分子实验操作步骤.docx
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分子实验操作步骤.docx
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分子实验操作步骤
实验室操作规范
CTAB法提取水稻基因组DNA
1、将2%CTAB抽提液放置于65℃水浴锅ZHWY-110X中预热(用温度计测实际温度为准目前实验室水浴锅温度调至61℃即可)水浴锅中要加蒸馏水没过加热圈,以浸没离心管中液面高度为宜。
2、将少量新鲜稻叶(芽)折迭后疏松地置于预冷的2ml离心管中。
叶片应尽量摘取嫩叶长约3-4cm,宽约1cm,(切勿贪多,如太多很难磨碎)按Z字形折叠后,用镊子装入离心管的中下部,不能将叶片一长条直接装入,否则叶片会紧贴管壁无法研磨;也不能折叠地太实,否则经液氮冷冻后会成一实体,很难磨碎。
用种子提取DNA时,要先把种子剥皮后,置于研钵中(目前机器研磨仪还不能有效地将种子研磨碎),倒入液氮没过种子,迅速用研磨棒快速研碎,然后将磨碎的种子粉末分装至1.5ML离心管中,大约装至1/4离心管高度为宜。
3、往离心管中加入2个干净的直径4mm的钢珠在叶片的上方,(钢珠可先用70%酒精清洗,直到干净不掉色,无油腻感为宜)注意叶片不能将珠子卡住。
将离心管装入48孔冷冻模块,投入液氮里面冷冻约5分钟(冷冻时间不宜过长,否则离心管会被冻坏,离心管盖经研磨后易破裂),液氮的液面须没过离心管。
迅速将模块平衡夹紧地固定在Geno/Grinder研磨仪上(用于夹紧的垫片共有6片,其中自制塑料泡沫4片,1白,3红;研磨仪配套塑料垫片2片蓝色。
从下往上对齐依次放置白色塑料泡沫、两个并排48孔冷冻模块、三个红色塑料泡沫垫片、两个并排蓝色垫片,盖上盖子),注意夹紧,否则会转飞。
转速1130r/min,时间50s。
4、研磨好后,可将各个离心管转至100格冷冻盒里(要选用先前用过水浴的100格冷冻盒),离心管可开盖隔排放置,便于加药品。
将离心管按顺序排好后,往各管中加已预热好的650ulCTAB抽提液,然后盖好离心管盖,(切记要盖好,否则在之后的实验中会漏药品)用力摇动,以使研磨的碎末与CTAB溶液相溶。
将装有离心管的100格冷冻白孔板用蓝色盒底及橡皮筋捆绑牢固后,置于65℃水浴锅中温育40min以上,20r/min震荡温育。
每10分钟拿出来人工摇匀一次。
如发现离心管有漏的,药品流入水浴锅中的水里,记得做完实验后要把脏水放掉,换干净的蒸馏水,以备下次实验用。
(水浴锅里的水应加蒸馏水,严禁加自来水,自来水脏,易生水垢,影响导电加热)
5、从水浴锅中取出离心管,稍微冷却至室温,加入800ul的氯仿:
异戊醇(24:
1)混合液,盖好盖子,置入100格冷冻盒里,用橡皮筋固定好后,用手翻转摇匀15分钟,直到上层乳白色,下层黑绿色。
(如果临时没空手摇可将其置于QT-3多功能摇床上,100r/min震荡30min以上,期间应每10min拿起来人工摇匀)。
6、在小离心机1-15P上12000r/min离心10min后,小心吸取400ul(若不足400ul可用无水乙醇补足)上清液转移到新的灭菌1.5ml离心管中。
使用离心机一定要先对称配平方可开始离心。
吸上清时小心避免吸到两相液面中间的那层沉淀,条件允许时需提前将蓝色的枪头剪去尖头后再灭菌使用,剪去尖尖的一头即可,也不易剪太多,太多会导致吸不起来上清液。
7、往各上清离心管中加入800ul冰冻预冷的无水乙醇,盖好盖子,小心轻缓混匀,置于-20℃冰箱两小时以上或者过夜沉淀DNA。
8、小离心机1-15P上10000r/min离心8min,小心弃上清,注意勿将白色DNA沉淀倒出。
在纸巾上稍吸干管口水分。
9、加入800ul70%乙醇,轻轻混匀,静置20min后,弃上清,在纸巾上倒吸残余水分。
若沉淀较脏,可洗两次。
10、将离心管直立,置于超净工作台内自然风干DNA。
至离心管壁没有水珠,管底几乎没有水分,DNA透明即可。
DNA若不干或太干影响后续实验。
不干影响DNA纯度,太干DNA溶解慢,易断裂。
11、加入100ul灭菌高纯水(或者是TE)使DNA溶解(一定要充分溶解,底部无
沉淀,若有沉淀,又急着实验用,可用手弹离心管底加速其溶解,不可用震荡仪震荡,否则DNA易断裂),做好标记,4℃冰箱保存备用,若长期保存须贮存于-20℃。
SSR扩增反应
PCR反应
反应试剂
贮存液浓度
终浓度
1个反应加入量
灭菌超纯水
——
——
4.3ul
PCRbuffer(不含Mg2+)
10×
1×
1ul
dNTP
2.5mM
0.1mM
0.4ul
Mg2+
25mM
15mM
0.6
正向引物*
10uM
0.25uM
0.25ul
反向引物
10uM
0.25uM
0.25ul
Taq酶*
5U/ul
1U/10ul
0.2ul
DNA模板
2ng/ul
6ng/10ul
3.0ul
反應試劑
終濃度
8%PAGE
蒸餾水
——
55ml
50×TAE緩衝液
0.5×
0.6ml
40%丙烯醯胺
8%
14ml
10%APS
0.10%
0.
本实验采用的均是10ul反应体系,配制体系时,先配总管充分震荡混匀后再分装至单孔(配总管时应比实际做的量要多出几管),加样的顺序为最先加水,然后是buffer,接着Mg2+,dNTP,正反向引物,Taq酶。
模板在配制体系前直接加至PCR板孔里,待体系加入后放至SIGMA2-16K离心机2000r/min30s离心混匀,在所有成分都加完之后,再往每个反应体系中加一滴矿物油(不要加太多,能盖住体系液面2mm即可)防止混合体系的蒸发。
注意:
根据实际情况也可将引物的量加倍或者减倍,相应的加入水的量减少或增加。
若带厚粗细可适当减少DNA模板浓度,亦可减少引物量;若带暗可适当增加DNA模板浓度,亦可增加引物量。
加酶时枪头刚接触液面即可,严禁伸入液面过多,酶应当是体系中最后加入的成份,且加酶后,后续的操作要快且在冰上进行,因酶在室温易失活。
PCR反应程序
反应程序:
94℃预变性5分钟
35个循环94℃变性30秒
55℃退火30秒
72℃延伸45秒
72℃补充延伸7分钟,
4℃保温,1小时内取出
退火温度可根据实际情况调整。
实际操作中以PTC-100为例,进入主菜单选择文件夹LYQ,选择new1运行程序即可(本程序目前适用SSR扩增反应,若产物片段大还需再摸索该程序是否可用)。
PCR结束后应尽快将PCR板拿出PCR仪,再用100ul电子枪每孔加入2.2ul6Xloadingbuffer,低速2000r/min离心30s混匀,放至4℃待用。
PAGE电泳
将SSR标记的PCR扩增产物通过8%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
1、将洗净的玻璃长、短板(U型板)平放在操作台上,用95%酒精擦洗干净,晾干,注意标记好正反面。
(玻璃板一定要用纯水洗干净,切勿残留洗洁精,否则拍照时背景会有洗洁精残留物染色后留下的白点)
2、分别将两片垫片整齐地放在长板两侧后(垫片与U型板上端对齐),然后相应的把短板放在上面,使两块板上面边缘对齐,用夹子在两端夹好,使夹子夹住垫片,将板水平放在操作台上。
注意:
擦洗酒精的那两面朝里。
在叠放时,两块板之间,垫片与板之应齐上不齐下。
3、
反应试剂
终浓度
8%PAGE
40%丙烯酰胺
8%
7ml
高纯水
——
27.5ml
50×TAE缓冲液
0.5×
0.3ml
10%APS(催化剂)
0.10%
0.3ml
TEMED(加速剂)
0.0833ul/ml
25ul
总量
——
35.0ml
配制35ml(一板的量)8.0%聚丙烯酰胺凝胶,混合均匀,从U型板U口的一端开始小心倒胶,液面达到两板下端时,开始推着液面往另一端缓缓的边倒边走,直到充满整个板为止。
为防止气泡出现,一定要小心慢倒,若有气泡产生小心用细长软塑料片轻轻将气泡沿着一个方向赶出,然后插入鲨鱼齿状梳子,梳子不应全部插入,应留2mm左右。
静置10-15min(天气冷应适当延长时间,并用取暖器加温)使胶充分聚合。
(若冬天则将APS及TEMED的量加倍)
配方如下:
配胶时加样顺序为高纯水,40%丙烯酰胺,50XTAE,10%APS,TEMED。
TEMED加完后应尽快倒胶,否则很快就会自行凝固,若不是立即倒胶则可先不加TEMED。
若做多板胶,可先将除TEMED成分外,制胶的其余成分先加好混匀后,再分成1板或2板量分别加TEMED,然后尽快倒胶。
注意:
丙烯酰胺浓度可根据分离产物大小进行调整。
丙烯酰胺(%)有效分离范围(bp)溴酚兰*二甲苯青*
3.5100~2000100460
5.080~50065260
8.060~40045160
12.040~2003070
15.025~1501560
20.010~1001245
4、在电泳槽下槽加入约下槽半高深度的1×TAE缓冲液,能没过胶版底部即可,前后轻轻晃动电泳槽除去底部气泡;(缓冲液无论新旧都要充分混匀后才可电泳用)
5、将已经完全聚合玻璃板胶去除两侧夹子,放到电泳槽内外两侧,注意长板在外短板在内,放置时先将一头浸入缓冲液再缓缓的放下另一头。
两侧靠上端用夹子固定(这里使用的夹子与前面所使用的夹子不是同一种,不要混淆使用)防止上槽缓冲液漏出。
6、向上层电泳槽中倒入部分1×TAE缓冲液,以没过梳子孔2cm为宜,轻轻抓住梳子两端,用力均匀地缓慢水平拔出(一定要在上端电泳槽倒入缓冲液后再拔梳子)。
7、吸取1.5ul样品依次点到凝胶上样孔中,注意,每上完一个样品均要清洗一下tip吸头,枪头内无蓝色的残留即可。
加marker时应换干净的洗头。
(加样品量可视产物浓度而定,有的产物浓度较高,可适当减少上样量,条带会细些。
)
8、插上电极,接通电源(注意电极切勿插反),调恒压100V(电压可调整)(若是新手点样较慢,防止上样孔扩散,点完一板可加大电压约120V跑5min待样完全跑出上样孔入胶后再点对侧的另一板。
点完后要根据PCR产物片段大小调整电泳时间。
时间长短可依样品间大小差异而定,例如,两个亲本大小相差较大,跑半小时就能分开。
相反差异很小的,可延长电泳时间至2-3小时。
另外每次将电泳时所用的电压,时间,预产物大小记录在笔记本上,发送结果时一并标明。
9、电泳完毕之后,关闭电泳仪电源,拔下电极,去除夹子,用小铲轻轻撬开玻璃板,并在点样开始端做标记,小心地将胶放在加有1×TAE缓冲液染液的染色槽中,缓冲液不宜太多,以能没过胶为准。
按每板5ul的量加入Genefinder染液,50r/min避光振荡染色30-50min;
10、轻轻用手托起凝胶的两端,置于凝胶成像系统下,注意做标记的一端放在左边,打开成像系统的电源,电脑电源,运行拍照软件ScionVisCapture。
11、拍照说明:
软件打开后,先预览图像,待位置调整好后,菜单栏点击Image下拉菜单点击snap,软件状态变成processed时,用鼠标选取需要保存的区域,在菜单栏点击file,选择saveselectionas,将图片保存至E:
\2011年中与自己名字相对应的档夹,如实习生将图片存至E:
\2011年\shixisheng,(请勿再另外新建档夹),图片保存时命名方式应与笔记本上记载的统一。
打开D盘,右键选择2011年公文包,点全部更新即可,拷贝图片自行准备无毒U盘。
常用药品配制
2%CTAB抽提液500ml
CTAB(2%)10g
NaCl(1.4mol/L)40.9g
EDTA.Na2.2H2O(20mM)3.7g
Tris-Base(100mM)6.05g
先加400ml蒸馏水,pH调至8.0。
再加蒸馏水
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