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霍乱的实验室检测霍乱的实验室检测nn什么是霍乱什么是霍乱什么是霍乱什么是霍乱?
霍乱是由霍乱是由0101群和群和01390139群群霍乱弧菌(霍乱弧菌(VVcholeraecholerae)引起的急性肠道传染病,发病急、传播速度快、波引起的急性肠道传染病,发病急、传播速度快、波及范围广、危害严重的及范围广、危害严重的甲类传染病。
甲类传染病。
霍乱概述古典生物型古典生物型小川型小川型Ogawa(AB)O1群群稻叶型稻叶型Inaba(AC)埃尔托生物型埃尔托生物型彦岛型彦岛型Hikojim(ABC)霍乱弧菌霍乱弧菌霍乱病原菌霍乱病原菌O139群(群(Bengal)非非O1群群O2-O200群群腹泻病原菌腹泻病原菌毒毒素素霍乱肠毒素霍乱肠毒素(CT):
前噬菌体基因编码前噬菌体基因编码小带联结毒素小带联结毒素Zot增加肠黏膜通透性增加肠黏膜通透性副霍乱肠毒素副霍乱肠毒素Ace肠段积液肠段积液侵袭力侵袭力鞭鞭毛毛菌毛:
菌毛:
acf、tcpA致病物质致病物质CTCT的结构的结构B亚单位:
亚单位:
与小肠粘膜上皮细胞与小肠粘膜上皮细胞GM1神经节苷脂受体结合;神经节苷脂受体结合;由由1个个A亚单位和亚单位和5个个B亚单亚单位构成的多聚体,不耐热。
位构成的多聚体,不耐热。
(前噬菌体基因编码)(前噬菌体基因编码)1A+5B所致疾病:
烈性肠道传染病霍乱所致疾病:
烈性肠道传染病霍乱传染源传染源:
病人病人/无症状带菌者无症状带菌者,人是霍乱弧菌的唯一易感者人是霍乱弧菌的唯一易感者传播途径:
传播途径:
粪粪-口途径口途径流行特征:
地方性、季节性。
流行特征:
地方性、季节性。
霍乱典型临床特征霍乱典型临床特征患者出现上吐下泻,泻出物呈患者出现上吐下泻,泻出物呈“米泔水样米泔水样”。
并发症有血容量减少,并发症有血容量减少,循环衰竭及肾功能衰竭,循环衰竭及肾功能衰竭,导致尿闭、电解质、酸碱平衡失调导致肌肉痉挛。
导致尿闭、电解质、酸碱平衡失调导致肌肉痉挛。
免疫性感染后可获感染后可获牢固免疫力牢固免疫力;再感染少见;再感染少见局部黏膜免疫;抗菌抗体(局部黏膜免疫;抗菌抗体(O);抗毒素抗体);抗毒素抗体(B)O1群与群与O139群不存在交叉免疫保护作用。
群不存在交叉免疫保护作用。
nn病原体病原体病原体病原体O1O1群,群,O139O139群霍乱弧菌群霍乱弧菌nn发病特征:
发病特征:
发病特征:
发病特征:
剧烈腹泻、呕吐、严重脱水时致酸中毒、循环衰竭而致死亡剧烈腹泻、呕吐、严重脱水时致酸中毒、循环衰竭而致死亡不治疗或医疗很差的条件下病死率可达到不治疗或医疗很差的条件下病死率可达到20205050(重症病人达(重症病人达7070100100)nn培养特性:
培养特性:
培养特性:
培养特性:
营养要求不高,兼性厌氧,营养要求不高,兼性厌氧,营养要求不高,兼性厌氧,营养要求不高,兼性厌氧,37373737生长,怕酸嗜碱,生长,怕酸嗜碱,生长,怕酸嗜碱,生长,怕酸嗜碱,pH:
7.4-9.6pH:
7.4-9.6快速生快速生长长nn检验依据:
检验依据:
检验依据:
检验依据:
WS289-2008WS289-2008霍乱诊断标准霍乱诊断标准霍乱防治手册(霍乱防治手册(19991999年第五版)年第五版)霍乱的实验室检测nn样品的采集和运输样品的采集和运输样品的采集和运输样品的采集和运输nn不同样品的不同样品的不同样品的不同样品的病原分离流程及技术要点病原分离流程及技术要点病原分离流程及技术要点病原分离流程及技术要点粪便粪便粪便粪便水体水体水体水体水产品,食品等水产品,食品等水产品,食品等水产品,食品等nn平板分离及可疑菌落挑取平板分离及可疑菌落挑取平板分离及可疑菌落挑取平板分离及可疑菌落挑取nn菌落鉴定菌落鉴定菌落鉴定菌落鉴定nn常用快速检测方法常用快速检测方法常用快速检测方法常用快速检测方法胶体金检测条胶体金检测条胶体金检测条胶体金检测条荧光荧光荧光荧光PCRPCR检测检测检测检测nn检测工作中应关注的事项检测工作中应关注的事项检测工作中应关注的事项检测工作中应关注的事项样品的采集和运输样品的采集和运输nn采集:
采集:
采集:
采集:
病例:
粪便、肛拭子、呕吐物病例:
粪便、肛拭子、呕吐物未使用抗生素之前未使用抗生素之前“健康健康”人:
粪便、肛拭子人:
粪便、肛拭子其他传播环节的标本:
食物、水、环境类样品其他传播环节的标本:
食物、水、环境类样品监测:
水样,水产品等监测:
水样,水产品等运输:
运输:
运输:
运输:
一般要求在一般要求在33小时内小时内室温(室温(20-25)条件下)条件下送达实验室检测送达实验室检测C-BC-B运输培养基(运输培养基(pH8.4pH8.4);(或文腊二氏保存液)(或文腊二氏保存液)碱性蛋白胨水碱性蛋白胨水(pH8.4-9.2):
不是最佳的,尤其:
不是最佳的,尤其66小时内还不能进小时内还不能进行培养时,尽量采用行培养时,尽量采用C-BC-B运输培养基。
运输培养基。
nn粪便的采集与保存运送粪便的采集与保存运送粪便的采集与保存运送粪便的采集与保存运送以采集病人自然排除的新鲜粪便为主,水样便采取以采集病人自然排除的新鲜粪便为主,水样便采取113mL3mL,成形便采取,成形便采取指甲大小的粪量,亦可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内指甲大小的粪量,亦可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内335cm5cm处处采取,采集后的样品应尽快挑取接种于碱性蛋白胨水(采取,采集后的样品应尽快挑取接种于碱性蛋白胨水(8.8.-9.2-9.2),),同时划线分离选择性培养基(庆大四号平板),如不能在同时划线分离选择性培养基(庆大四号平板),如不能在小时内送达实验室检测的样品,应插入小时内送达实验室检测的样品,应插入Cary-BlairCary-Blair二氏半固体保存培养基二氏半固体保存培养基(或文腊二氏保存液)中送检。
标本与保存液比例约为(或文腊二氏保存液)中送检。
标本与保存液比例约为1515。
nn分离培养要点(两管三板法):
分离培养要点(两管三板法):
分离培养要点(两管三板法):
分离培养要点(两管三板法):
挑取粪便,直接接种于挑取粪便,直接接种于挑取粪便,直接接种于挑取粪便,直接接种于碱性蛋白胨水(第一管)中,同时划线分离选择碱性蛋白胨水(第一管)中,同时划线分离选择性平板(庆大四号平板,第一板)。
性平板(庆大四号平板,第一板)。
第一管第一管第一管第一管碱性蛋白胨水在碱性蛋白胨水在增菌小时,沾取菌膜下表层液体,增菌小时,沾取菌膜下表层液体,划线分离选择性平板(庆大四号平板,第二板),同时吸取划线分离选择性平板(庆大四号平板,第二板),同时吸取0.10.10.2ml0.2ml表层培养物表层培养物,接种碱性蛋白胨水(第二管)。
,接种碱性蛋白胨水(第二管)。
第二管第二管第二管第二管碱性蛋白胨水增菌小时后划线分离选择性平板(庆大四号碱性蛋白胨水增菌小时后划线分离选择性平板(庆大四号平板,第三板)。
平板,第三板)。
粪便粪便分离流程及技术要点分离流程及技术要点nn水体的采集与保存运送水体的采集与保存运送水体的采集与保存运送水体的采集与保存运送水体的采集一般用无菌的水体的采集一般用无菌的500ml500ml水样瓶采集相对静止的表层水水样瓶采集相对静止的表层水(深度为深度为30cm30cm以内以内)500ml)500ml,密封加盖后于室温(,密封加盖后于室温(20-2520-25)33小时内送达实验室小时内送达实验室检测。
检测。
nn分离培养要点(十倍浓缩碱胨水增菌培养法):
分离培养要点(十倍浓缩碱胨水增菌培养法):
分离培养要点(十倍浓缩碱胨水增菌培养法):
分离培养要点(十倍浓缩碱胨水增菌培养法):
取取450ml450ml水样,用水样,用1M1M氢氧化钠调整至氢氧化钠调整至pH8.4-9.2pH8.4-9.2。
然后加。
然后加1010倍浓缩碱性倍浓缩碱性胨水胨水50ml50ml。
再加入。
再加入1%1%亚碲酸钾亚碲酸钾0.250.250.5ml0.5ml和和10001000单位单位/ml/ml青霉素青霉素1ml1ml。
3737培养过夜,取菌膜下表层培养物接种选择性培养基(庆大四号培养过夜,取菌膜下表层培养物接种选择性培养基(庆大四号平板)分离培养,同时吸平板)分离培养,同时吸0.10.10.2ml0.2ml表层培养物表层培养物转种于碱性胨转种于碱性胨水管中作二次增菌,水管中作二次增菌,3737培养培养668h8h再划线接种于选择性培养基(庆大再划线接种于选择性培养基(庆大四号平板)。
四号平板)。
水体水体分离流程及技术要点分离流程及技术要点nn水产品的采集与保存运送水产品的采集与保存运送水产品的采集与保存运送水产品的采集与保存运送通常选取活的或者新鲜的水生动物为采集对象,有时也应考虑冰冻的水生通常选取活的或者新鲜的水生动物为采集对象,有时也应考虑冰冻的水生动物,有条件的采样点可将水生动物整体采回实验室再进行相关处置动物,有条件的采样点可将水生动物整体采回实验室再进行相关处置涂抹采集:
涂抹采集:
使用无菌棉签涂抹使用无菌棉签涂抹55只以上水水生动物表面、腮部及泄殖腔,直接接种到只以上水水生动物表面、腮部及泄殖腔,直接接种到20ml20ml碱性蛋白胨水作为增菌液处理。
碱性蛋白胨水作为增菌液处理。
整体或局部采集:
整体或局部采集:
在实验室应以无菌操作将其解剖,取鳃部和肠内容物在实验室应以无菌操作将其解剖,取鳃部和肠内容物2525克剪碎后,置灭菌均克剪碎后,置灭菌均质杯或均质袋中,加入质杯或均质袋中,加入225mL225mL倍体积的碱性蛋白胨水增菌;但小贝壳类动物,倍体积的碱性蛋白胨水增菌;但小贝壳类动物,则用锤子将外壳击碎,整体放入则用锤子将外壳击碎,整体放入100ml100ml三角瓶中,加入三角瓶中,加入5-105-10倍的碱性蛋白胨倍的碱性蛋白胨水增菌;甲壳类动物除含肉质部分外,其余部分水增菌;甲壳类动物除含肉质部分外,其余部分(包括鳃、肠、足、表层外包括鳃、肠、足、表层外壳等壳等)整体放入整体放入100ml100ml三角瓶中,加入三角瓶中,加入5-105-10倍的碱性蛋白胨水增菌。
倍的碱性蛋白胨水增菌。
nn分离培养(两管两板法):
分离培养(两管两板法):
分离培养(两管两板法):
分离培养(两管两板法):
接种后的接种后的碱性蛋白胨水碱性蛋白胨水3737培养过夜,取菌膜下表层培养物接种培养过夜,取菌膜下表层培养物接种选择性培养选择性培养基(庆大四号平板)基(庆大四号平板)同时吸同时吸0.10.10.2ml0.2ml表层培养物转种于表层培养物转种于10ml10ml碱性胨水管中作二次增菌,碱性胨水管中作二次增菌,3737培养培养668h8h再划线接种于再划线接种于选择性培养基选择性培养基(庆大四号平板)。
(庆大四号平板)。
水产品水产品分离流程及技术要点分离流程及技术要点nn可疑菌落挑取可疑菌落挑取可疑菌落挑取可疑菌落挑取经典的鉴定步骤要求经典的鉴定步骤要求经典的鉴定步骤要求经典的鉴定步骤要求每个平板应每个平板应每个平板应每个平板应挑取挑取挑取挑取5555个以上个以上个以上个以上可疑菌落可疑菌落可疑菌落可疑菌落,转种于转种于转种于转种于克氏双糖斜克氏双糖斜克氏双糖斜克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面面或者普通琼脂斜面面或者普通琼脂斜面面或者普通琼脂斜面待分纯培养后待分纯培养后待分纯培养后待分纯培养后,再进行再进行再进行再进行O1O1O1O1、O139O139O139O139群血清玻片凝集试验,群血清玻片凝集试验,群血清玻片凝集试验,群血清玻片凝集试验,鉴于对霍乱疫情应急处理的考虑鉴于对霍乱疫情应急处理的考虑鉴于对霍乱疫情应急处理的考虑鉴于对霍乱疫情应急处理的考虑,现大多数监测实验室一般采用将血清玻片现大多数监测实验室一般采用将血清玻片现大多数监测实验室一般采用将血清玻片现大多数监测实验室一般采用将血清玻片凝集试验前置的做法凝集试验前置的做法凝集
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