免疫组化总结猪羊.docx
- 文档编号:24724101
- 上传时间:2023-05-31
- 格式:DOCX
- 页数:17
- 大小:28.24KB
免疫组化总结猪羊.docx
《免疫组化总结猪羊.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《免疫组化总结猪羊.docx(17页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
免疫组化总结猪羊
免疫组化阶段总结
一实验所用试剂配方:
1苦味酸饱和液的配制:
1缓冲液:
1×TBS:
6.06gTRIS,8.5gNaCL,先加超纯水溶解(约800ml)然后使用pH计调节pH至7.4,定容至1L。
2抗原修复液:
根据Sigma抗体说明书配制。
1×柠檬酸钠缓冲液(0.1mol/l):
二水柠檬酸三钠2.941g;0.292gEDTA加超纯水溶解(约800ml),调节pH至6.0,定容至1L。
1×Tris/EDTA:
4.84gTris,3.72gEDTA,加超纯水溶解(约800ml)调pH至9.0,定容至1L(先加较多NaOH)。
3细胞通透液:
使用超纯水配制0.5﹪Tritonx-100,在100ml超纯水中加入0.5mlTritonx-100后轻轻搅拌,尽量不要产生气泡,直至溶解完全方可使用。
4封闭血清:
根据二抗来源选择封闭血清,一般血清来源于二抗来源形同。
血清浓度为10%,TBS配制,或者使用3﹪BSA配制10﹪封闭血清。
5抗体稀释液:
使用TBS配制3﹪BSA。
63﹪H2O2:
30﹪H2O2,超纯水配制。
7DAB显色液(试剂盒)配制:
1mlTBS中加50mlA液,50mlB液,充分混匀。
8荧光二抗的配制:
AlexaFlour488、594规格为2mg/ml,说明书建议使用浓度在2ug/ml-10ug/ml之间,所以建议稀释200-1000倍,本实验所使用浓度为5ug/ml,即稀释400倍。
二组织采集与处理
材料:
取不同时间点猪的睾丸组织观察精原干细胞的表达,新生小猪,3-5月龄,成年猪。
采集适龄猪睾丸组织,置于PBS中带回实验室,用PBS清洗若干次,将睾丸白膜去除,组织切成适宜大小,用苦味酸固定过夜,次日进行清洗(PBS)3-4次,每次30min,然后用70%酒精清洗3次,每次30min,储存于70%酒精备用。
包埋:
80%酒精--90%酒精—100%Ⅰ酒精--100%Ⅱ酒精各30min,无水乙醇:
二甲苯1:
12h,二甲苯Ⅰ,二甲苯Ⅱ依照所取组织大小确定处理时间,二甲苯:
石蜡1:
12h,石蜡Ⅰ1h,石蜡Ⅱ2h,包埋。
组织切片:
7um,37℃烤片5h。
三免疫组化(SP法,各种抗体稀释浓度附于后表):
1脱蜡:
二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5min。
复水:
100%乙醇Ⅰ、Ⅱ,90%乙醇,80%乙醇,70%乙醇各3min,超纯水清洗5min*3次。
2用超纯水配制0.5%的Tritonx-100,室温孵育10min,超纯水清洗3*5min。
3抗原修复:
柠檬酸钠缓冲液(0.1mol/L,pH=6)高压修复:
将玻片同修复液(1L烧杯)一起放入高压锅内,加热加压至125℃,修复5min,放气后降温至90℃时将烧杯拿出自然冷却至室温。
TBS清洗3*5min;
微波修复:
柠檬酸钠缓冲液加热煮沸,将玻片置入烧杯内,加热6min,停1min,重复3次,冷却;
煮沸修复:
Tris/EDTA(pH=9)置于1L烧杯中微波炉里加热至沸腾,水浴锅提前加热至99℃。
置入玻片修复10min.自然冷却。
TBS清洗3*5min
43%H2O2(试剂盒)孵育10min.,TBS清洗3*5min。
5封闭血清(试剂盒),封闭2h,勿洗。
6一抗稀释:
含3%BSA的TBS。
置于湿盒,4℃过夜。
7次日,取出湿盒,恢复至室温40min,TBS清洗3*5min。
8二抗(试剂盒)室温孵育30min,TBS清洗4*5min。
9辣根过氧化物酶(试剂盒)室温孵育30min,TBS清洗4*5min。
10DAB显色,用倒置显微镜严格控制显色时间,待背景染色浅,特异性染色深时,终止染色,TBS清洗2*5min。
11苏木精:
3min,清洗(流水冲一下)后,5%冰醋酸分化30秒(可短些),流水蓝化5min,脱水(70%,80%,90%,100%Ⅰ,100%Ⅱ酒精各1min),二甲苯透明1min,中性树胶封片。
四免疫荧光染色(各种抗体稀释浓度附于后表):
1脱蜡:
二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5min。
复水:
100%乙醇Ⅰ、Ⅱ,90%乙醇,80%乙醇,70%乙醇各3min,超纯水清洗5min*3次。
2用超纯水配制0.5%的Tritonx-100,室温孵育10min,超纯水清洗3*5min。
3抗原修复:
柠檬酸钠缓冲液(0.1mol/L,pH=6)高压修复:
将玻片同修复液(1L烧杯)一起放入高压锅内,加热加压至125℃,修复4min,放气后降温至90℃时将烧杯拿出自然冷却至室温。
TBS清洗3*5min;
微波修复:
柠檬酸钠缓冲液加热煮沸,将玻片置入烧杯内,加热6min,停1min,重复3次,冷却;
煮沸修复:
Tris/EDTA(pH=9)置于1L烧杯中微波炉里加热至沸腾,水浴锅提前加热至99℃。
置入玻片修复10min.自然冷却。
TBS清洗3*5min
4封闭血清(10%),使用TBS稀释,封闭2h,勿洗(置于湿盒)。
5一抗稀释:
用含3%BSA的TBS稀释后置于湿盒,4℃过夜。
6次日,取出湿盒,恢复室温40min,TBS清洗3*5min。
7荧光二抗:
含3%BSA的TBS稀释,37℃(提前打开烘箱),30min,避光(以后都注意),TBS清洗4*5min。
第一次使用加Tween20(0.05%)的TBS清洗,二,三,四次使用TBS,每次5min。
8DAPI:
室温10min,TBS稀释,TBS清洗一次即可。
980%甘油缓冲液封片,荧光显微镜观察。
五免疫双荧光染色(各种抗体稀释浓度附于后表):
1脱蜡:
二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5min。
复水:
100%乙醇Ⅰ、Ⅱ,90%乙醇,80%乙醇,70%乙醇各3min,TBS清洗。
2用超纯水配制0.5%的Tritonx-100,室温孵育10min,超纯水清洗2*5min。
3抗原修复:
柠檬酸钠缓冲液(0.1mol/L,pH=6)高压修复:
将玻片同修复液(1L烧杯)一起放入高压锅内,加热加压至125℃,修复4min,自然降温至90℃,放气,将烧杯拿出自然冷却至室温;
微波修复:
柠檬酸钠缓冲液加热煮沸,将玻片置入烧杯内,加热6min,停1min,重复3次,冷却;
煮沸修复:
Tris/EDTA(pH=9)加热至沸腾,水浴锅调至99℃.置入玻片修复10min.自然冷却。
TBS清洗3*5min
4封闭血清(10%),TBS稀释,封闭2h,勿洗。
5一抗稀释:
使用含3%BSA的TBS稀释,两种抗体混合稀释,如要配制50ulTHY1-PLZF抗体,则用50ul抗体稀释液中加1ulTHY1和1ulPLZF。
置于湿盒,4℃过夜。
6次日,取出湿盒,恢复室温40min,TBS清洗3*5min。
7荧光二抗:
含3%BSA的TBS稀释,两种抗体混合稀释,如需要400ul双荧光二抗,则在400ul抗体稀释液中分别加入1ul488和594,37℃,30min,避光,TBS清洗4*5min。
第一次使用加Tween20(0.05%)的TBS清洗,二,三,四次使用TBS,每次5min。
8DAPI:
室温10min,TBS稀释,TBS清洗一次即可。
980%甘油缓冲液封片,荧光显微镜观察。
各种抗体适合修复方法及稀释比例(猪,羊)
种属
抗体
稀释比例
(SP法)
荧光
修复液
修复方法
猪
PGP9.5(5月)
1:
1000
1:
500
柠檬酸钠缓冲液
高压
VASA(5月)
1:
400
1:
400
Tris/EDTA
煮沸
GPR125(3,5月)
1:
100
1:
50
Tris/EDTA
煮沸
THY1(5天,10天,3月)
1:
100
1:
50
Tris/EDTA
煮沸
PLZF(10天,3月)
1:
100
1:
50
Tris/EDTA
煮沸
GATA4(10天,3月)
1:
100
1:
50
柠檬酸钠缓冲液
高压
DBA(10天)
1:
100
未作
柠檬酸钠缓冲液
微波
小鼠
LIN28
1:
200
未作
柠檬酸钠缓冲液
高压
VASA
1:
400
未作
Tris/EDTA
煮沸或高压
大鼠
PGP9.5(2周)
1:
1500
1:
1000
Tris/EDTA
煮沸
注意事项:
1组织处理时,组织快不能切太小,否则不能保证切片数量;不能切太小,否则透明时间和浸蜡时间不好把握。
切片厚度以5um或7um为佳,贴片需使用多聚赖氨酸包被的玻片,展片是要把握好展片温度,一般多聚甲醛与苦味酸固定的组织所用温度不同,苦味酸大概所需温度为45℃左右,多聚甲醛为42℃左右,展片后要在37℃烘烤4-6小时。
2包埋蜡温度不宜过高,以免烫坏组织,切片时易碎,透明时间要依据组织块大小准确把握。
3脱蜡要彻底,复水后使用超纯水将酒精清洗干净,TBS缓冲液和抗原修复液的pH值要准确,否则不利于抗原抗体复合物的形成。
4抗原修复后要自然冷却,切不可立即清洗,易造成脱片,H2O2浓度不能太高,孵育时间不宜太长,否则易脱片。
5血清封闭后勿洗,加一抗前使用离心机将一抗离心,加稀释液后,用枪反复吹打,一定要将一抗混匀。
6次日将湿盒从冰箱拿出后恢复至室温,如若使用了不同抗体,清洗时要分开清洗。
7二抗孵育完后可多次清洗以减少背景,免疫组化后苏木精复染要把握好时间,以免苏木精颜色过深影响免疫组化效果,免疫荧光染色一定要避光操作,孵育时可置于恒温烘箱中,清洗时可用锡箔纸包住染色缸。
作好免疫组化染色必须注意的问题
一、为达到免疫组织化学技术的要求,组织固定越新鲜越好。
在免疫组化最后结果的判断时,常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象,经多方研究认为,它是一种假性非特异性的染色。
因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散,肿瘤细胞无限制的生长和生长过速,导致肿瘤中间部分组织血液供给困难,造成缺血坏死,坏死细胞中的抗原由于机体的作用,可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质,这是抗原发生弥散的一种方式。
另一种抗原弥散的方式就是,由于组织没有及时的固定所引起的。
离体的组织不及时固定,组织就会自溶,抗原就会扩散,这是一非常普通的常识,但要做好却是极不容易。
标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间,在这段时间里,有的抗原就可以发生扩散。
虽然已浸入了固定液,但标本较大,固定液的量又不足,当然由于固定液的渗透需要时间,当渗入到组织之中时,中间的细胞已发生了变化,抗原也随着发生扩散,这种现象在产酶多的器官是比较明显的,如胃癌,当切除后标本较大,虽然在手术室期间已放入了固定液,但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间,当固定液发挥作用时,组织已经发生变化。
因此,这了达到免疫组织化学染色的要求,对于离体的组织尽量快的进行固定,有条件的应将其剖开,早取材,早固定。
二、组织脱水必须彻底干净
组织块取材不能太大过厚,才能较好地完成脱水的过程。
如果取材太厚,在较短的时间内脱水不完全,将可引起一系列的问题,比如浸蜡不彻底,切片不好完成,切不完整。
由于先天不足,导致后来切片染色的脱落,造成染色的失败,或者由此反复操作,造成年人力物力的浪费,造成病理报告的延期发出等。
因此,对取材的要求是除了要求要有艺术性外,即平整、外观好看,还要求适中。
三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折
应用于免疫组织化学染色的切片,对切片的质量要求较高,切片必须完整,平展、无汽泡,无邹折,这样有利在染色时的冲洗,有利于切片的牢固附贴。
如果切片不平展,免疫组化染色后,可出现染色不均匀的现象,颜色深浅不一, 不平。
如果切片有汽泡切片在烘烤时,由于汽泡的破裂影响了汽泡周围的组织,在其周围可观察到深浅不一的染色。
如果切片有邹折,免疫组化染色后,在邹折的地方有深浅不一的颜色,这是一种假阳性,容易引走混淆。
四、切片的附贴必须牢固,必须使用合适的粘贴剂。
免疫组织化学染色前的前期准备工作,就是必须对新的载玻片进行处理,新的载玻片表面看起来很干净,有人认为不需要进行任何的处理,都能够适合使用,这是一种错误的想法。
新出厂的载玻片,表面复盖着开一层油脂样的物质,如果不加以处理,对切片的附贴是极为不利的。
我们的做法是:
新的载玻片,放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜,然后取出,经自来水彻底冲洗后,浸入酒精中达2小时以上,取出擦干备用或烘干也可。
然后再将载玻片浸入了-氨基-三乙氧基-GPR125(3,5月)1:
1001:
50Tris/EDTA煮沸
五、切片必须烘烤附贴牢固,既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片,又不至于破坏抗原。
应用于免疫组化染色的切片。
由于整个过程需经几个阶段的处理,如抗原修复时抗原修复液的沸腾且需持续十几分钟,PBS的反复冲洗,有的甚至于4℃冰箱中孵育达十几小时。
因此,对切片的质量要求很高,尤其是切片的附贴程度。
以往有人主张切片在60℃以下烘烤30-60分钟即可按此进行结果是切片掉片严重,切片松动率占100%。
切片究竟烘烤多长时间才合适,既不脱片和适合各项要求,又不至于破坏抗原。
几组实验[]诊断P173认为,切片在60℃的恒温干燥箱中烘烤2-5小时最为合适。
这是因为:
抗原可耐受如此的温度,病理科一般使用的石蜡,其熔点在60℃左右,组织浸蜡时,浸蜡箱中的温度,一般都调在65℃左右,组织在这样温度中要浸泡2小时以上,才能达到彻底地浸蜡。
组织中的抗原已经受了65℃的温度考验,保存下来的抗原,都已具有耐热性。
另外,经上述时间烘烤出来的切片,附贴牢固,抗原保存好,染色成功率达100%,保证了病理诊断的及时性和准确性。
特需要注意的是,不管是应用于诊断的切片还是研究用的切片,烘烤后应尽快进行染色。
如果切片切完后,迟迟不进行染色,存放于室温中或工作冰箱中,切片中的抗原将会随着时间的延长而逐渐消失,甚至出现假阴性。
原则上是新鲜切片,即行染色,染多少张切多少张,这样才能尽可能的保存表达更多的抗原。
六、切片脱蜡必须干净,否则将会影响免疫组化染色的最后结果。
蜡不溶于水,不与其它的临床使用的抗体相融合。
它只能靠特用的试剂,处理足够的时间,才能将其除去。
如果脱蜡不干净,少许蜡存留于切片上,将会引起许多弊病,如染色不均匀,阳性物时隐时现,真假难辨,背景染色增加等。
为了解决上述的问题,切片在染色前必须彻底脱蜡,目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯,因它脱蜡力强,脱蜡时间较短。
较受使用者的青睐。
脱蜡的时间要根据季节,室温和试剂的新鲜谋面是在不同。
如果在夏天,室温较高,脱蜡试剂也新鲜,则脱蜡时间不需很多,3-5分钟就已足够。
如果在冬天,室温较低,脱蜡试剂也较陈旧,则脱蜡时间需要延长,10-20分钟或更长。
总之,操作时应根据不同的季节,不同的室温,不同的试剂来决定,脱蜡的时间,原则上是要彻底,干净,完全地脱去切片上的蜡。
为了做到这一步,切片在脱蜡前的加温将有助于完成上述的要求。
比如:
当天切的切片,烧烤2小时后进行染色,切片带有温度进行脱蜡这将可加速脱蜡的过程,如果预先切好烤好的切片,在染色前,还必须对切片进行加温10-20分钟,然后再行脱蜡,这样脱蜡速度加快,效果魁伟更好。
七、必须彻底抑制内源性过氧化物酶的活性,才能降低背景的染色。
在各种组织中都含有很多的内源性过氧化物酶,尤其在红细胞,中性粒细胞,单核细胞嗜酸性细胞,出血的组织坏死的组织等等。
含有这种酶的各细胞和组织如果在染色前不对其进行处理和抑制,它们将会在DAB底物的显色时,与HRP一样催化底样,使之显色,使之生成与阳性物一样的黄棕色,造成混乱。
为止,在免疫组化染色前,都必须对内源性过氧化物酶进行抑制。
当然,对它们进行彻底的消除是不行的,因为抑制太厉害,对抗原也会有相同的抑制作用。
氢在抑制内源性过氧化物酶时,也要注意对抗原的保护抑制也只能对它们中的大部分在DAB显色后,显示出淡黄*色,这就足以与真正阳性物的区别。
抑制剂常用的是0.3%的H2O2,也可将其称为1%H2O2,因为市售的H2O2的浓度为30%,按其净含量则为0.3%,如果按其溶液的用量则为1%。
关于H2O2的使用,有的使用是单纯的H2O2稀释溶,有的使用是H2O2甲醇混合 物。
根据实验,认为H2O2甲醇较适合于大多数的情况,因为除了H2O2外,甲醇对各种酶,都有钝化的作用,因此H2O2甲醇的双重作用效果较好。
陈尚平等认为在多数情况中,用甲醇H2O2已经获得令人满意的结果。
八、须适当合理地使用封闭试剂
为了减少背景产生的非特异性染色,在免疫组化染色的过程中,在加入一抗孵育前,常常加入非免疫动物血清,以减少背景的染色,陈尚季等认为:
抗体是高度的电荷分子,可能与带有相应电荷的组织成分无特异性地结合(如胶原)。
由于这种非特异性结合,将导致标记的部分局部化(轭合物)和胶原的假阳性染色。
要用一种不相干的抗体居先处理,可能减少和标记的抗体无特异性结合。
以往,血清的使用有很多,如:
小牛血清,马血清,山羊血清,绵羊血清,兔血清,浓度也有很多种,如:
1%.2%.或1:
5、1:
10、和1:
20.
必须选择合适的抗体以及对作适当的保存和配制。
九、选择合适的抗体
至今为止,应用于临床的常用抗体有几十种,在这当中又可分为两种类型。
1.浓缩型抗体
根据近几年来使用的情况认为,它有许多优点,但也有许多不足之处:
①可作为各种疾病检测的常备抗体。
在各单位的常规活检诊断中,有常见的病例,也有罕见的病例,尤其是后者,有时很长时间才遇到一例,这就给抗体的应用和备用提出了更高的要求,如除了常用的抗体外,还需备用一些较为罕见病例的抗体。
这样才能解决临床的诊断问题,如临时购买,则需较长的时间,这样就会延误诊断。
实践证明:
浓缩型抗体,可作为常备检测抗体。
当购买抗体后,根据检测病例的数量,在无菌的条件下,将抗体分成小包装,然后用蜡膜封起来,于-30℃的低温冰箱中保存,临用时取出一支,用指温促其回升至室温,然后用PBS稀释即可使用,这种抗体可保存3年左右。
②成本低,价格较便宜。
它与即用型的抗体相比较,价格要便宜好多,如以某公司2002年-2003年的CK为例,浓缩型的抗体0.1ml,价格260元,该抗体可稀释为5000ml,以每张切片所需抗体为50ul计,可标记100例,每例一抗体所需2.6元,而即用型抗体1.5ml,价格150元,可标记30例,每例一抗体需5元。
③需要稀释抗体,手续较为复杂。
对于新购入的浓缩型的抗体,使用时必须将稀释为工作液,才能使用,对于从未用过的抗体,还必须实验其实际的稀释度,因为各种抗体,厂家都做了相应的稀释度的实验,但这是大概的稀释度,要使抗体真正适合于本单位的稀释度,就必须对抗体的稀释度进行实验,如1:
100.1:
75.1:
50.1:
25等,如果结果在1:
50上是最佳结果,这就是最佳的稀释点,如果在这范围内找不出最佳稀释点,则应继续实验直到找出最佳稀释点为止。
④需要配置各型号的微量加样器,以利于量取精确的抗体量。
⑤需要具备一定的英语水平,因为浓缩型的抗体多为进口试剂,其使用书都以英文为主,其中涉入抗体的来源,适应让稀释对什么组织或细胞可起反应等。
2.即用型抗体。
近几年来,免疫组化技术应用的推广,即用型抗体的应用越来越受到人们的欢迎,根据几年来的使用,认为它有许多优点和不足:
①使用方便。
对于初学者来说,它是一种最好的抗体,不管什么样的病例和切片,只要有抗体,不需要自己摸索稀释度,拿起试剂瓶一滴即可,极不方便。
②对于不具备或基本不懂免疫组化技术的人,只要按照说明书的方法使用,也能获得理想的结果。
③不需要配置多种昂贵的微量加样器。
现今的微量加样器,如为进口货,贵者多达两千多元。
而即用型抗体无需再行稀释,即买即用,无需配备其余器械。
④特别适合于基层单位。
基层单位,无需多大的投资,就能开展免疫组化的工作,这对于提高诊断的准确率,极有好处。
⑤价格较浓缩型抗体贵。
⑥即用型抗体不可作为常备贮存抗体。
即用型抗体,一般有效期为一年。
如果用量大的单位,对于3ml一个包装的抗体,一年需要用几支,这对抗体来说,不会造成浪费。
但如果为较小的单位,一年中标记的病例较少,购买抗体时也尽量选小包装的抗体,如1.5ml。
如果碰上罕见的病例,有时一年也标记不了几例,这样就应采用浓缩的了。
即用型的抗体,有效期为一年,但真正购买到的抗体使用期就不可能为一年,因为抗体从生产商到销售商的手里,需要一定的时间,如果运气好的话,你购买到的抗体,是刚交到销售商的手里,那么,使用的时间可能长些,但如果在销售商的手中滞留了一段时间,抗体的有效使用期就可能不会太长,五个月、六个月或者三个月。
如果在有效的时间内不能使用完。
稍为超过一些时间还可以,如果时间过长,就应当丢弃,因为会影响标记的质量。
有人抱怨,刚买的抗体标记很好,后来就渐渐不好了。
这是因为随着时间的延长,抗体的活性会逐渐失去生物活性,导致了标记质量的下降。
(2)抗体的适应症。
在众多的抗体中,按它们的实际使用范围,把它们分为两个类:
1.适合于冰冻切片,涂片,细胞培养片。
2.适合于石蜡切片,冰冻切片,涂片和细胞培养片。
(3)选择合适的单克隆或多克隆抗体。
抗体除了分为上述的两个类外,从其克隆的高度讲,也有单克隆和多克隆之分。
1.单克隆抗体,在目前临床常用的抗体当中,大部分都是单克隆抗体。
这要归功于生物技术的不断提高。
在早些时候,应用于临床的抗体,大多数为多克隆抗体。
2.多克隆抗体,在临床应用的抗体中,还有少部分的抗体为多克隆抗体。
(4)抗体的加入。
这看似很简单的问题,如果处理不好也可导致不同的结果,如果应用自动免疫组织化学染色仪,将程序输入即可,如为手工操作,就必须注意以下的问题:
1.当PBS冲洗完毕后,在加入抗体,如一抗,二抗或三抗。
必须将存留于切片上的多余的PBS摔干,但不能让切片干涸,切片干涸,往往可产生非特异性染色,切片上PBS存留过多,将会稀释加入的抗体,影响加入抗体的浓度,同时也将影响最后的结果,如假阴性等。
2.加入的抗体以一滴为佳。
当擦干组织块周边多余的PBS后,切片保持着一定的湿润度,此时加入另外的抗体为最佳时候,滴入抗体以一滴50ul为好,加入后,轻微地摇匀地覆盖于切片上,使最后的结果稳定均衡,不至于有的地方有反应,有的地方无反应。
3.切片没擦好将会影响加入抗体的质量,切片没冲洗干净,没擦试好,当加入抗体后,它可缩于切片的一边,此时你为了使加入的抗体能够完全地覆盖整个切片,便会使劲地加入抗体,此时的结果是,抗体依然滑向一边,或者完全露出,这不光没达到目的,还浪费抗体,正确的做法就是彻底地用PBS冲洗,摔干切片擦干切片周边的PBS,再滴入一滴抗体轻轻摇匀即可。
(5)选择合适的孵育时间。
第一抗体的孵育时间,有较多的使用范围,应用于临床检测抗体的孵育时间。
一般室温下孵育在30-60分钟,120分钟,对于研究性质的抗体孵育时间,也可按照上述的时间,但也有人提出于4℃冰箱中过夜孵育,根据我们的经验一般不主张于4℃冰箱中过夜,原因是:
1.长时间的孵育可以使一些非特异性的物质沉淀下来,或者被吸附,造成背景的染色。
2.目前销售的抗体,纯度较高,特异性较强,不需要长时间的孵育,也能够结合得很好。
3.长时间的孵育,较容易引起切片的脱落,造成染色的失败。
4.长时间的孵育,不利于临床病理报告的发出。
十、连接抗体的选用必须正确,否则可造成假阴性的现象。
免疫组化染色方法较多,如ABC法,SP法和EV二步法等,如果使用的是SP法,或者ABC法,这时就必须要仔细地选择好连接抗体,第一抗体有单克和多克隆炎分,连接抗体则要根据选用的抗体来进行,例如:
第一抗体选用的是单克隆鼠抗人**抗体,连接抗体也要选择相应的免抗鼠IgG,这样才能连接上(目前生产厂家已生产出混合型抗体,即既适合于单克隆抗体,也适合于多克隆抗体
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 免疫 总结