大鼠海马神经元的培养及细胞培养注意事项.docx
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大鼠海马神经元的培养及细胞培养注意事项
1.成年大鼠海马神经元的培养
●步骤
1.获得海马细胞
◆大鼠乙醚麻醉,断头处理;
◆迅速解剖海马组织,置于含有2ml4℃的HibernateA/B27的35mm的培养皿中;
◆随后将其移入含有同上培养基的培养皿,去除脑膜及多余的脑白质(?
;◆将海马移入组织切碎机冷处理台面上事先用HibernateA/B27润湿的滤纸上,沿海马长轴将组织切成0.5mm的薄片,随后将其移入含有5ml4℃的HibernateA/B27的离心管中;
◆30℃震荡8min。
◆大吸管将其移入含有木瓜蛋白酶(预热至30℃的离心管,置于170rpm的旋转平台(保持组织片悬浮状态,30℃水域温育30min;
◆将海马组织切片移入15ml含有2mlHibernateA/B27的离心管中,30℃温育5min,吸管吹打10次(30s,静置2min,将上清移入另一离心管,重复上述步骤2次;
2.梯度分离
◆将细胞悬液加入Nycoprepgradient(4ml的上方,室温,1900rpm,离心15min;去除最上方的碎片;吸管收集含有细胞的部分;用5mlHibernateA稀释;第三层富含神经元;将第四层用2mlB27:
NeurobasalA重悬,1100rpm离心1min;3.盖玻片处理:
50ug/mL多聚-D-赖氨酸(无菌水溶解包被过夜,吸去多余的多聚赖氨酸,无菌水漂洗一次,自然干燥1h;
4.
◆细胞接种:
以目标密度稀释于B27:
NeurobasalA,以每盖玻片60到120Ul接种,置于5%CO2:
9%O2中孵育1h;
◆将盖玻片移入24孔培养板中,每孔以0.4ml37℃B27/NeurobasalA漂洗一次,去除未贴壁细胞及细胞碎片;改用0.4ml的生长培养基;
◆培养后4天,每3-4天更换一半培养基;新的培养基中的FGF2含量是远培养基的2倍;
1.培养器皿的准备:
1溶液瓶——装配各种溶液——输液瓶;
2螺口瓶——血清或培养基;
3培养瓶——细胞培养——一般采用带螺口的,清洗时注意防止盖子中垫片的丢失;
4培养皿——细胞组织的分离、培养、染色——包括直径为30mm、60mm、120mm
5血球细胞计数板——细胞计数
6移液管——连接上手动(吸耳球或电动负压吸取装置——在移液管尾部塞入少量脱脂棉;
7离心管——分离、漂洗、收集细胞——一般选用螺口带盖的;Eppendorf——塑料尖底带盖的离心管
8磁力搅拌器:
用于神经细胞的分离机溶液的配置;最好配合使用可调温度的加热装置;可用高压蒸汽消毒。
9加样器:
微量加样器——一般采用紫外线消毒:
超净台内,<30cm,20~30min;移液器吸嘴置于移液器吸嘴盒中高压消毒。
10培养板(塑料消毒密封装备的即用型——盖板及带圆孔的底板;
2.无菌室操作规范:
1使用无菌间前先用无菌间的紫外灯照射30min,然后打开通风装置30min以消除实验室中的臭氧。
操作结束后及时清理无菌间,紫外灯照射20min。
2进入无菌间前洗手,带好口罩、手套,更换无菌间的鞋子、衣服方可进入
3.超净台操作规范:
1超净台使用前先用70~75%酒精擦拭,然后用超净台的紫外灯消毒30min,关灯打开风机后使用;使用完成后及时清理台面并用酒精擦拭台面;
2超净台内不放与实验无关的东西;
3超净台内非一次性物品都需灭菌处理,不能高压灭菌的用70%-75%的酒精消毒;
4操作人员的手套用70%-75%的酒精消毒方可进入超净台操作;
5操作时尽量接近酒精灯;拿取吸管时避免接触使用端;不要在开口器上方操作;吸取不同液体用不同的吸管;吸管不接触瓶口;培养用吸管、培养瓶等开口常规在酒精灯上过火;
4.常用仪器的使用:
(一
1用于玻璃器皿的消毒,而塑料、橡胶制品及金属器械不用于干热消毒
2干热消毒的温度一般为160-170℃;用于RNA实验的器皿为250℃;
3进行消毒后,鼓风和升温同时开始,待温度升至100℃时,关闭鼓风;消毒结束后,待温度降至100℃以下时打开箱门;
4消毒完成后,将灭菌处理的器皿置于56℃电热干燥箱内长期保存
(二
1将不透气的培养瓶/培养皿置于培养箱时,应旋松螺口使之与外界气流相通维持PH的恒定;取出是应旋紧开口;
2保持培养箱内空气的洁净,定期用酒精或紫外线消毒;
3保持培养箱内较高的湿度——定期在外箱内加水或将无菌潮湿的纱布置于托盘内;
(三
及培养用水、平衡盐液、布料的消毒灭菌。
1灭菌的液体应置于耐高温的玻璃器皿中,容量为总容量的1/2~3/4,瓶塞要有通气口;
5.培养用液:
(一
1培养用水一般使用三蒸水,或者二蒸水+去离子处理;高压蒸汽灭菌后使用;
2新鲜使用,一般不超过2周;
3外购的蒸馏水一般为金属蒸馏器制备,一般需要用石英或玻璃蒸馏器在蒸馏一次
(二
1取材和分离细胞中,细胞必须全程维持于生理PH和渗透压的平衡盐液中;
2以酚红作为指示剂,正常呈红色,酸性呈黄色,碱性呈紫色;酚红一般对细胞无毒,但在强光下可产生细胞毒性。
3碳酸氢盐缓冲系统在空气中易变碱;磷酸盐缓冲系统、HEPES可维持空气中的酸碱平衡。
4配置时:
用新鲜培养用水配置;溶质称量应准确;先溶解Ca,Mg,再溶解其他成分,且前一种物质溶解后再溶解后一种物质;先将物质溶解于少量液体,配置完后再定容;
5用高压蒸汽灭菌(8磅15min或过滤除菌
6灭菌后4℃贮存
7配置的平衡盐的PH并不是细胞最合适的,根据情况调节PH至7.2~7.4
8Hanks(HBSS——D-Hanks(不含Ca,Mg,不含葡萄糖
(三
1外观:
清亮透明,棕黄色或土黄色,无沉淀或极少沉淀,比较粘稠
2清蛋白>35~45g,球蛋白<20g,血红蛋白越低越好
3存储:
●新购血清——56℃30min热灭活(高品质胎牛血清及新生牛血清可不灭活;●若一次用不完,将其分装,置于-20℃,保存6~12月;
●使用时,从-20℃取出,置于4℃24h(4℃可保存1月,置于37℃水域温热;溶解过程中必须规则缓慢摇匀。
●避免反复冻融。
(四
1认真阅读说明书,注意添加成分;
2配置时应充分溶解,NaCO3应最后添加
3配置所用器皿应十分清洁,所用水为培养用水;
4配置后超净台内过滤除菌,4℃保存(=<7d
5使用前37℃预热;
6如DMEM(营养成分浓度高,含有Ca,Mg,F12(营养成分丰富,浓度较低(五(146g/mol
1谷氨酰胺不稳定,一般配置成100×的贮液,-20℃保存
2配置时应加温至30℃,充分溶解后过滤除菌,-20℃保存;
3使用前添加,终浓度为2mmol/L
4若培养基内已添加谷氨酰胺,4℃储存2~4周应加入原剂量的谷氨酰胺
(六
1称取0.25g胰蛋白酶置于容器内加入少量D-hanks液调至糊状——然后加入D-hanks至100ml——加入NaCO3调节PH至8——4℃过夜——NaCO3/mol/LHCl调节PH至7.2——粗滤纸过滤——过滤除菌——分装成小份-20℃保存
2使用时4℃过夜,室温/水浴活化
3使用时终浓度为0.05%
(七
1降解DNA,有助于细胞分离——在吹打分离细胞时加入
2称取0.5mgDNA酶置于容器内加入少量D-hanks液调至糊状——然后加入D-hanks至100ml——4℃过夜——NaCO3/HCl调节PH至7.2——粗滤纸过滤——过滤除菌——分装成小份-20℃保存
3使用时4℃过夜,室温/水浴活化
(八
——未开封4℃避光保存6月,开封后4℃避光保存1月
(九
(十
1
2
3
(十一
1将10000u的青霉素/10mg链霉素加入PBS液中溶解——加PBS液至100ml——分装-20℃贮存
2使用时加入培养基:
终浓度为青霉素100u/mL,链霉素100ug/mL。
6.培养器皿的清洗消毒灭菌
(一
1浸泡:
●重复使用的器皿使用后立即浸泡于自来水中;
●新使用的器皿使用前先浸泡于自来水中,然后用5%HCl浸泡过夜;●要求:
完全浸泡于水中,器皿内完全充满清水不留有空气死腔;
2刷洗:
用优质的洗涤液及软毛刷刷洗,刷洗后用水冲尽洗涤剂,晾干;
3浸酸:
将器皿浸于配置好的酸液中
要求:
完全浸泡于水中,器皿内完全充满酸液不留有空气死腔
浸泡过夜(至少>6h
注意:
酸液呈棕红色,若呈绿色提示酸液失效,应更换酸液;
4冲洗:
方法一:
用洗涤装置冲洗;自然晾干;
方法二:
流水灌满后倒掉(>15次然后蒸馏水冲洗2~3次;自然晾干;(二
●塑料器皿一般为一次性使用,拆开包装即可使用,使用后即弃;
●若欲重复使用,可按如下步骤:
流水冲净,晾干——2%NaOH浸泡过夜——自来水冲洗数遍——5%HCl浸泡30min——自来水冲洗(15遍——单蒸水浸洗3次——双蒸水浸泡24h——70%酒精浸泡>1h——超净台紫外线照射>1h——使用;
(三
自来水浸泡——2%NaOH煮沸10~20min——自来水冲洗5~6遍——1%HCL浸泡1h——自来水冲洗5~6遍——蒸馏水漂洗2—3遍——晾干;
(四
(五使用后用来苏水冲洗数次——单蒸水洗3次——95%酒精洗3次——置于铝饭盒中。
(六
1清洗:
使用后用清洗液清洗——自来水冲洗15min——去离子水浸泡24h——三蒸水浸泡24h
2消毒:
新的滤膜(每次更换于双蒸水中浸泡5~10min,正面朝上置于滤器中,稍旋旋钮(不宜过紧,包装后高压蒸汽消毒——消毒后无菌条件下旋紧旋钮——行过滤
3过滤完成后常规打开滤器,核实滤器有无破裂或移动。
(七
1培养瓶、培养皿、胶塞、盖子等直接置于铝饭盒中(螺口旋松;
2移液管、吸管头端用脱脂棉球将接口端堵塞,置于消毒桶中,桶底部垫纱布;
3注射器,金属器械用纱布包好后置于铝饭盒中;
4移液器的吸管头、小滤器置于专用的塑料盒中;
(八
1干热消毒——适用于玻璃器皿160~170℃90~120min
2湿热消毒——适用于玻璃器皿、布类、金属器械、橡胶制品的消毒灭菌金属器械、玻璃器皿、布类——15磅30min;
常规使用液体——15磅15min;
橡胶制品——10磅10min;
湿热消毒后应置于37~56℃的温箱中储存;
3)过滤消毒——适用于培养基、消化液及血清的消毒灭菌;4)经高压蒸汽灭菌,用双层布包裹置于干燥环境中可保持无菌10~14d;7.为了便于固定及染色细胞,可将细胞接种于盖玻片上,盖玻片置于培养皿或培养板中,盖玻片可取出固定染色及封片8.组织获取:
时间尽可能短,保持组织无菌状态,保持组织的湿润。
9.细胞的分离——单细胞悬液方法:
1)使用不含Ca,Mg等二价阳离子的平衡盐溶液收集、分散细胞2)酶消化法:
①不用含有Ca,Mg等二价阳离子的平衡盐溶液/含血清或其他蛋白质的溶液溶解酶②控制于适宜的PH环境③消化处理后及时终止酶的活性——离心漂洗/加入血清或特殊抑制剂3)机械吹打法:
①吹打口径越小对细胞损伤越大②不时让未离散的组织块下沉,及时收集含有分散细胞的悬液;加入新的平衡盐液重复上述过程③将组织块从吸管中排除时,应将吸管置于液面以上,并贴于试管壁排除——避免产生气泡及由此引起的细胞的破裂④要缓慢吹打。
吸入时候要很缓慢,吹出的时候可以略快,但是也要缓慢10.培养物的维持:
1)维持于能自动注入空气及CO2的培养箱内2)保持较高的湿度,减少蒸发3)温度:
维持于略低于37℃,细胞在>39℃时可迅速死亡4)换液时间依不同细胞而定。
11.培养板:
1培养板属于半开放培养,有利于培养箱中CO2的交换。
2孔直径愈小,细胞聚集现象越明显,24、96孔板这种现象不可避免,因为液体的附壁使得孔内培养液不是成一个液平面,而是周边高,就像凹镜一样,而使用这两种孔板由于需要加干预等原因而不能加足量培养液,使得细胞随培养液一起出现“边集”现象,如果为了使孔中央也有均匀细胞而增加接种细胞数量的话,这要看你需要观察何种指标,如果是MTT,免疫组化的话会因为细胞成层而影响结果。
对策:
消化细胞时要注意吹打均匀,避免细胞成团;孔内培养液量要足够,接种时加足量培养液,加干预时换一次液,干预液加培养液量等于接种时培养液量,这样的话“边集”现象会有所改观。
培养种板之前,把培养板放入培养箱里进行几个小时的饱和后再取出。
种入细胞时力量要轻,可采取用滴头在培养板孔的侧面慢慢加入让细胞悬液流入板孔中。
铺板后不要做圆周的晃动,做十字晃动,即上下左右晃动。
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