后用推片的一角由血滴中央向周围旋转涂成直径约一厘米的圆形一角由血滴中央向周围旋转涂成直径约一厘米的圆形血膜,旋转涂制时间不宜过短,以免形成纤维蛋白束,血膜,旋转涂制时间不宜过短,以免形成纤维蛋白束,遮盖了疟原虫。
遮盖了疟原虫。
厚血薄涂好后,应平放待干,防苍蝇舔食血膜厚血薄涂好后,应平放待干,防苍蝇舔食血膜或灰尘落在上面。
受检者的编号可用铅笔或钢笔写在或灰尘落在上面。
受检者的编号可用铅笔或钢笔写在薄血膜的边缘上,也可用蜡笔写在厚血膜一端。
薄血膜的边缘上,也可用蜡笔写在厚血膜一端。
2.2.厚血膜涂制厚血膜涂制血片制作和染色质量规范项目血膜好中差血片制作厚血量位置直径外观4.05.0mm3玻片右1/381.0cm圆形厚膜均匀,边缘整齐略多或略少稍偏右0.70.8或1.01.2cm圆形稍不均不整齐过多或过少偏右过多0.7或1.2cm厚薄不匀影响着色薄血量位置长宽外观1.52.0mm3玻片1/21/3处1.52.0cm舌状厚薄均匀略多或略少稍偏右或偏左稍大或稍小舌状稍不匀过多或过少偏右或偏左过多过大或过小厚薄不匀呈波浪型染色外观镜下兰紫色白细胞疟原虫浆呈兰色,核深红深兰色胞浆淡兰或深兰,核红色红色或灰白色胞浆不易见,核淡红或兰色清洁度外观镜下光洁无油灰无沉渣稍有油污稍有沉渣油灰粘连沉渣多或有杂菌血片制作和染色质量判定标准1.血片制作质量判定标准:
好:
厚薄血膜均好,或薄血膜好,厚血膜中。
中:
薄血膜中,厚血膜好或中。
差:
薄血膜差,或厚薄血膜均差。
2.血片制作和染色合格率要求:
分别以血片制作、染色和清洁度的好、中、差合并计算合格率。
(1)血片制作合格率应在85%以上。
(2)染色合格率应在85%以上。
(3)清洁度合格率应在80%以上。
三、染色三、染色常用的染色方法有姬姆萨氏和瑞氏两种常用的染色方法有姬姆萨氏和瑞氏两种(一一)吉氏染色法:
吉氏染色法:
吉氏染剂是最可靠的血膜染剂,其优点是吉氏染剂是最可靠的血膜染剂,其优点是易于掌握很少染色过度,染好后的血膜褪色较易于掌握很少染色过度,染好后的血膜褪色较慢慢.吉氏染剂粉吉氏染剂粉吉氏染剂粉吉氏染剂粉0.50.50.50.5gg甘油(中性)甘油(中性)甘油(中性)甘油(中性)25ml25ml25ml25ml甲醇甲醇甲醇甲醇(纯,分析纯)纯,分析纯)纯,分析纯)纯,分析纯)25ml25ml25ml25ml将吉氏染剂粉将吉氏染剂粉将吉氏染剂粉将吉氏染剂粉0.50.50.50.5置于乳钵中,加少许甘油充分研置于乳钵中,加少许甘油充分研置于乳钵中,加少许甘油充分研置于乳钵中,加少许甘油充分研磨,再加甘油研磨,直至磨,再加甘油研磨,直至磨,再加甘油研磨,直至磨,再加甘油研磨,直至25ml25ml25ml25ml甘油加完为止。
将充甘油加完为止。
将充甘油加完为止。
将充甘油加完为止。
将充分研磨的吉氏甘油液倒入无水,干净的棕色玻塞瓶分研磨的吉氏甘油液倒入无水,干净的棕色玻塞瓶分研磨的吉氏甘油液倒入无水,干净的棕色玻塞瓶分研磨的吉氏甘油液倒入无水,干净的棕色玻塞瓶中,然后分次加甲醇于乳钵洗出染剂倒入瓶中,直中,然后分次加甲醇于乳钵洗出染剂倒入瓶中,直中,然后分次加甲醇于乳钵洗出染剂倒入瓶中,直中,然后分次加甲醇于乳钵洗出染剂倒入瓶中,直至至至至25252525甲醇将乳钵洗净并全部倒入瓶中,塞紧,充分甲醇将乳钵洗净并全部倒入瓶中,塞紧,充分甲醇将乳钵洗净并全部倒入瓶中,塞紧,充分甲醇将乳钵洗净并全部倒入瓶中,塞紧,充分摇匀,放置室内一星期,每天摇动数次,以后即可摇匀,放置室内一星期,每天摇动数次,以后即可摇匀,放置室内一星期,每天摇动数次,以后即可摇匀,放置室内一星期,每天摇动数次,以后即可使用使用使用使用.1.1.吉氏染剂的配制:
吉氏染剂的配制:
为了保证染色良好,使疟原虫的红核和兰胞浆分明,为了保证染色良好,使疟原虫的红核和兰胞浆分明,感染的红血球上的薛氏小点清楚,在稀释染剂原液时,感染的红血球上的薛氏小点清楚,在稀释染剂原液时,所用的蒸馏水必须加缓冲液(缓冲蒸馏水)。
新鲜蒸馏所用的蒸馏水必须加缓冲液(缓冲蒸馏水)。
新鲜蒸馏水可能接近中性,但贮存在一个时期后,由于吸收了空水可能接近中性,但贮存在一个时期后,由于吸收了空气中的二氧化碳而变为酸性,因此蒸馏水中必须加缓冲气中的二氧化碳而变为酸性,因此蒸馏水中必须加缓冲液,使其达到我们需要的酸碱度。
液,使其达到我们需要的酸碱度。
2.2.缓冲液的配制缓冲液的配制;磷酸氢二钠(无水)磷酸氢二钠(无水)磷酸氢二钠(无水)磷酸氢二钠(无水)9.5g9.5g9.5g9.5g蒸馏水蒸馏水蒸馏水蒸馏水1000ml1000ml1000ml1000ml磷酸二氢钾磷酸二氢钾磷酸二氢钾磷酸二氢钾9.07g9.07g9.07g9.07g蒸馏水蒸馏水蒸馏水蒸馏水1000ml1000ml1000ml1000ml将上二液分别贮存于紧塞的玻瓶中。
将上二液分别贮存于紧塞的玻瓶中。
将上二液分别贮存于紧塞的玻瓶中。
将上二液分别贮存于紧塞的玻瓶中。
缓冲液配制:
缓冲液配制:
稀释染剂所用的蒸馏水的稀释染剂所用的蒸馏水的phph以以7.0-7.27.0-7.2为最适宜,现用为最适宜,现用现配,可按下表配制:
现配,可按下表配制:
缓冲蒸馏水的配制(缓冲蒸馏水的配制(mlml)phph磷酸二氢钠液磷酸二氢钾液蒸馏水磷酸二氢钠液磷酸二氢钾液蒸馏水6.66.6373763639009006.86.8494951519009007.07.0636337379009007.27.2737327279009007.47.481811919900900在在无无条条件件的的地地方方,此此时时也也可可用用当当地地的的饮饮用用水水煮煮沸沸过过滤滤后后试试染染,试试染染结结果果如如淋淋巴巴细细胞胞的的胞胞浆浆呈呈兰兰色色红红血血球染色不很兰就可使用。
球染色不很兰就可使用。
3.3.染色步骤染色步骤:
固固定定:
用用吉吉氏氏染染液液染染色色须须先先将将薄薄血血膜膜用用甲甲醇醇或或无无水水酒酒精精
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