基因表达和检测-_精品文档.ppt
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基因克隆原理和应用基因克隆原理和应用蛋白A是一个胞浆蛋白,刺激之后会转移到细胞核,怎么能实时观察它的入核呢?
在组织里检测到蛋白A和蛋白B有相互作用,怎么能知道它们是否有直接的相互作用,以及决定它们相互作用的序列是哪一段?
Questions一些基本的概念一些基本的概念基因基因(gene)是遗传的物质基础,是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。
基因表达基因表达(geneexpression)是指细胞在生命过程中,把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子。
生物体内的各种功能蛋白质和酶都是相应的结构基因编码的。
克隆克隆(clone),来源于希腊语Klon(嫩枝)。
在园艺学上,克隆是指通过营养生殖产生的单一植株的后代,很多植物都是通过克隆这样的无性生殖方式从单一植株获得大量的子代个体。
在广义上是指利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组后代的过程。
在生物学上,是指选择性地复制出一段DNA序列(分子克隆)、细胞(细胞克隆)或是个体(个体克隆)。
基因克隆基因克隆(geneclone)基因克隆是指在体外对DNA按照即定目的和方案进行人工重组,将重组DNA进行扩增以获得目的基因的大量拷贝。
克隆基因表达的目的克隆基因表达的目的1)探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理2)克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构和功能的研究3)某些特定生物活性的蛋白质可以在宿主细胞中大量表达而获得,因此在医学上甚至工业都有很重要的应用价值。
(胰岛素制备,生长激素等)基因克隆技术基因克隆技术Paul.Berg1980NobelPrice1972年把一种猿猴病毒的DNA与噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后,再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来,于是产生了一种新的重组DNA分子,从此产生了基因克隆技术。
WalterGilbert1980NobelPriceFrederickSanger1980NobelPrice1975年时,共同发展出一种称为链终止法(chainterminationmethod)的技术来测定DNA序列,主要是先进行PCR,利用DNA引物和DNA聚合酶使DNA链得以展开复制,再利用双去氧核苷酸(dideoxynucleotides)来终止DNA链的合成StanelyCohen1986NobelPrice1973年,科恩(S.Cohen)等人把一段外源DNA片段与质粒质粒DNA连接起来连接起来,构成了一个重组质粒,并将该重组质粒转入大肠杆菌,第一次完整地建立起了基因克隆体系。
细菌质粒(细菌质粒(plasmid)HerbertW.Boyer发现细菌的基因可与真核生物基因结合。
用转基因细菌人工合成了胰岛素,随后在1979年合成了生长激素。
1976年与罗伯特斯旺森建立了基因泰克公司。
1980年获拉斯克基础医学研究奖,1990年获国家科学奖章,2004年获邵逸夫奖。
是一种细胞质遗传因子,是细菌细胞内独立于染色体外的一种复制子,它在细胞分裂时,能恒定地传给子代细胞,并能给细胞带来表观效应,但是它的消失并不影响细胞生存染色体与质粒染色体与质粒存在于染色体外(细菌的DNA除大部分集中于核质内)双链环形DNA分子量远比染色体为小,仅为细菌染色体DNA的0.53%质粒亦可携带遗传信息,可决定细菌的一些生物学特性质粒并非细菌生存所必不可少的遗传物质质粒的传递(转移)是细菌遗传物质转移的一个重要方式。
有些质粒本身即具有转移装置,如耐药性质粒(R质粒);质粒可自行失去或经人工处理而消失。
质粒可以独立复制可有几种质粒同时共存在于一个细菌内1.质粒并非细菌生存所必不可少的遗传物质。
细菌如失去染色体,则不能生存;然而细菌失去质粒后仍能生存。
这是由于染色体DNA携带的基因所编码的产物,在细菌新陈代谢中是生存所必须者;而质粒携带的基因所编码的产物并非细菌的生存所必须者。
因此质粒可以在细菌间传递与丢失。
2.质粒的传递(转移)是细菌遗传物质转移的一个重要方式。
有些质粒本身即具有转移装置,如耐药性质粒(R质粒);而有些质粒本身无转移装置,需要通过媒介(如噬菌体)转移或随有转移装置的质粒一起转移。
获得质粒的细菌可随之而获得一些生物学特性,如耐药性或产生细菌素的能力等。
3.质粒可自行失去或经人工处理而消失。
在细菌培养传代过程中,有些质粒可自行从宿主细菌中失去。
这种丢失不像染色体突变发生率很低,而是较易发生。
用紫外线、吖啶类染料及其他可以作用于DNA的物理、化学因子处理后,可以使一部分质粒消失,称为消除。
目前学者们感兴趣的是如何通过人工处理消除耐药质粒或与致病性有关的质粒。
4.质粒可以独立复制。
质粒为DNA,有复制的能力,质粒的复制可不依赖于染色体,而在细菌胞浆内进行。
这一特性在基因工程中需扩增质粒时很有用处,因可使细菌停止繁殖而质粒仍可继续复制,从而可获得大量的质粒。
5.可有几种质粒同时共存在于一个细菌内。
因质粒可独立复制,又能转移入细菌和自然失去,因此就有机会出现几种质粒的共存。
但是并非任何质粒均可共存,因发现在有些情况下,两种以上的质粒能稳定地共存于一个菌体内,而有些质粒则不能共存。
质粒质粒基因克隆基因克隆基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术,可概括为分、切、连、转、选。
分是指分离制备合格的待操作的DNA,包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA;切是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA,或者切出目的基因;连是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来,形成重组的DNA分子;转是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增;选则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。
基因工程技术的两个最基本的特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达,而分子水平上的操作即是体外重组的过程,实际上是利用工具酶对DNA分子进行外科手术。
播放视频分分切、连切、连转转选选1.如何寻找合适的载体如何寻找合适的载体/质粒?
质粒?
1)质粒的分类)质粒的分类2)质粒各个元件的识别)质粒各个元件的识别2.如何扩增得到如何扩增得到DNA片段片段1)PCR技术技术2)引物设计)引物设计3.如何将目的基因与载体连接?
如何将目的基因与载体连接?
1)内切酶,连接酶)内切酶,连接酶2)连接反应)连接反应4.如何将载体导入细胞或质粒?
如何将载体导入细胞或质粒?
5.基因产物的检测基因产物的检测基因克隆基因克隆1.如何寻找合适的载体如何寻找合适的载体/质粒?
质粒?
1)质粒的命名2)质粒各个元件的识别3)质粒的分类1)质粒命名)质粒命名质粒载体的命名,首字母用小写p表示,后面是一些描述性的缩写,如:
pBR322的字母代表研究者F.Bolivar和R.Rodriguez,而322是与研究者设计相关的数字编码。
1.如何寻找合适的载体如何寻找合适的载体/质粒?
质粒?
1)质粒的命名2)质粒各个元件的识别质粒各个元件的识别*3)质粒的分类2)质粒的各个元件质粒的各个元件一个复制子(一个复制子(replicon)(DNA复制是从一个DNA复制起点开始,最终由这个起点起始的复制叉完成的片段。
)几个克隆位点几个克隆位点一个选择性标记一个选择性标记复制子复制子多克隆酶切位点多克隆酶切位点(MCSmultiplecloningsite)选择性:
选择标记基因和筛选标记基因选择性:
选择标记基因和筛选标记基因选择标记基因抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记。
1氨苄青霉素抗性基因(Ampicillinresistancegene,ampr)2四环素抗性基因(Tetracyclineresistancegene,tetr)3氯霉素抗性基因(chloramphenicolresistancegene,Cmr,cat)4卡那霉素和新霉素抗性基因(kanamycin/neomycinresistancegene,kanr,neor)5琥珀突变抑制基因supFampR筛选标记基因筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒,当一个外源DNA片段插入到一个质粒载体上时,可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒,即重组质粒。
1插入失活通过插入失活进行筛选的质粒主要有pBR322,该质粒具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)两种抗性标记。
当外源DNA片段插入tetr基因后,导致tetr基因失活,变成只对氨苄青霉素有抗性。
这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。
2-互补(-complementation)选择性:
选择标记基因和筛选标记基因选择性:
选择标记基因和筛选标记基因ampR筛选标记基因筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒,当一个外源DNA片段插入到一个质粒载体上时,可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒,即重组质粒。
1插入失活2-互补(-complementation)-互补(Alphacomplementation):
噬菌体载体的基因间隔区插入E.coli的一段调节基因及lacZ的N端146个氨基酸残基编码基因,其编码产物为半乳糖苷酶的片段。
突变型lac-E.coli可表达该酶的W片段(酶的C端)。
单独存在的及W片段均无半乳糖苷酶活性,只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段时,宿主细胞内才有半乳糖苷酶活性,使特异性作用物变为蓝色化合物,这就是所谓的-互补。
选择性:
选择标记基因和筛选标记基因选择性:
选择标记基因和筛选标记基因选择性:
蓝白斑筛选选择性:
蓝白斑筛选lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补,称为-互补。
由-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下,在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落,因而易于识别。
然而,当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后,几乎不可避免地导致无-互补能力的氨基端片段,使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。
这种重组子的筛选,又称为蓝白斑筛选。
如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37温箱倒置培养12-16hr后,有重组质粒的细菌形成白色菌落。
1.如何寻找合适的载体/质粒?
1)质粒的命名2)质粒各个元件的识别3)质粒的分类克隆载体表达载体转染受体细胞转染受体细胞克隆载体克隆载体(pBR322,pUC19)克隆载体主要用于扩增或保存DNA片段,是最简单的载体。
大多是高拷贝的载体,一般是原核细菌,将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接,再导入原核细菌内,质粒会在原核细菌内大量复制,形成大量的基因克隆,被克隆的基因不一定会表达,但一定被大量复制。
克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒,所以常带有较强的自我复制元件,如复制起始位点等,往往在菌体内存在多拷贝,所以抽质粒会抽出一大堆。
但不具备表达元件。
能在宿主细胞中复制繁殖,而且最好要有较高的自主复制能力。
容易进入宿主细胞,而且进入效率越高越好。
容易插入外来核酸片段,插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。
这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。
容易从宿主细胞中分离纯化出来,这才便于重组操作。
有容易被识别筛选的标志,当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。
这才用于克隆操作表达载体表达载体就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、SD序列、终止子等),是目的基因能够表达的载体。
是否含有表达系统元是否含有表达系统元件,即启动子件,即启动子-核糖体结合位点核糖体结合位点-克隆位点克隆位点-转录终止信号,这是用来转录终止信号,这是用来区别克隆载体和表达载体的标志区别克隆载体和表达载体的标志。
根据受体细胞的不同可分为:
根据受体细胞的不同可分为:
1原核表达系统原核表达系统将外源基因引入原核细胞,并使其在原核细胞中快速高效地表达、将外源基因引入原核细胞,并使其在原核细胞中快速高效地表达、合成基因产物的体系。
合成基因产物的体系。
2真核表达系统真核表达系统使外源基因在真核细胞中表达的体系。
使外源基因在真核细胞中表达的体系。
原核表达系统的重要调控元件:
原核表达系统的重要调控元件:
启
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