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标准菌验收范本模板
标准菌验收、制备、保藏、传代、使用、销毁的管理
发布日期:
2010-12—31 浏览次数:
4889
核心提示:
介绍了微生物实验中使用的标准菌的验收、制备、保藏、传代、使用、销毁的管理规程规定了质量管理部门实验用标准菌种的验收、制备、储管、使用、以及销毁等的相关规定。
适用于微生物限度检查、无菌检查、抗生素微生物(效价)测定、评价防腐剂和抗菌剂的抑菌效果和确认灭菌效果、检验方法的验证、培养基的适用性检查,样品检验时的阳性对照等.
依据:
中国药典2010年版二部及菌种使用说明书
1。
标准菌的来源
标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心(ChinaMedicalculturecollection,CMCC)提供的冷冻干燥菌种(0代)或由上级药检部门已接种好的菌种斜面(3代)。
黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管.中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签CMCC(B)代表细菌(bacteria),CMCC(F)代表真菌(fungi)每种菌具有固定的代号。
2。
标准菌的验收
从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌,接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。
接收菌种时应检查安瓿的数量和名称,和每一支安瓿的完整性。
在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息,如名称、数量和接收日期等。
在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签,内容包括:
菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至.新购入的0代原始菌种储存于-20℃,有效期为三年。
从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面(3代)应检查菌种管是否完好。
储存于2~8℃,有效期为3个月。
3.标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备
3.1物品及试剂:
接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球
3.2培养基
改良马丁琼脂培养基:
用于黑曲霉复苏、复壮.
液体硫乙醇酸盐培养基:
用于生孢梭菌复苏、复壮。
营养肉汤培养基:
用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮.
改良马丁培养基:
用于白色念珠菌复苏、复壮.
3.3操作步骤:
a.打开洁净工作台.
b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。
c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线,用手轻轻将安瓿掰开(开启安瓿时必须小心,因为安瓿遇热时可能会破裂)。
d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5~0。
8ml到安瓿中。
e。
轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。
f。
用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基.
g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度(细菌培养温度30~35℃,培养18~24小时;真菌培养温度23~28℃,培养3~5天.观察是否浑浊,浑浊说明菌种复苏生长;若不浑浊,细菌应延长培养时间至7天,真菌应延长培养时间至14天,若仍未浑浊,灭菌处理.
h.黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体1~2滴滴在改良马丁琼脂斜面上,用吸管涂布均匀,置23~28℃培养5~7天,斜面正面为黑褐色厚绒状,色泽均一,不应有杂色,斜面侧面无色,接近菌层培养基略带黄色。
确认后用含有0。
05%(ml/ml)的吐温—80的0。
9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。
i。
取经复苏后的上述细菌菌液8—10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮.以无菌技术向复壮后的菌种中加入100ml20%的无菌甘油混匀,1—2ml/管分装于冻存管。
每个菌种制备10支,按顺序进行编号,最后一支做为质控管进行质量控制,即进行相应的确认。
其余作为储备管。
黑曲霉的h项下洗脱液按h项下方法进行复壮,制成复壮后的孢子悬液20ml。
以无菌技术向复壮后的菌种中加入20ml、30%的无菌甘油混匀,1—2ml/管封存于冻存管.制备10支,按顺序进行编号,最后一支做为质控管进行质量控制,即进行相应的确认。
其余作为储备管。
将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。
内容包括:
菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。
j.储备菌种管制备成功,储存于-20℃,有效期为三年。
3。
4菌种确认
用无菌接种环从质控管中取细菌培养物接种到营养琼脂培养基平板上,或相应的宜于该细菌生长的鉴别平板上,划线分离出单个菌落.然后在30~35℃下培养2~3天;同样的方法取真菌到玫瑰红钠琼脂培养基平板,并在23~28℃下培养7天;培养后,观察其菌落形态,应符合该菌种形态特征。
3。
5污染处理
假如在该平板上发现有其他菌落生长,则说明或操作有污染或菌种不纯。
将此被污染了的培养物灭菌处理。
可寻找原因重新分离挑选纯菌落转接斜面菌种作为第四代.并重新制备储备菌种管
3.6菌种的传代与保藏
将菌种接种至一新鲜培养基上,每萌发一次即称为一代,因此,当原始菌种复溶并转至新培养基内生长,即认为已传代一次,从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代,冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第1代,直到第3代为工作菌种。
菌种的传代次数(自原始菌种冻干粉起)不得超过5代。
菌种的传代保藏过程
3.3项下标准菌的复苏为传第一代,复壮为第二代. 传第三代时取1支冻存管自然解冻,将其转接斜面菌种作为工作用菌种。
此时,工作用菌种为第3代。
工作用菌种,分为两类:
一类用于定期传代(W3),一类用于实验用(S3)。
定期传代用菌的传代其操作步骤如下(斜面接种法):
(1)从冰箱冷藏室中取出菌种斜面后,应在室温放置约30分钟。
(2)将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明菌名及接种日期,和传代菌种一并移入洁净工作台,打开紫外灯照射一小时。
(3)关闭紫外灯。
点燃酒精灯,左手握住菌种斜面,将管口靠近火焰上方,右手拿接种棒后端,将接种环烧红约30秒,随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼,往返通过三次。
(4)右手用无名指、小指及掌部夹住管塞,左手将管口在火焰上旋转烧灼,右手再轻轻拔开管塞,将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下,稍冷后再至菌苔上,刮取少量菌苔,随即取出接种棒并将菌种管口移至火焰上方。
(5)塞上管塞,左手将菌种管放下,取营养琼脂斜面(或改良马丁琼脂斜面)一支,照上述操作打开管塞,将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部向上划一条直线,然后从底部向上作连续曲线划线,一直划到斜面顶端,使细菌接种在斜面的表面上.
(6)取出接种环,在火焰上方将培养基管盖上塞子,然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌.
(7)将已接种好的细菌管置30~35℃细菌培养箱培养22~24h,真菌管置23~28℃真菌培养箱最多培养7天。
当工作用菌种传代代数小于5时,可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种,如:
(W3)可直接转接为(W4)。
按上述程序操作,直至(W4)转为(W5)为止,需重新接种,旧的工作菌种进行销毁.
菌种斜面的培养、保藏条件及时间
菌种 培养条件及时间 培养基 保存条件及时间
大肠埃希菌(CMCC(B)44102) 30~35℃22~24h 营养琼脂培养基 2℃~8℃保存3个月
金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003) 30~35℃22~24h 营养琼脂培养基 2℃~8℃保存3个月
枯草芽孢杆菌(CMCC(B)63501) 30~35℃22~24h 营养琼脂培养基 2℃~8℃保存3个月
铜绿假单胞菌(CMCC(B)10104) 30~35℃22~24h 营养琼脂培养基 2℃~8℃保存3个月
乙型副伤寒沙门菌(CMCC(B)50094) 30~35℃22~24h 营养琼脂培养基 2℃~8℃保存3个月
生孢梭菌(CMCC(B)64941) 30~35℃22~24h 营养琼脂培养基 2℃~8℃保存3个月
白色念珠菌(CMCC(F)98001) 23~28℃最多7天 改良马丁琼脂培养基 2℃~8℃保存3个月
黑曲霉(CMCC(F)98003) 23~28℃最多7天 改良马丁琼脂培养基 2℃~8℃保存3个月
短小芽孢杆菌(CMCC(B)63602) 30~35℃22~24h 营养琼脂培养基 2℃~8℃保存3个月
注:
菌种斜面1次/周观察状态是否正常。
3.7菌种的使用及销毁
每次进行菌种复活时,只能复活一个菌种.如果要复活其他菌时,应对所用物品重新消毒灭菌。
每次操作,都应进行记录。
菌种管上应贴有牢固的标签.标明菌种名称、菌种代号、代次、传代人、编号和传代日期、贮存条件、有效期至等.
废弃菌种及实验用品废弃物的处理:
121℃高压蒸汽灭菌30分钟。
并对操作过程进行记录。
食品卫生微生物检验实验室操作要求
发布日期:
2010—12-31 来源:
互联网 浏览次数:
4398
核心提示:
食品微生物实验室工作人员,必须有严格的无菌观念,许多试验要求在无菌条件下进行,主要原因:
一是防止试验操作中人为污染样品,二是保证工作人员安全,防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。
一、无菌操作要求
1。
接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽.
2。
进行接种食品样品时,必须穿专用的工作服、帽及拖鞋,应放在无菌室缓冲间,工作前经紫外线消毒后使用。
3.接种食品样品时,应在进无菌室前用肥皂洗手,然后用75%酒精棉球将手擦干净。
4。
进行接种所用的吸管,平皿及培养基等必须经消毒灭菌,打开包装未使用完的器皿,不能放置后再使用,金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用.
5.从包装中取出吸管时,吸管尖部不能触及外露部位,使用吸管接种于试管或平皿时,吸管尖不得触及试管或平皿边。
6.接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作,接种细菌或样品时,吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。
7.接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝,必要时还要烧到环和针与杆的连接处,接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min,再经火焰烧灼.
8。
吸管吸取菌液或样品时,应用相应的橡皮头吸取,不得直接用口吸。
二、无菌间使用要求
1。
无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃,并要密封,不得随意打开,并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门,另设有0。
5-0。
7m2的小窗,以备进入无菌间后传递物品。
2。
无菌间内应保持清洁,工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒,擦拭工作台面,不得存放与实验无关的物品。
3。
无菌间使用前后应将门关紧,打开紫外灯,如采用室内悬吊紫外灯消毒时,需30W紫外灯,距离在1。
0m处,照射时间不少于30min,使用紫外灯,应注意不得直接在紫外线下操作,以免引起损伤,灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭,除去上面灰尘和油垢,以减少紫外线穿透的影响。
4。
处理和接种食品标本时,进入无菌间操作,不得随意出入,如需要传递物品,可通过小窗传递。
5.在无菌间内如需要安装空调时,则应有过滤装置
三、消毒灭菌要求
微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等,必须经灭菌后方能使用。
(一)干热和湿热高压蒸气锅灭菌方法
1.灭菌前准备
(1)所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干,玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密,如用金属筒应将上面通气孔打开。
(2)装培养基的三角瓶塞,用纸包好,试管盖好盖,注射器须将管芯抽出,用纱布包好。
2.装放
(1)干热灭菌器:
装放物品不可过挤,且不能接触箱的四壁。
(2)大型高压蒸气锅:
放置灭菌物品分别包扎好,直接放入消毒筒内,物品之间不能过挤。
3.设备检查
(1)检查门的开关是否灵活,橡皮圈有无损坏,是否平整。
(2)检查压力表蒸气排尽时是否停留在零位,关好门和盖,通蒸气或加热后,观察是否漏气,压力表与温度计所标示的状况是否吻合,管道有无堵塞。
(3)对有自动电子程序控制装置的灭菌器,使用前应检查规定的程序,是否符合于进行灭菌处理的要求.
4.灭菌处理
(1)干热灭菌法:
此法适应于在干热情况下,不损坏、不变质、不蒸发的物品、较常用于玻璃器皿、金属制品、陶瓷制品等的灭菌。
①器械器皿应清洗后再干烤,以防附着在表面的污物炭化.
②灭菌时安放物品不能过挤,不要直接接触底和箱壁,物品之间留有空隙。
③菌时将箱门关紧,接上电源,先将排气孔打开约30min,排除灭菌器中的冷空气,温度升至160℃调节指示灯,维持1。
5–2h。
④灭菌完毕后或温度升温过程中,须在60℃以下才能打开箱门。
(2)手提式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行:
①手提式高压锅在主体内加入3L清水,立式高压锅加水16L(重复使用时应将水量补足,水变混浊需更换).
②手提式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中(无软管或软管锈蚀破裂的灭菌器不得使用).
③盖好顶盖拧紧,勿使漏气;置灭菌器于火源上加热,立式压力锅通上电源,并打开顶盖上的排气阀放了冷气(水沸腾后排气10-15min)。
④关闭排气阀,使蒸气压上升到规定要求,并维持规定时间(按灭菌物品性质与有关情况而定)。
⑤达到规定时间后,对需干燥的物品,立即打开排气阀排出蒸气,待压力恢复到零时,自然冷却至60℃后开盖取物,如为液体物品,不要打开排气阀,而应立即将锅去除热源,待自然冷却,压力恢复至零,温度降到60℃以下再开盖取物,以防突然减压液体剧烈沸腾或容器爆破。
(3)卧式压力锅蒸气灭菌器的使用按下列步骤进行:
①关紧锅门,打开进气阀,将蒸气引入夹层进行预热,夹层内冷空气经阻气器自动排出。
②夹层达到预定温度后,打开锅室进气阀,将蒸气引入锅室,锅室内冷空气经锅室阻气器自动排出。
③待锅室达到规定的压力与温度时,调节进气阀,使保持恒定至
④自然或人工降温至60℃再开门取物,不得使用快速排出蒸气法,以防突然降压,液体剧烈沸腾或容器爆破。
⑤使用自动程序控制式压力蒸气灭菌器,在放好物品关紧门后,应根据物品类别按动相应开关,以便按要求程序自动进行灭菌,灭菌时必须利用附设仪表记录温度与时间以备查,操作要求应严格按照厂家说明书进行。
5.灭菌温度与时间
(1)干热灭菌器灭菌温度160℃,1.5—2h。
(2)压力蒸气灭菌锅灭菌温度与时间
(二)间歇灭菌方法
1。
灭菌方法系利用不加压力的蒸气灭菌,某些物质经高压蒸气灭菌容易破坏,可用此法灭菌.
(1)将欲灭菌物品置于锅内,盖上顶盖,打开排水口,使器内余水排尽.
(2)关闭排水口,打开进气门,根据需要消毒10~20min。
(3)灭菌完毕关闭进气门,取出物品待冷至室温温度,放入37℃温箱过夜,次日仍按上述方法消毒,如此三次,即可达到灭菌目的。
2.血清凝固器使用方法,培养基中含有血清或鸡蛋特殊成份时,因高热会破坏其营养成份,故用低温,可使血清凝固,又可达到灭菌目的。
(1)在使用该法灭菌的血清等分装时,需严格遵守无菌操作,试管、平皿也经灭菌后使用.
(2)将培养基按要求使成斜面或高层,加足水后,接上电源,升温75~90℃1h灭菌,放37℃温箱过夜,再如此灭菌三次。
3.煮沸消毒:
可用煮锅或煮沸消毒器,水沸腾后再煮5~15min,也可在水中加入2﹪石炭酸煮沸5min,加入0.02﹪甲醛,80℃煮60min均可达到灭菌目的,但选用煮沸消毒的增消剂时,应注意对物品的腐蚀性。
4.灭菌处理:
灭菌后物品,按正常情况已属无菌,从灭菌器中取出应仔细检查放置,以免再度污染。
(1)物品取出,随即检查包装的完整性,若有破坏或棉塞脱掉,不可作为无菌物品使用。
(2)取出的物品,如为包装有明显的水浸者,不可作为无菌物品使用。
(3)培养基或试剂等,应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态,未达到者应废弃。
(4)启闭式容器,在取出时应将筛孔关闭。
(5)取出的物品掉落在地或误放不洁这处,或沾有水液,均视为受到污染,不可作为无菌物品使用。
(6)取出的合格灭菌物品,应存放于贮藏室或防尘柜内,严禁与未灭菌物品混放。
(7)凡属合格物品,应标有灭菌日期及有效期限.
(8)每批灭菌处理完成后,记录灭菌品名、数量、温度、时间、操作者。
四、有毒有菌污物处理要求
微生物实验所用实验器材、培养物等未经消毒处理,一律不得带出实验室。
1.经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内,并集中存放在指定地点,待统一进行高压灭菌.
2。
经微生物污染的培养物,必须经121℃30min高压灭菌.
3。
染菌后的吸管,使用后放入5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液中,最少浸泡24h(消毒液体不得低于浸泡的高度)再经121℃30min高压灭菌。
4.涂片染色冲洗片的液体,一般可直接冲入下水道,烈性菌的冲洗液必须冲在烧杯中,经高压灭菌后方可倒入下水道,染色的玻片放入5﹪煤酚皂溶液中浸泡24h后,煮沸洗涤。
做凝集试验用的玻片或平皿,必须高压灭菌后洗涤。
5.打碎的培养物,立即用5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位,浸泡半小时后再擦拭干净。
污染的工作服或进行烈性试验所穿的工作服、帽、口罩等,应放入专用消毒袋内,经高压灭菌后方能洗涤。
五、培养基制备要求
培养基制备的质量将直接影响微生物生长。
因为各种微生物对其营养要求不完全相同,培养目的的不同,各种培养基制备要求如下:
1.根据培养基配方的成分按量称取,然后溶于蒸馏水中,在使用前对应用的试剂药品应进行质量检验。
2.PH测定及调节:
PH测定要在培养基冷至室温时进行,因在热或冷的情况下,其PH有一定差异,当测定好时,按计算量加入碱或酸混匀后,应再测试一次。
培养基PH值一定要准确,否则会影响微生物的生长或影响结果的观察。
但需注意因高压灭菌可影响一些培养基的PH降低或升高,故不宜灭菌压力过高或次数太多,以免影响培养基的质量,指示剂、去氧胆酸钠、琼脂等一般在调完PH后再加入。
3.培养基需保持澄清,便于观察细菌的生长情况,培养基加热煮沸后,可用脱脂棉花或绒布过滤,以除去沉淀物,必要时可用鸡蛋白澄清处理,所用琼脂条要预先洗净晾干后使用,避免因琼脂含杂质而影响透明度.
4.盛装培养基不宜用铁、铜等容器,使用洗净的中性硬质玻璃容器为好。
5.培养基的灭菌既要达到完全灭菌目的,又要注意不因加热而降低其营养价值,一般121℃15min即可,如为含有不耐高热物质的培养基如糖类、血清、明胶等,则应采用低温灭菌或间歇法灭菌,一些不能加热的试剂如亚碲酸钾、卵黄、TTC、抗菌素等,待基础琼脂高压灭菌后凉至50℃左右再加入。
6.每批培养基制备好后,应做无菌生长试验及所检菌株生长试验.如果是生化培养基,使用标准菌株接种培养,观察生化反应结果,应呈正常反应,培养基不应贮存过久,必要时可置4℃冰箱存放。
7.目前各种干燥培养基较多,每批需用标准菌株进行生长试验或生化反应观察,各种培养基用相应菌株生长试验良好后方可应用,新购进的或存放过久的干燥培养基,在配制时也应测PH,使用时需根据产品说明书用量和方法进行.
8.每批制备的培养基所用化学试剂、灭菌情况及菌株生长试验结果、制作人员等应做好记录,以备查询。
六、样品采集及处理要求
1.所采集的检验样品一定要具有代表性,采样时应首先对该批食品原料、加工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查,检查是否有污染源存在。
2.根据食品的种类及数量,采样数量及方法应按标准检验方法的要求进行。
3.采样应注意无菌操作,容器必须灭菌,避免环境中微生物污染,容器不得使用煤酚皂溶液,用新洁尔灭、酒精等消毒药物灭菌,更不能含有此类消毒药物或抗生素类药物,以避免杀死样品中的微生物,所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可应用。
4.样品采集后应立即送往检验室进行检验,送检过程中一般不超过3h,如路程较远,可保存在1~5℃环境中,如需冷冻者,则在冻存状态下送检。
5.检验室收到样品后,进行登记(样品名称、送检单位、数量、日期、编号等),观察样品的外观,如果发现有下列情况之一者,可拒绝检验。
(1)样品经过特殊高压、煮沸或其他方法杀菌者,失去代表原食品检验意义者。
(2)瓶、袋装食品已启开者,熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎不完整者,即失去原食品形状者(食物中毒样品除外)。
(3)按规定采样数量不足者.
对送检符合要求的样品,检验室收到后,应立即进行检验,如果条件不具备,应置4℃冰箱存放,及时准备创造条件,然后进行检验。
6.样品检验时,根据其不同性状,进行适当处理。
(1)液体样品接种时,应充分混合均匀,按量吸取进行接种。
(2)固体样品,用灭菌刀、剪取其不同部位共25g,置于225ml灭菌生理盐水或其他溶液中,用均质器搅碎混匀后,按量吸取接种.
(3)瓶、袋装食品应用灭菌操作启开,根据性状选择上述方法处理后接种.
七、样品检验、记录和报告的要求
1.检验室收到样品后,首先进行外观检验,及时按照国家标准检验方法进行检验,检验过程中要认真、负责、严格进行无菌操作,避免环境中微生物污染。
2.样品检验过程中所用方法、出现的现象和结果等均要用文字写出试验纪录,以作为对结果分析、判定的依据,记录要求详细、清楚、真实、客观、不得涂改和伪造。
期移植法
发布日期:
2010—12—31 来源:
CICC 浏览次数:
881
核心提示:
定期移植法是一种传统的菌种保藏方法,本文介绍了定期移植法的具体操作。
定期移植法亦称传代培养保藏法,包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等.是指将菌种接种于适宜的培养基中,最适条件下培养,待生长充分后,于4~6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。
操作步骤如下:
1培养基制备
器皿准备 培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿,如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等,经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。
溶解培养基配料 先在烧杯中放适量水,按培养基配方称取各项材料,依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解,最后加足水量,搅
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