微生物限度方法学验证方案.docx
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微生物限度方法学验证方案
微生物限度检测方法学验证方案
文件编号:
P-
批准签字页
方案起草
岗位/职位
姓名
签字
日期
微生物岗/QC人员
方案审核
岗位/职位
姓名
签字
日期
微生物岗/组长
生产部/部长
质量部/QA监督员
方案批准
岗位/职位
姓名
签字
日期
总工
质量受权人
1.目的
按照中国药典2010版(第三部),采用薄膜过滤法进行微生物限度检查,本方案对新修订的方法进行验证。
2.范围
本公司要求进行微生物限度检查的原辅料和制剂,中间制品以及消毒剂。
3.责任者及职责
部门
职责
质量部QC
起草并审核验证方案
进行验证试验的具体操作
完成验证记录中相关操作记录的填写
根据验证结果起草和审核验证报告
总工
负责审核并批准验证方案和验证报告
质量部QA
审核并批准验证方案和验证报告
监督验证方案的实施
4.验证简介
4.1定义
●CFU:
菌落数
●供试品对照组
取规定量供试液,按菌落计数方法测定供试品本底菌数。
●试验组
当采取薄膜过滤法时,取规定量供试液,过滤,冲洗,试验菌加在最后一次冲洗液中,过滤后,取出滤膜接入对应培养基中。
●菌液组
测定所加的试验菌数。
●稀释剂对照组
用相应的稀释液替代供试品,按试验组规定的方法进行菌落计数。
样品组
样品溶液
菌悬液
(50-100CFU)
稀释液
平均菌落数
(CFU/皿)
供试液对照组
+
-
+
C供试液对照组
试验组
+
+
+
C试验组
菌液组
-
+
-
C菌液组
稀释剂对照组
-
+
+
C稀释剂对照组
4.2菌悬液
4.2.1菌种及来源
培养基名称
名称及代号
编号
批号
有效期至
来源
营养琼脂
培养基
金黄色葡萄球菌
Staphlococcusaureus
ATCC6538
ATCC
大肠埃希氏杆菌
Escherichiacoli
ATCC8739
枯草芽胞杆菌
Bacillussubtilis
ATCC6633
玫瑰红钠
琼脂培养基
白色念珠菌
Candidaalbicans
ATCC10231
黑曲霉
Aspergillusniger
ATCC16404
备注
检查人:
复核人:
检查日期:
4.2.2菌液制备
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上,30~35℃培养18~24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上,20~25℃培养24~48h。
上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50~100CFU的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上,23~28℃培养5~7天,加入3~5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。
然后,采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内,用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~100CFU的孢子溶液。
4.3培养基及稀释液
4.3.1培养基和稀释液的名称
培养基:
营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基
稀释液:
pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液、灭菌纯化水
4.3.2培养基灵敏度复核
培养基灵敏度复核,参见《培养基的灵敏度检查操作规程》QC252
4.3.3稀释液的无菌性检查
对稀释液进行无菌检查,14天规定温度培养后应无菌。
此操作可与其它试验同时进行。
4.4供试液的预处理
4.4.1样品名称及数量
样品编号
样品名称
取样量/批
批号
Sn-A
Sn-B
Sn-C
S01
******中间制品
1000ML
S02
*******成品
200g
S03
原辅料1
200g
S04
原辅料2
200g
S05
原辅料…..
200g
S06
消毒剂
20ml
S07
饮用水
100ml
S08
纯水制备过程水
100ml
S09
…….
备注
检查人:
复核人:
检查日期:
4.4.2样品预处理方法
●*******中间制品
无需处理,取原样品50ml作为供试液。
●******成品
无需处理,取原样品50ml作为供试液。
●原辅料1
取10g样品,加入灭菌后的PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,混匀待用;
●原辅料2
取10g样品,加入灭菌后的PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,混匀待用;
●原辅料….
取10g样品,加入灭菌后的PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,混匀待用;
●消毒剂(*******)按照比例进行配制。
取1ml样品,加入灭菌后的pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,混匀待用。
●饮用水
取1ml样品,加入灭菌后的纯化水至100ml,混匀待用。
●纯水制备过程水
取1ml样品,加入灭菌后的纯化水至100ml,混匀待用。
4.5实验用品
名称
型号
设备编号
厂家
半封闭薄膜过滤器
milliporeplus
millipore
生化培养箱
SHP-250
上海试验仪器厂有限公司
生化培养箱
SPX-250B-Z
上海博迅实业有限公司医疗设备厂
洁净工作台
SW-20-2FD
雷柏特
生物安全柜
NU-440-400E
美国NUAIRE公司
滤膜*
0.45μm
millipore
*滤膜材质为混合纤维素酯。
4.6参考文件
4.6.1中国药典2010版第三部附录XIIG-微生物限度检查法
4.6.2验证管理规程
4.6.3超标数据调查及处理管理规程
4.6.4异常情况管理规程
4.6.5培养基管理规程
4.6.6薄膜过滤法无菌检查操作规程
4.6.7培养基的灵敏度检查操作规程
4.6.8菌种复苏、传代及菌悬液制备操作规程
4.6.9微生物限度检查操作规程
4.6.10消毒剂微生物污染水平检测操作规程
5.验证过程
5.1试验次数:
验证试验应进行3次独立平行实验
5.2试验器具准备
试验前,将先前已准备的适量稀释液和培养基灵敏度复核检查合格的培养基、检品、无菌滤膜和无菌滤杯一同放入无菌室的传递厨内。
用消毒剂对无菌室进行消毒,并擦拭超净台,打开超净工作台风机及紫外灯灭菌1小时以上。
5.3测定
5.3.1按照无菌室更衣程序更衣,进入无菌室。
5.3.2用70%酒精棉球擦拭工作台面与待测品表面。
5.3.3在无菌环境下,取4.2.2项下配制的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50~100CFU,分别注入无菌平皿中,立即倾注营养琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,混匀,凝固,置30-35℃培养2天,计数;取4.2.2项下配制的白色念珠菌、黑曲霉各50~100CFU,分别注入无菌平皿中,立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,混匀,凝固,置23-28℃培养3天,计数;以上作为菌液组。
5.3.4在无菌环境下,将过滤设备安装完毕。
5.3.5取适量稀释液倒入滤杯中,待滤膜润湿后进行以下操作。
5.3.6将规定量的样品加入过滤器内(滤膜d47mm;φ0.45μm),减压过滤。
滤后,加100mlpH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗滤膜,重复n次(初步设定为3次,如需增加冲洗量可以适当增加冲洗次数,每次100ml,但总冲洗量不得超过1000ml),在最后一次的稀释液当中加入4.2.2项下配制的菌液,作为试验组,平行操作一次。
5.3.7不加入菌液重复5.3.4-5.3.6,作为供试品对照组。
5.3.8只加入稀释液和4.2.2项下配制的菌液作为稀释剂对照组。
5.3.9无菌操作取出滤膜,按下表加入对应培养基上,营养琼脂培养基30-35℃培养2天后观察,玫瑰红钠培养基23-28℃培养3天后观察。
营养琼脂培养基(细菌)
玫瑰红钠琼脂培养基(霉菌)
金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌
白色念珠菌、黑曲霉
5.3.10以上表中所选的菌按照5.3.2-5.3.9重复操作。
6.结果判断
在三次独立的平行试验中,稀释剂对照组的菌数回收率K1(稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率)应均不低于70%,试验组的菌落数回收率K2(试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率)均不低于70%。
稀释剂对照组的菌数回收率K1=
×100%
试验组的菌落数回收率K2=
×100%
7.结论和建议
此项中将根据实际测试的结果给出运行确认的结论,有异议的将给出建议。
8.异常情况报告
对验证中发现的任何异常/不合格情况应按照《异常情况管理规程》执行。
9.再验证
如该验证的试验方法或试验相关试剂发生改变,需再验证。
10.附件
10.1附件1培养基灵敏度检查记录
10.2附件2薄膜过滤法无菌检查记录
10.3附件3微生物方法学验证记录
10.4附件4培养基厂家报告
附件1:
培养基的灵敏度复核
培养基类型:
菌落计数用培养基
名称
批号
1菌悬液制备
菌种名称
菌种编号
菌种批号
培养温度
生长状况
培养时间
培养箱编号
金黄色葡萄球菌
ATCC6538
□良好□不良
大肠埃希氏杆菌
ATCC8739
□良好□不良
枯草芽胞杆菌
ATCC6633
□良好□不良
白色念珠菌
ATCC10231
□良好□不良
黑曲霉
ATCC16404
□良好□不良
将新鲜培养物上的菌株用0.9%氯化钠溶液制成1ml含菌数小于50-100cfu的菌悬液;黑曲霉向培养基中加入3-5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。
然后吸出孢子悬液至无菌试管中,用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于50-100cfu的孢子悬液。
2观察记录
培养温度
培养箱编号
培养时间
对照培养基厂家
配制批号
加入菌株培养基简称
Ⅰ:
待测培养基;Ⅱ:
对照培养基
加入菌悬液名称
培养基
名称
3个平皿菌落数
(CFU/皿)
菌落平均数(CFU/皿)
Ⅰ菌落数/Ⅱ菌落数(%)
金黄色葡萄球菌
Ⅰ
Ⅱ
大肠埃希氏杆菌
Ⅰ
Ⅱ
枯草芽胞杆菌
Ⅰ
Ⅱ
白色念珠菌
Ⅰ
Ⅱ
黑曲霉
Ⅰ
Ⅱ
3评定标准:
待测培养基上的微生物数量不得低于对照培养基上微生物数量的70%。
结论
□符合规定□不符合规定
复核人:
操作人:
附件2:
稀释液的无菌性检查
名称
pH7.0的氯化钠蛋白胨溶液
规格
pH7.0
批号
检验依据
CHP2010
实验条件
培养基名称
改良马丁培养基(培养基Ⅰ)
硫乙醇酸盐流体培养基(培养基Ⅱ)
配制批号
培养温度
20℃—25℃
30℃—35℃
取样量
实验观察结果
观察天数
培养基Ⅰ样品管
培养基Ⅱ样品管
培养基Ⅰ阴性对照管
培养基Ⅱ阴性对照管
阴性
阳性
阴性
阳性
阴性
阳性
阴性
阳性
第1天
□
□
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□
第2天
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第3天
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第4天
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第5天
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第6天
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第7天
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第8天
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第9天
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第10天
□
□
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第11天
□
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□
□
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□
第12天
□
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第13天
□
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□
第14天
□
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□
□
□
评定标准
硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基均为澄清,或虽显浑浊但经证明并非有菌生长,判供试品符合规定
结论
□符合规定□不符合规定
复核人:
检验人:
附件3:
方法验证
样品名称:
培养基:
试验菌名称:
菌种批号:
3批样品按顺序进行3次试验
样品
编号
试验组
菌液组
供试品对照组
稀释剂对照组
平皿上
菌落数CFU
时间
平均数CFU
回收率K1=
回收率K2=
样品
编号
试验组
菌液组
供试品对照组
稀释剂对照组
平皿上
菌落数CFU
时间
平均数CFU
回收率K1=
回收率K2=
样品
编号
试验组
菌液组
供试品对照组
稀释剂对照组
平皿上
菌落数CFU
时间
平均数CFU
回收率K1=
回收率K2=
判定
标准
在3次独立的平行试验中,k1、k2均不低于70%。
结论
复核人:
操作人:
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
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