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细胞生物学考研笔记
第一章绪论
一、细胞生物学概况
二、细胞生物学简史
三、细胞生物学研究内容
四、细胞生物学学习方法
一、细胞生物学概况(P1)
1、什么是细胞生物学?
细胞生物学(cellbiology)是研究细胞基本生命活动规律的科学,是现代生命科学的重要基础学科之一;它从显微、亚显微和分子三个层次以动态的观点来研究细胞和细胞器结构与功能,探讨细胞的各种生命活动规律。
2、细胞是所有生物体(不包括病毒)一切生命活动的基本单位
具有自我复制、自我装配和自我调控的能力,通过与外界物质和信息交流,保持自身动态平衡。
病毒、生物大分子和细胞的关系
“一切生命的关键问题都要到细胞中去寻找”
“一切生命的关键问题都要到细胞中去寻找”
3、细胞生物学分支
细胞形态学细胞遗传学细胞化学细胞生理学细胞分类学细胞免疫学
二、细胞生物学发展简史(P8)
五个阶段
1、细胞的发现
1665年RobertHooke(英)(30×)“cellar”——cell
1677年LeeuwenHoek(荷兰)(300×)活细胞观察,第一次观察到原生动物、人类和
动物的精子。
2、细胞学说的建立
1838-1839Schleiden和Schwann(德)分别提出了细胞学说(celltheory);
基本内容:
所有生物都是由一个或者多个细胞构成的;细胞是生命的基本单位。
1858年RodulfVirchow(德)对细胞学说进行了重要补充:
细胞只能来自细胞。
意义:
19世纪自然科学三大发现之一;
现代生物学三大基石之一。
3、细胞学经典时期——19世纪的后25年(P9)
原生质理论的提出:
protoplasm
1861年,MaxSchultze:
有机体的单位是一小团原生质,这种物质在一般有机体是相似的。
细胞分裂的研究:
有丝、减数分裂;
重要细胞器的发现。
4、实验细胞学及发展(1900-1953)(P10)
experimentalcytology——用实验的手段研究细胞学的问题,即从形态结构的观察深入到生理功能、生物化学及遗传发育机理的研究。
细胞遗传学细胞生理学细胞化学
5、细胞生物学学科形成、发展
(20世纪50年代——)(P12)
1953年DNA结构的发现——分子生物学诞生;
1965年,D.P.Derobetis将《普通细胞学》改为《细胞生物学》,标志着细胞生物学的诞生。
新研究技术手段的促进:
电子显微镜、超薄切片、扫描隧道显微镜、细胞化学、分子生物学……
80年代:
分子细胞生物学(MolecularCellBiology)
细胞生物学发展历史(总结)
1、细胞的发现、细胞学说的创立(1665~1874);
2、细胞学的经典时期(1875~1900);
3、实验细胞学时期(1900~1953);
4、细胞生物学的诞生和发展(1953~)
三、细胞生物学的研究内容(P2)
1、膜学和细胞器学
生物膜——细胞质膜和细胞内膜的总称,细胞物质交换、能量转换、信息交流的关键功能部位。
细胞器学——探讨细胞器的结构和功能
2、核学和染色体学
细胞生物学、分子遗传学、发育生物学共同关注的焦点之一,研究染色体结构动态变化与基因表达及其调控的关系。
3、细胞骨架体系
4、细胞分裂和细胞分化
5、细胞凋亡
6、细胞工程学
四、细胞生物学学习方法
1、细胞是生命结构和功能的基本单位,细胞生物学在生命科学研究领域具有重要地位;
2、明确细胞的结构和功能的一致性;
3、从显微、亚微和分子三个层次来认识细胞的结构与功能;
4、和多学科知识相结合,同分子生物学、生物化学、遗传学、生理学等课程紧密联系;
5、注意细胞生物学各章节之间内容的相互关联;
6、关注学科前沿;关注新技术方法进展;学习一点科技史。
本章完
一、细胞生物学概况
二、细胞生物学简史
三、细胞生物学研究内容
四、细胞生物学学习方法
一、光学显微技术(P49)
1、普通复式光学显微镜技术
①组成:
光学放大系统、照明系统、机械系统;
②性能参数:
放大倍数、分辨力、清晰度、焦点深度、镜像亮度等,其中最重要的是分辨力。
分辨力(分辨率、分辨本领):
能分辨两个物点之间最短距离的能力。
该距离越小,则分辨力越高。
显微镜的分辨力计算公式:
③普通光镜分辨极限
α最大值140°;λ最小波长450nm;N最大值1.5;
因此普通光镜的分辨力极限为0.2微米,此数值亦为显微水平和亚微水平的分界点。
普通光镜有效放大倍数(经验值)=物镜最大镜口率×1000
④提高光学显微镜分辨力的手段
a、缩短照明光线波长;
b、应用特殊光学效应,增强反差。
显微镜技术和计算机技术结合
倒置显微镜
2、荧光显微镜技术(P49)(fluorescencemicroscopy)
①原理:
以紫外光为光源,激发标本中的荧光物质产生荧光,从而对某些物质进行定性和定位分析。
②荧光种类:
自发荧光:
细胞内某些天然物质被UV激发产生的荧光,如叶绿素产生血红色荧光。
诱发荧光:
细胞中加入荧光染料,与特定成分结合,经过UV照射发出荧光。
荧光显微镜的工作原理OlympusBX-51荧光显微镜
3、激光共聚焦扫描显微镜(P50)(laserscanningconfocalmicroscope,LSCM)
4、相差和微分干涉显微镜技术(P50)
①相差显微镜:
phasecontrastmicroscope,Ph)
1935年荷兰物理学家FritsZernicke发明了相差显微镜,它利用光的衍射和干涉原理,将人眼无法感受到的光的相位差转换成为人眼可以感受到的振幅差,从而将无色透明物体中的细节表现为明与暗的对比,适合观察活细胞和未染色的样品。
普通光学显微镜
相差显微镜
②微分干涉显微镜(P51)(differential-interferencemicroscope,DIM)
DIM获得的反差取决于光线穿过样品折射率变化的速率。
样品边缘结构反差增大(相对小的距离内折射率发生明显变化)。
Nomarskimicroscope
二、电子显微镜技术(P51)
1、透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscope,TEM)
电子显微镜是模仿光学显微镜的工作原理,用电子束来代替可见光束,用电磁线圈代替玻璃透镜汇聚电子束,通过荧光屏或者胶片捕获图像的观察工具,理论分辨率可达0.2nm。
HITACHIH-8100
透射电子显微镜
电子显微镜基本构造(P52)
电子显微镜基本构造
电子显微镜基本构造
电子显微镜基本构造
超薄切片制备
2、透射电镜特点
①“照明”光源——电子束
②放大倍数调节方式——改变磁透镜电流强度
③高电压工作——几万~十几万伏
④内部高真空——10-4托
⑤样品厚度<90nm——电子穿透力有限,产热
⑥标本染色技术不同——重金属盐(正染,负染)
⑦冰冻蚀刻(冰冻断裂)技术freeze-etching(freeze-fracture)
样品于-190℃快速冰冻——在真空中用冷却刀切割撕裂——真空中冰升华——暴露出的断裂面喷碳膜或者碳-铂膜(表面复型膜)——用有机溶剂或酶去除样品——将膜金属喷镀后在电镜下观察
2、扫描电子显微镜(P58)(scanningelectronmicroscope,SEM)
SEM发明于1965年,它是利用电子束扫描样品表面,再通过检测样品表面逐点散发的二次电子,将样品表面的形貌逐点成像并合成为放大的图像。
PHILIPSXL20扫描电子显微镜
扫描电镜的特点:
①可观察较大较厚的样品;
②景深大,获得的是清晰逼真的三维立体图像;
③放大倍数在20~20万倍间连续变换,无需多次聚焦;
④样品可在样品室内多方位移动和转动;
⑤分辨力不太高:
3~10nm
⑥只能观察标本表面,不能观察内部。
3、扫描隧道显微镜(scanningtunnelingmicroscope,STM)(P59)
1981年发明的用于探测微观世界物质表面形貌的仪器。
利用量子力学中的隧道效应。
扫描隧道电镜下的DNA双螺旋
STM的特点:
①具有原子尺度的高分辨本领;
②真空、大气、液体环境中都能工作,不接触样品,保持样品原貌。
原子力显微镜(atomicforcemicroscope,AFM)
第二节细胞组分的分析方法
一、超速离心技术(P60)
离心技术原理由于不同的细胞器具有不同的密度和体积,因此,可以利用离心方法加以分离和纯化。
1、差速离心(differentialcentrifugation)
利用不同的离心速度产生的不同的离心力,将各种亚细胞组分和各种颗粒分离开来。
适合分离沉降速率差别较大的亚微结构颗粒。
多次离心达到纯化的目的
2、密度梯度离心(P61)
①蔗糖密度梯度离心
②氯化铯密度梯度离心
将介质形成一函盖所有组分密度的密度梯度,不同的样品由于其密度差异,在离心过程中进入到等密度介质区域即不再移动,从而实现分离的目的。
蔗糖密度梯度离心和氯化铯密度梯度离心的比较
二、组织化学和细胞化学(P61)
利用一些显色剂与被测物质中的某些基团特异性结合,来判断核酸、蛋白质(酶)、糖类、脂类在细胞中的分布和含量。
福尔根(Feulgen)反应——显示DNA
格莫瑞(Gomori)反应——显示碱性磷酸酶
三、免疫细胞化学(P62)(Immunocytochemistry,ICC)
根据抗体能与对应的抗原自行识别结合的免疫学原理,来检测特定蛋白质在细胞内的分布状况和含量。
人成纤维细胞中肌动蛋白束(800×)
BHK细胞中的微管蛋白(500×)
四、细胞内特异核酸序列的定位和定性
研究对象:
细胞内特异核酸(DNA或RNA)
目的:
进行定位、定量分析
方法:
原位杂交(insituhybridization,ISH)以目标核酸的互补序列为探针,对细胞或者组织标本进行杂交处理,使目标核酸可视呈现的技术。
是细胞生物学、细胞遗传学、分子生物学相互交融的研究手段。
构建DNA分子物理图谱
光谱核型分析(spectralkaryotype,SKY)SKYofHuman
五、定量细胞化学分析技术P65
细胞分选(cellsorting)
是细胞生物学中较新技术,是利用流式细胞仪(flowcytometery,FCM)对细胞或者其他生物微粒(如染色体)进行分选,并对其进行定量分析(大小、形状、核酸含量和蛋白质含量等)的技术。
1、流式细胞仪(FCM)
是集合了流体喷射、激光、伽马射线能谱、电子计算机、显微荧光光度计量等技术于一体的设备;
可以定性和定量分析生物颗粒(包括细胞)的物理化学特性并将之分离纯化;
目前的FCM已经运用于细胞生物学、肿瘤学、免疫学、血清学、药物学等研究领域,可以用来分析免疫复合物、病毒、脂质体、细胞器、原核细胞、真核细胞、简单多细胞生物等等。
流式细胞仪结构和工作原理
2、标记细胞:
免疫荧光染色
荧光素标记抗体:
异硫氰酸荧光素(FITC)、
藻红素(PE)、Texas红(TexasRed)
荧光染色分为:
直接染色和间接染色
荧光染料直接染色
使用碘化丙啶(propidiumiodide,PI)或者DAPI,对固定处理过的细胞或者细胞核直接进行染色,利用这些荧光染料嵌合入双螺旋结构堆积的碱基之间,使得所有双链区域均被染色。
再利用FCM根据细胞激发的荧光的差异对细胞加以分离。
第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术
一、细胞培养P66
1、什么是细胞培养
是指从机体内取出某种组织或者细胞,模拟机体内的生理条件使其在体外生存、生长和繁殖的过程。
细胞培养示意图
2、细胞培养分类:
按照培养过程中培养物是否经过了分割,分类为:
①原代培养(primaryculture)
②继代培养(secondaryculture)或者再培养(subculture)
①原代培养(primaryculture)
直接从机体取出组织或者细胞后所进行的首次培养。
②继代培养(secondaryculture)/
传代培养(subculture)
当原代培养的细胞增殖到一定的密度后,将其从原培养容器中取出,按照一定的比例向另外一个或者多个容器中所进行的再培养,简称传代。
传代的累计次数就是细胞的代数。
两个概念
细胞系(cellline):
通过原代培养并且经过传代后所形成的细胞群体,由于来源于原代培养物,故一个细胞系往往由多个生物学性状不同的细胞群体组成。
如HeLa、CHO等。
细胞株(cellstrain):
利用单细胞分离培养法或者克隆形成法从原代培养物或者细胞系中选择出来的细胞群体,一个细胞株往往具有特殊的生物学性状或者标记,并且可以持续存在。
二、细胞工程(cellengineering)
细胞水平的生物工程。
(一)细胞融合
1、细胞融合(cellfusion)——两个或者多个细胞融合成双核或者多核细胞的现象。
产生的细胞称为融合细胞。
2、细胞融合的应用:
动物和植物的不同种、属之间的细胞可以融合,并且动植物之间的细胞可以融合,从而培养成各种性状的杂种细胞。
细胞融合被广泛应用于研究核质关系、绘制染色体基因图谱、制备单克隆抗体、研究肿瘤发生机制等领域。
3、人工诱导细胞融合:
病毒诱导融合:
灭活的仙台病毒等。
化学诱导融合:
PEG
电激诱导融合:
(二)单克隆抗体技术(三)细胞显微操作技术
第四章细胞膜和细胞表面PlasmaMembrane&itsSurfaceStructures
第一节主要内容
一、细胞膜的研究历史和结构模型(model)
二、细胞膜的化学组成(膜脂、膜蛋白)
三、细胞膜的性质(膜的流动性、不对称性)
四、细胞膜的功能
五、膜骨架与细胞表面特化结构
一、细胞膜的研究历史和结构模型P73
1、ErnestOverton(1895)发现:
溶于脂肪的物质很容易透过植物的细胞膜;
不溶于脂肪的物质不易透过细胞膜。
推测细胞膜由连续的脂类物质组成。
2、E.Gorter和F.Grendel(1925)发现:
红细胞质膜的脂类成分在水面展开的面积是红细胞表面积的2倍
推测细胞膜由双层脂分子组成。
3、三明治式质膜结构模型P74
J.Danielli和H.Davson(1935)发现:
质膜的表面张力比油-水界面的张力低得多,推测膜中含有蛋白质。
1959年提出了“蛋白质-脂质-蛋白质”的三明治式的质膜结构模型
4、单位膜模型(unitmembranemodel)
J.D.Robertson1959用超薄切片技术获得了清晰的细胞膜照片,显示暗-明-暗三层结构
5、流动镶嵌模型(fluidmosaicmodel)
S.J.Singer和G.Nicolson1972根据免疫荧光技术、冰冻蚀刻技术的研究结果,提出了“流动镶嵌模型”。
6、晶格镶嵌模型
Wallach(1975)
①生物膜含有的”流动性脂质“进行可逆地无序(流动性)到有序(晶态)的相变。
②在大多数动物细胞的膜系统中,这种“流动性脂质”呈小片的点状分布,面积小于100nm2。
7、板块镶嵌模型
1977年,Jain和White提出了板块镶嵌模型。
在流动的类脂双分子层中存在许多大小不同,刚度较大的彼此独立移动的类脂板块(有序结构板块)。
8、脂筏(lipidrafts)和质膜微囊(caveolae)(补充)
①1997年。
脂筏——富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域,约70nm左右,是一种动态结构,位于质膜的外小页;介于无序液体与液晶之间,称为有序液体(Lo);如同一个蛋白质停泊的平台,与膜的信号转导、蛋白质分选均有密切的关系。
②1995年。
质膜微囊——细胞表面内陷小孔结构,以鞘脂和胆固醇为主,以微囊素/内陷素(caveolin)为标志蛋白。
③脂筏和质膜微囊的功能:
信号转导——中心?
膜的运送——内吞、外排
疾病关联——癌、动脉粥样硬化、糖尿病、老年性痴呆……
质膜应该视为脂质、蛋白质和糖组成的一个不均匀的超分子体系,膜脂以甘油酯为主体,大小不一的、以鞘脂和胆固醇为主要成分的微区分散在主体中。
主体和微区都含有数量不等的膜蛋白。
1、微区的功能机制?
2、微区小,难以分离
3、信号分子与微区的关系?
4、微区在医药的应用?
二、细胞膜的化学组成p76
综述:
质膜主要由膜脂和膜蛋白组成,另外还有少量的糖。
膜脂是膜的基本骨架,膜蛋白是膜功能的主要体现者。
(一)膜脂(membranelipid)
分类:
膜脂是生物膜的基本成分,主要包括磷酸甘油酯、神经鞘酯和胆固醇三种类型。
1、磷酸甘油酯:
是构成膜脂的基本成分,约占整个膜脂的50%以上。
磷酸甘油酯
phosphoglycerides
O
‖
OCH2-O-C-R1
‖∣
R2-C-O-CHO
∣‖
CH2-O-P-O-X
∣
O-
主要类型有:
①磷脂酰胆碱(PC),旧称卵磷脂②磷脂酰丝氨酸(PS)③磷脂酰乙醇胺(PE),旧称脑磷脂④磷脂酰肌醇(PI)⑤双磷脂酰甘油(DPG),旧称心磷脂
磷脂的分子结构特征
1)头尾:
“一头二尾”(心磷脂4尾);2)碳链:
碳原子多为16~20,偶数。
3)饱和性:
饱和、单不饱和、多不饱和。
2、神经鞘酯(sphingolipids)
是一类含量较少的膜脂,是鞘胺醇的衍生物。
①鞘磷脂(sphingomyelin)
鞘胺醇的衍生物——以鞘胺醇为骨架,与一条脂肪酸链组成疏水尾部,与含胆碱的磷酸基团组成亲水头部;在神经系统中含量特别丰富。
原核细胞、植物中无鞘磷脂。
②糖脂(glycolipid)
鞘胺醇的衍生物——以鞘胺醇为骨架,与一条脂肪酸链组成疏水尾部,与一个或多个糖残基组成亲水头部,在神经细胞膜上糖脂含量较高;最简单的糖脂是半乳糖脑苷脂,在髓鞘的多层膜中含量丰富;变化最多、最复杂的糖脂是神经节苷脂。
3、胆固醇(cholesterol)
动物中含量最丰富的固醇类化合物;植物和细菌中少;
在脑、神经组织及肾上腺中含量丰富,其次是在肝、肾、脾、皮肤和脂肪组织中。
胆固醇对细胞膜流动性的影响
在相变温度以上,它可使磷脂分子的脂酰链末端的运动减小,即限制膜的流动性。
在相变温度以下,可增加脂类分子脂酰链的运动,这样可以增强膜的流动性。
膜脂的特性:
厚度约6nm;连续广泛的网络;可变形;自组装(selfassemble)。
膜脂的运动方式(P76-77)
1、沿膜平面的侧向运动;*2、脂分子围绕轴心的自旋运动;3、脂分子尾部的摆动;
4、双层脂分子之间的翻转运动。
脂质体(liposome)p77
本质:
利用了脂双分子层的自组装性,是一种人工膜。
在水中,搅动磷脂形成的双层脂分子球形体,直径25~1000nm不等。
人工脂质体的用途:
1.研究生物膜的特性2.药物和DNA的载体隐形脂质体(stealthliposomes)
(二)膜糖
共价连接在膜脂和膜蛋白上的糖类(2~8%)。
90%以共价键与蛋白质——糖蛋白;10%连接到脂类——糖脂。
膜糖的功能:
◆细胞与环境的相互作用◆接触抑制◆信号转导◆蛋白质分选◆保护作用等。
(三)膜蛋白P78
种类繁多,是膜功能的主要体现者。
据估计核基因组编码的蛋白质中约30%为膜蛋白。
1、分类:
根据膜蛋白与脂分子的结合方式,分为三类:
––外周蛋白(peripheralprotein)
––膜内在蛋白(integralprotein)或整合蛋白
––脂锚定蛋白(lipid-anchoredprotein)
①外周蛋白
是水溶性蛋白,暴露在脂双层的外侧或内侧;与质膜以非共价键形式连接;
改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来。
②膜内在蛋白p78
整合蛋白多数为跨膜蛋白(tansmembraneproteins),是两性分子;
与膜的结合非常紧密,只有用去垢剂才能从膜上洗涤下来,如SDS(离子型),TritonX-100(非离子型)。
膜内在蛋白与膜脂的结合方式p78
三、细胞膜的性质
(一)细胞膜的流动性(P81)
1、膜脂的流动:
“刚柔并济”
影响膜脂流动性的因素
①胆固醇含量:
含量增加,降低膜的流动性;
②脂肪酸链的饱和度:
脂肪酸链所含双键越多,越不饱和,膜流动性越强。
③脂肪酸链的长度:
长链,相变温度高,膜流动性低;
④卵磷脂/鞘磷脂比例:
该比例高则膜流动性增加,是因为鞘磷脂粘度高于卵磷脂;
⑤其他因素:
温度、酸碱度、离子强度等。
2、膜蛋白的流动性(P82)
膜蛋白在脂双层二维溶液中的运动是自发的热运动(主要为侧向流动),不需要代谢产物的参加和能量的提供。
膜蛋白的流动性是相对的。
表现为某些膜蛋白在细胞膜表面的分布有一定的区域性,甚至有的蛋白是不流动的,原因是某些蛋白与细胞膜下的细胞骨架相结合,流动受到限制。
整合膜蛋白的运动方式
影响膜蛋白移动的因素
■整合蛋白相互间的影响■膜骨架的影响■细胞外基质的影响■相邻细胞的影响
■细胞外配体、抗体、及药物大分子的影响
研究膜蛋白流动的实验技术1P82
荧光抗体免疫标记细胞融合
研究膜流动性的实验技术2P83
光脱色荧光恢复技术FRAPfluorescencerecoveryafterphotobleaching
膜蛋白或者膜脂被荧光素标记,再用激光照射某一区域,被照射区的荧光因为淬灭而变弱。
由于膜的流动性,粹灭区域亮度会逐渐增加,最后与周围两度等同。
荧光恢复的速度间接反映出膜蛋白或者膜脂扩散的速度。
3、质膜流动性的意义
1)膜的流动性有利于酶的侧向扩散和旋转运动;2)膜的流动性保证了物质的运输;3)膜流动性与信号转导;4)膜的流动性和能量转换;5)膜的流动性与细胞的发育和衰老。
(二)细胞膜的不对称性P83
——质膜内外两层的组分和功能的差异,
1、细胞膜各部分的名称
ESEFPFPS小鼠肝细胞膜冰冻蚀刻
2、膜的不对称性p83
1)膜脂的不对称性:
2)复合糖的不对称性:
糖脂和糖蛋白只分布于细胞膜的外表面。
3)膜蛋白的不对称性:
每种膜蛋白分子在细胞膜上都具有特定的方向性和分布的区域性。
如各种激素的受体具有极性,细胞色素C位于线粒体内膜内侧。
四、细胞膜的功能p84
1、区域化——排除干扰,独立调节;
2、选择性通透屏障;
3、物质运输——选择性的物质运输(输入与排出);
4、应答信号——感受外界刺激;
5、生化活动框架——为多种酶提供结合位点,使酶促反应高效而有序地进行;
6、连接细胞——介导细胞/细胞、细胞/基质的连接;
7、能量转换——光合作用;
8、特化结构
五、膜骨架与细胞表面的特化结构P85
(一)膜骨架(membraneassociatedcytoskeleton)
定义:
膜骨架是质膜下与膜蛋白相连的纤维蛋白组成的网架结构。
作用:
维持质膜的形状并协助质膜完成多种生理功能。
研究材料:
成熟的哺乳动物血红细胞
红细胞——研究质膜的良好材料
不贵,可大量获得;
游离,无需从复杂组织中分离;
无核膜和内膜,避免膜样品的污染;
简单处理——溶血,就能获得血影。
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