泸医免疫实验指导.docx
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泸医免疫实验指导
医学免疫学实验指导
供基础、预防、口腔、麻醉、药学、临床医学类专业用
泸州医学院
二零零六年六月
目录
机体的天然免疫…………………………………………………………………………………()
实验一、溶菌酶的溶菌作用………………………………………………………………()
实验二、中性粒细胞的吞噬作用…………………………………………………………()
实验三、巨噬细胞的吞噬作用……………………………………………………………()
凝集反应…………………………………………………………………………………………()
实验四、直接凝集反应……………………………………………………………………()
实验五、间接凝集反应……………………………………………………………………()
沉淀反应…………………………………………………………………………………………()
实验六、环状沉淀反应……………………………………………………………………()
实验七、单向免疫扩散试验………………………………………………………………()
实验八、双向免疫扩散试验………………………………………………………………()
实验九、对流免疫电泳试验………………………………………………………………()
实验十、火箭免疫电泳试验………………………………………………………………()
实验十一、免疫电泳试验…………………………………………………………………()
补体参与的反应…………………………………………………………………………………()
实验十二、补体结合试验…………………………………………………………………()
实验十三、总补体活性测定………………………………………………………………()
实验十四、免疫荧光技术…………………………………………………………………()
实验十五、流式细胞术……………………………………………………………………()
实验十六、酶联免疫吸附试验……………………………………………………………()
实验十七、放射免疫测定法………………………………………………………………()
免疫细胞的检测…………………………………………………………………………………()
实验十八、外周血单个核细胞的分离与纯化……………………………………………()
实验十九、E玫瑰花结试验………………………………………………………………()
实验二十、溶血空斑试验…………………………………………………………………()
变态反应…………………………………………………………………………………………()
实验二十一、动物过敏试验………………………………………………………………()
实验二十二、肥大细胞过敏试验…………………………………………………………()
综合性试验………………………………………………………………………………………()
实验二十三、T淋巴细胞亚群的检测……………………………………………………()
实验二十四、T淋巴细胞转化试验………………………………………………………()
实验二十五、人体外周血中NK细胞活性检测…………………………………………()
设计性试验………………………………………………………………………………………()
实验二十六、可溶性抗原定量检测的设计…………………………………………………()
机体的天然免疫
(Naturalimmuneoforganism)
内容:
一、溶菌酶的溶菌作用
二、中性粒细胞的吞噬作用
三、巨噬细胞的吞噬作用
机体先天遗传形成的天然免疫力具有非特异性保护作用,主要由机体正常生理屏障、正常体液杀菌物质(如溶菌酶)、大小吞噬细胞与自然杀伤细胞(NK)等共同构成。
试验一、溶菌酶的溶菌作用
溶菌酶(lysozyme)主要由吞噬细胞合成并分泌的一种小分子蛋白质,属乙酰氨基多糖酶。
它的等电点高(PH11.0),能与细菌牢固的结合,并裂解肽聚糖中N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1,4糖苷键,使细菌溶解死亡。
革兰氏阴性菌肽聚糖层少,又有外膜保护,故在一般情况下不受溶菌酶的影响。
溶菌酶广泛分布于机体的组织、体液与分泌液,其中泪液含量最高,约血清的100~150倍。
临床慢性支气管炎,局部免疫功能降低,唾液中溶菌酶低于正常,各种类型的白血病患者血清和尿中溶菌酶含量有所增加。
【材料】
⒈唾液、泪液(或乳汁)、标准溶菌酶(1ng/ml)、生理盐水、2~5%琼脂盐水。
⒉细球菌(M.lysodeikticus)。
标准溶菌酶
⒊毛细吸管、打孔器(或滤纸片)、无菌平皿等。
生理盐水
【方法】
唾液
⒈取一无菌平皿,倾入5ml细球菌悬液,再倾入5ml已溶化的2.5%琼脂盐水,迅速混匀,平放待凝。
泪液
⒉用打孔器按图所示打孔,挑去孔内琼脂,用毛细吸管分别加唾液、泪液(或乳汁)、标准的溶菌酶和生理盐水(或用无菌圆形滤纸片分别蘸取上述四种液体,按
图所示贴于平皿表面)。
⒊37℃过夜,观察结果。
图溶菌酶试验示意图
【结果】
孔周或滤纸片周围出现的透明圈即为溶菌环。
注意比较溶菌环的大小。
【注意事项】
⒈加样时,样品避免溢出孔外,孔内不应有气泡。
⒉作定量检测时,先要用标准品制备标准曲线,然后根据环的直径及标准曲线求出样品含量。
⒊标准曲线绘制后,每次检验样品时,最好在同一平皿上备有标准品的对照,以资比较。
【思考题】
溶菌酶的溶菌作用有什么生物学意义?
【附录】
1细菌悬液的配制:
无菌吸取5mlPH6.4,1/15MPBS加到细球菌培养管中,置室温5~10分钟。
旋转培养管,制成菌悬液。
用分光光度计(波长640nm)测定并调整细菌细胞浓度达到透光率为30~40%。
2溶菌酶标准液的配制:
称取溶菌酶标准纯品,PH6.4,1/15MPBS配成1000ug/ml(1ng/ml),置冰箱冻存。
临用时再稀释成100,50,25,10ug/ml。
3标准曲线的绘制:
⑴取一无菌平皿(直径9cm),倾入7.5ml细球菌悬液,再倾入7.5ml已溶化的2.5%琼脂盐水,迅速混匀,平放待凝。
⑵凝固后,用打孔器打孔,孔间距约1.5cm,每平皿可打孔8~9个。
⑶各孔内依次加入不同浓度的溶菌酶标准品,每孔20ml。
⑷置于37℃,18~24小时。
测量溶菌环的直径。
⑸以溶菌酶标准品的浓度为纵坐标(对数坐标),溶菌环直径为横坐标,在半对数坐标上绘制标准曲线。
试验二、中性粒细胞的吞噬作用
(Phagocytosisofneutrophilicgranulocyte)
本实验将中性粒细胞与可被吞噬而又易于计数的颗粒物质(如金黄色葡萄球菌)混合孵育一定时间后,颗粒物质被中性粒细胞吞噬。
计算吞噬率和吞噬指数,因此,反映该细胞的吞噬功能。
【材料】
1豚鼠。
⒉葡萄球菌悬液。
⒊3.8%枸橼酸钠溶液、无菌注射器和针头、试管、毛细吸管、瑞氏染料、载玻片等。
【方法】
⒈采集豚鼠心脏血1~2ml或取人外周抗凝血2ml,加入到装有3.8%枸橼酸钠0.2ml的试管中,迅速混匀。
⒉加入葡萄球菌悬液一滴,混匀。
37℃恒温箱内静置30~60分钟。
⒊用毛细吸管从白细胞层(即沉淀的红细胞表面)吸取白细胞悬液,加一滴于载玻片一端,作推片,自然干燥。
⒋Wright染色:
⑴标本自然干燥后,加瑞氏染液2~3滴于标本的涂膜上,染色1分钟。
⑵加等量PBS与染液混合均匀,染色5~8分钟。
⑶冲去染液。
水冲时为防止染液粘附于涂膜,不能先倾倒掉染液,而要边冲边慢慢倾斜载玻片,直至染液冲尽。
⑷干燥后油镜下观察。
计算中性粒细胞的吞噬百分率及吞噬指数。
【结果】
油镜下见中性粒细胞核呈深紫红色,分叶明显,胞浆呈淡红色,细菌被吞入胞浆,呈紫色。
随机数100个中性粒细胞,分别计数吞噬有细菌的中性粒细胞数和所吞噬的细菌总数,按照下列公式,计算出吞噬百分率和吞噬指数。
100个中性粒细胞中吞噬细胞的中性粒细胞数
吞噬百分率=────────────────────×100%
100(中性粒细胞数)
100个中性粒细胞吞噬的细菌总数
吞噬指数= ─────────────────
100(中性粒细胞数)
【注意事项】
⒈所用器材要洁净。
⒉愈接近片子末梢细胞数愈多,计数时应取片子前、中、后三段计数,以提高准确性。
试验三、巨噬细胞的吞噬作用
(Phagocytosisofmacrophage)
巨噬细胞对颗粒性物质具有强大的吞噬作用。
将待测巨噬细胞与吞噬颗粒(如鸡红细胞、酵母细胞等)混合温育一定时间后,颗粒物质可被巨噬细胞吞噬。
根据吞噬百分率和吞噬指数可反映巨噬细胞的吞噬功能。
【材料】
⒈豚鼠。
⒉5%淀粉肉汤液、Hank's液、5%鸡红细胞悬液、无菌注射器和针头、毛细吸管等。
⒊瑞氏染液。
【方法】
⒈实验前1天,给豚鼠腹腔内注射5%淀粉肉汤液6ml。
⒉实验当天,给豚鼠腹腔内注入Hank's液6ml或重复注射5%淀粉肉汤液一次,轻柔腹部。
⒊1小时后,给豚鼠腹腔内注射洗涤过的5%鸡红细胞悬液3ml,轻柔腹部。
⒋2小时后,用注射器抽取腹腔内的液体,制成推片,自然干燥后作瑞氏染色,油镜观察。
【结果】
油镜下可见巨噬细胞核成深紫红色,胞浆着色浅,呈灰蓝色,被吞噬的鸡红细胞胞浆呈红色,核呈蓝色。
一个以上的鸡红细胞,巨噬细胞核常被挤在细胞的边缘。
随机计数200个巨噬细胞,分别计数吞噬有鸡红细胞的细胞数和所吞噬的鸡红细胞总数。
按下列公式分别算出吞噬百分率和吞噬指数。
200个巨噬细胞中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数
吞噬百分率=────────────────────×100%
200(巨噬细胞数)
200个巨噬细胞吞噬的鸡红细胞总数
吞噬指数= ─────────────────
200(巨噬细胞数)
【注意事项】
⒈鸡红细胞为有核的椭圆形细胞,被巨噬细胞吞噬于胞浆内,随着取腹腔液推片时间延长,鸡红细胞的形象逐渐模糊不清,提示逐渐被消化。
因此,必须掌握好时间。
⒉计数应不少于200个巨噬细胞。
计数少影响结果的可靠性。
【思考题】
1.为什么吞噬细胞是机体抗感染的重要防线?
如果吞噬功能丧失,对机体有什么影响?
2.检测吞噬细胞的吞噬作用是否全面反映机体的吞噬功能?
为什么?
凝集反应
内容:
四、直接凝集反应
(一)玻片凝集反应—细菌的鉴定、ABO血型鉴定
(二)试管凝集反应
五、间接凝集反应
(一)正向间接凝集反应—间接凝集乳胶试验、间接血凝试验
(二)反向间接凝集反应—反向间接血凝试验、协同凝集试验
(三)间接凝集抑制试验
试验四、直接凝集反应
(Directagglutinationreaction)
细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原,在适当电解质参与下直接与相应的抗体结合形成肉眼可见的凝集块,称为直接凝集反应。
常用的直接凝集试验有玻片法和试管法两种。
㈠玻片凝集反应(Slideagglutinationtest)
玻片凝集反应是将已知的抗体直接与未知的颗粒性抗原物质(如细菌,红细胞等)在玻片上混合,在有适当的电解质存在的条件下,如两者对应便发生特异性结合,形成肉眼可见凝集物,即为阳性;如两者不对应,便无凝集物出现,即为阴性。
此法属定性试验,主要用于细菌鉴定和分型、人类红细胞ABO血型的鉴定等。
1细菌的鉴定:
【材料】
⑴1∶20稀释的伤寒杆菌的诊断血清。
⑵伤寒杆菌、大肠杆菌18~24小时培养物、生理盐水。
⑶洁净载玻片、接种环、酒精灯、记号笔等。
【方法】
⑴取洁净载玻片一张,用记号笔划分为三格,并依次编号为1、2、3。
⑵用灭菌的接种环取生理盐水于玻片的三格内,各加2~3环。
⑶将接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌,冷却后自平皿挑取少量大肠杆菌置于第2格生理盐水中混匀。
然后,同法分别取少许伤寒杆菌于第1格及第3格,与生理盐水混匀。
⑷用灭菌接种环于第2格加伤寒杆菌诊断血清2~3环并混匀,同法取伤寒杆菌诊断血清2~3环,加于第1格中混匀。
⑸轻摇玻片,静置1~2分钟后,观察结果,
【结果】
如上述混合悬液由均匀混浊状变为澄清透明,并出现大小不等的乳白色凝集块者为阳性;如混合物仍呈均匀混浊,无凝集物者为阴性。
【注意事项】
⑴每一待检菌均须作生理盐水对照,如对照凝集则表示细菌发生自凝,试验无效。
⑵取细菌培养物时,不宜过多。
与诊断血清或生理盐水混合时,必须将细菌涂散,涂均匀,但不宜涂得太宽,以免很快干涸而影响结果。
⑶伤寒杆菌为肠道致病菌,在实验中务必严格无菌操作,遵守实验规则,用后的载玻片应立即放入盛有消毒剂的容器内。
⒉ ABO血型鉴定
【材料】
⑴抗A标准血清、抗B标准血清。
⑵载玻片、采血针、碘酒和酒精棉球、牙签、生理盐水、毛细吸管等。
【方法】
⑴取洁净载玻片一张,用记号笔分为两格,于上角分别注明A、B字样。
⑵用毛细吸管取生理盐水于玻片的两格内各加一滴。
⑶用碘酒酒精棉球消毒耳垂或手指尖,采血1~2滴混入玻片上的生理盐水中,迅速用牙签混匀,制成血球悬液。
⑷ 在两格血球悬液中分别加抗A标准血清和抗B标准血清一滴,分别用牙签两端搅拌混匀,2~5分钟后摇晃玻片,观察结果。
?
【结果】
混合液由均匀红色混浊状逐渐变为透明,并出现大小不等的红色凝集块者即为红细胞凝集;若混合液仍呈均匀混浊状,无凝集块,则表明红细胞未发生凝集。
血型鉴定试验结果及鉴定见表
表血型鉴定试验结果判定
诊断血清
血型抗A抗B
A+-
B-+
AB++
O--
“+”表示凝集“-”表示不凝集
【注意事项】
⑴试验用载玻片要清洁,并务必注明A和B字样。
⑵待检红细胞悬液不宜过稀或过浓。
⑶要及时观察结果,以防时间过长使标本干涸而影响结果的观察和判定。
㈡试管凝集试验
本试验是用已知的颗粒性抗原来检测未知的抗体及其相对含量,此法属定量试验。
方法是用生理盐水将待测血清在试管中进行连续倍比稀释,然后于各管中加入等量的已知抗原悬液,经过一定时间后,观察有无凝集并根据凝集程度判定血清抗体的效价。
【材料】
⒈伤寒杆菌H菌液。
⒉伤寒杆菌免疫血清(1∶10稀释)。
⒊生理盐水、小试管、试管架、1ml和5ml刻度吸管等。
【方法】
⒈取洁净小试管8支列于试管架上,依次编号。
⒉用5ml吸管吸取生理盐水,每管内加入0.5ml。
⒊用1ml吸管吸取待检血清0.5ml加入第1管,吹吸3次,充分混匀后,吸出0.5ml加入第2管,如上依次稀释至第7管,自第7管吸出0.5ml弃去。
第8管不加血清作为对照管。
见图
4.用5ml吸管吸取伤寒杆菌菌液,从第8管起向前加,每管加入0.5ml。
5.摇匀后,置室温或37℃24小时后,观察结果。
操作程序见表
表试管凝集试验操作程序(单位:
ml)
12345678
生理盐水0.50.50.50.50.50.50.50.5
1∶10伤寒杆
菌免疫血清0.50.50.50.50.50.50.5弃去0.5
伤寒杆菌H菌液0.50.50.50.50.50.50.50.5
血清最终稀释度1∶401∶80 1∶1601∶3201∶6401∶12801∶2560对照管
室温或37℃,24h
结果
【结果】
⒈凝集强弱,以下列记号表示:
++++:
管内液体澄清,细菌全部凝集于管底,轻摇有大片凝集块。
+++:
管内液体轻度混浊,细菌大部分凝集于管底,凝集块较小。
++:
管内液体中度混浊,细菌部分凝集于管底,凝集块更细小。
+:
管内液体中度混浊,仅少量细菌凝集。
-:
液体混浊,无凝集。
若放置较长时间观察结果,未凝集的,细菌亦可沉积于管底。
与凝集块沉淀物不同:
前者是个小圆点,边缘光滑整齐,而后者似伞状,铺开沉淀于管底,边缘不整齐。
⒉首先观察第8管(对照管)。
正确结果应是管底沉淀物为圆形,边缘整齐,轻轻振摇,细菌分散呈均匀混浊。
若出现了非特异的凝集,则本试验无效。
⒊试验管应由第1管看起。
H菌液凝集物呈疏松棉絮状,沉于管底,轻摇时易离散和升起。
⒋凝集效价的判定:
与相应菌液发生中等程度(++)凝集的血清最高稀释度为该被检血清的凝集效价,用稀释倍数表示之。
如第1管仍无凝集现象,应报“<1∶40”,如第7管仍是“++”或更强凝集,应报“>1∶2560”。
【注意事项】
⒈抗原、抗体在比例适当时,才能出现肉眼可见的反应。
如果抗体的浓度过高,则无凝集物形成,此为前带现象,需要在测定结果时加以鉴别。
⒉判定结果时,应在暗背景下通过强光检查。
⒊注意温度、PH、电解质、振摇对本试验的影响。
⒋观察结果时,最好不要振摇试管,以免将凝集物摇散而影响他人观察。
试验五、间接凝集反应
(Indirectagglutination)
间接凝集是将可溶性抗原(或抗体)吸附或偶联在一种与免疫无关的载体颗粒表面,使其成为致敏载体,然后与相应抗体(或抗原)结合,在电解质存在的条件下,发生凝集。
根据载体致敏时所用制剂及反应方式,间接凝集反应有以下几种方法:
㈠正向间接凝集反应
将已知可溶性的抗原吸附在载体颗粒表面,与相应的抗体结合所发生的凝集称正向间接凝集反应,见图。
用于检测标本中相应的抗体,如细菌、病毒、螺旋体等以及某些自身抗体(抗核抗体、抗肾抗体、抗甲状腺抗体等)。
可用作载体的物质有乳胶颗粒、红细胞(人O型红细胞、绵羊红细胞、家兔红细胞等)、聚苯乙烯、活性炭及硅酸铝颗粒等。
若所用载体为乳胶颗粒,则称间接乳胶凝集试验,若载体为红细胞,称为间接血凝试验。
下面分别以两者为例进行介绍。
图正相间接凝集反应原理示意图
⒈间接乳胶凝集试验(Indirectlatexagglutinationtest)(玻片法)——检测类风湿因子
类风湿关节炎是一种自身免疫性疾病,患者可产生自身抗体,即类风湿因子(一种抗变性IgG的抗体,多为IgM类抗体)。
检测类风湿因子可辅助诊断此病。
【材料】
⑴待检血清、阳性对照血清、阴性对照血清。
⑵类风湿乳胶诊断试剂(吸附有变性IgG的乳胶颗粒。
将IgG经63℃10分钟处理,可获得变性的IgG)。
⑶载玻片、毛细滴管等。
【方法】
⑴取洁净载玻片一张,用标记笔划分为3格,用毛细滴管分别向3格内加1滴待检血清、阳性对照血清、阴性对照血清。
⑵再分别向3格内加致敏乳胶1滴,用牙签充分混匀后,摇动玻片2~3分钟后,观察结果。
【结果】
以肉眼观察出现凝集为阳性,不出现凝集为阴性。
玻片法为定性测定,也可以用试管法作定量测定。
【注意事项】
⑴试剂应保存在4℃,切勿冻存。
使用前应使试剂接近室温并摇匀。
⑵日光灯光线不利于观察结果。
⒉间接血凝试验(Indirecthemagglutinationtest)
将可溶性抗原(细菌的提取液)吸附于红细胞,成为抗原致敏的红细胞,这种致敏红细胞与相应抗体作用可产生凝集现象。
【材料】
⑴微量血凝板:
V型孔底,8×12孔
⑵稀释棒:
一种特制的小铝棒,下接一不锈钢头,中间有米形小缝,吸取量为25ul。
⑶抗原致敏的红细胞悬液、稀释液等。
【方法】
⑴用微量加样器吸取稀释液,在微量血凝板小孔内各加25ul,每份标本做两排,一排为测定孔,一排为对照孔。
一般将受检血清倍比稀释至1∶64,每块血凝板可同时检测8份标本。
⑵用稀释棒2支蘸取受检血清后,分别加入测定排和对照排的第1孔,双手搓转稀释棒,使孔内血清和稀释液充分混匀,然后将稀释棒移至第2孔,依同法按顺序作对倍稀释。
⑶测定排各加稀释液1滴,对照排各孔加抑制用抗原1滴,放微型振荡器上振荡1~2分钟,盖上一块玻璃板,放37℃保温1小时。
⑷各孔加0.5%抗原致敏的红细胞悬液1滴,放微型振荡器上振荡1分钟,移至室温1~2小时,观察结果。
【结果】
凡红细胞沉积于孔底,集中呈一小圆点的为不凝集。
如红细胞凝集,则分布于孔底周围。
根据红细胞凝集程度强弱,可分为以下4级:
++++:
红细胞形成片层凝集,均匀布满孔底或凝集边缘皱缩如花边状。
+++:
红细胞形成片层凝集,面积略小于++++。
++:
红细胞形成片层凝集,面积较小,边缘较松散。
+:
红细胞沉积于孔底,周围有散在的少量凝集。
-:
红细胞沉积于孔底,呈小圆盘点状,边缘清晰整齐。
阴性标本表现为两排均不凝集。
当两排红细胞孔数相等时,则为非特异性的凝集。
【注意事项】
⑴使用器材必须清洁,特别是血凝板要按规定处理,否则对结果影响大。
⑵受检血清要新鲜。
⑶测定一批标本时,要同时作已知阳性、阴性以及不加受检血清的空白对照。
㈡反向间接凝集反应
用特异性抗体致敏(或吸附于)载体颗粒,用于检测标本中相应的抗原。
见图
⒈反向间接血凝试验(Reversedindirecthemagglutinationtest)
是用已知的抗体致敏红细胞,检测标本中相应抗原。
以检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。
【材料】
⑴1∶20抗-HBs致敏红细胞、纯化的1∶20抗-HBs、待检血清、稀释液。
⑵“V”型微量血凝板,25ul稀释棒、微量搅拌器、刻度吸管、滴管(40滴/ml)
【方法】
⑴配制致敏血球悬液:
于每瓶冻干诊断血球加4ml稀释液,轻轻旋摇使成均匀血球悬液,浓度约为0.6%。
⑵正式试验,加样程序见表
①在“V”型微量血凝板上,每份待检血清设立8孔,于各孔内用40滴/ml滴管各加1滴稀释液(相当于25ul/0.025ml)。
②用25ul容量的稀释棒蘸满待检血清分别依在各孔内,捻转作对倍稀释(一般每孔内均需捻转10次左右),直至第7孔,第8孔为致敏血球对照,另设第9孔为阳性对照,加25ulHBsAg阳性血清。
③于每孔加入25ul混匀的致敏血球悬液。
④将血凝板置于微型振荡器上振荡1~2分钟,置37℃1小时后观察结果:
表反向间接血凝试验加样程序(单位:
ul)
123456789
稀释液2525252525252525—
待检血清25252525252525弃去2525阳性血清
致敏血球252525252525252525
血清稀释度1∶41∶8 1∶161∶321∶641∶1281∶256血球阳性
对照对照
37℃,1h
结果
不凝集:
红细胞全部下沉,集中于孔底,形成致密的圆点。
明显凝集(++)红细胞于孔底形成薄膜状凝集,中央可见疏松的红点。
出现明显凝集(++)的血清最高稀释度为HBsAg效价,凡效价≥1∶16者需进一步做中和试验。
⑶中和试验:
在血凝板上每份标本设测定排和对照排,每排8孔,于每孔加稀释液25ul,用2支稀释蘸被检血清,分别在两排作对倍稀释至第7孔,第8孔不含血清,为血球对照。
然后,于测定排各孔加稀释液25ul,对照排各孔加1∶20抗-H
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