细胞免疫荧光实验步骤_精品文档.doc
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细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤
简单实验步骤如下:
1.漂洗血清蛋白H7.2-7.437度PBS2小时.
2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥10分钟
3.PBS洗净:
3min*3
4.1%Triton:
25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS
5.PBS洗净:
2*5min
6.羊血清封闭:
37度,20分钟
7.一抗,4度过夜,一般要大于18小时或者37度 1-2小时
8.4度 PBS洗净,3min*5次
9.二抗 37度小于一小时
10.37度 PBS洗净,3*5min
凉干封片(封闭液PH8.5)
活细胞免疫荧光技术-流式细胞仪标本的制备
(一)制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、
胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)
↓
用10%FCS RPMI1640调整细胞浓度为
5×106~1×107/ml
↓
取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5~50μl)
的小玻璃管或塑料离心管,再加50μl1∶20(用DPBS
稀释)灭活正常兔血清
↓4℃30min
用洗涤液洗涤2次,每次加洗涤液2ml左右
1000rpm×5min
↓
弃上清,加入50μl工作浓度的羊抗鼠
(或兔抗鼠)荧光标记物,充分振摇
↓ 4℃30min
用洗涤液洗涤2次,每次加液2ml左右
1000rpm×5min
↓
加适量固定液(如为FCM制备标本,一般加入
1ml固定液,如制片后在荧光显微镜下观察,
视细胞浓度加入100~500μl固定液)
↓
FCM检测或制片后荧光显微镜下观察
(标本在试管中可保存5~7天)
(二)试剂和器材
1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体,灭活正常兔血清。
3. 10%FCSRPMI1640,DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
(三)注意事项
1. 整个操作在4℃下进行,洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
2. 洗涤要充分,以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合,出现假阴性。
3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体,降低和防止非特异性染色。
4. 细胞活性要好,否则易发生非特异性荧光染色。
附:
1.DPBS(×10,贮存液)
NaCl80g
KCl2g 蒸馏水加至1000ml
Na2HPO411.5g临用时用蒸馏水1∶10稀释
KH2PO42g
2. 洗涤液
DPBS 900ml
FCS50ml(终浓度 5%)
4%NaN3?
?
?
50ml(终浓度0.2%)
3. 固定液
DPBS 1000ml
葡萄糖 20g(终浓度2%)
甲 醛 10ml
NaN3 0.2g(终浓度0.02%)
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
(三)注意事项
1. 整个操作在4℃下进行,洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
2. 洗涤要充分,以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合,出现假阴性。
3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体,降低和防止非特异性染色。
4. 细胞活性要好,否则易发生非特异性荧光染色。
附:
1.DPBS(×10,贮存液)
NaCl80g
KCl2g 蒸馏水加至1000ml
Na2HPO411.5g临用时用蒸馏水1∶10稀释
KH2PO42g
2. 洗涤液
DPBS 900ml
FCS50ml(终浓度 5%)
4%NaN3?
?
?
50ml(终浓度0.2%)
3. 固定液
DPBS 1000ml
葡萄糖 20g(终浓度2%)
甲 醛 10ml
NaN3 0.2g(终浓度0.02%)
严重同意楼上的讲解。
我是做流式细胞分析的间接荧光,图简单加一抗后只洗涤一次,二抗后没有洗涤,就直接加另外一个抗体,结果做了好多次就是呈阴性反应!
排除了好久才多洗涤了两次,结果很是令人满意。
我想请问楼上:
NaN3哪里有卖?
谢谢!
我找过,发现它是一种化学工业产品,成桶成桶的卖,而且有剧毒啊!
是不是不是同一种东东?
我做的是zo-1的免疫荧光,步骤如下:
1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时,从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次,每次10分钟
3、4%的甲醛室温固定20-30分钟
4、1×PBS洗3次,每次10分钟
5、0.2%TritonX-100透化2-5分钟
6、1×PBS洗3次,每次10分钟
7、5%BSA室温封闭30分钟
8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里,4度过夜
9、1×PBS洗3次,每次10分钟
10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟,闭光!
!
!
11、1×PBS洗3次,每次10分钟
12、95%甘油封片
注:
4%甲醛,0.2%Triton,5%BSA均用1×PBS稀释
从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光
我做的大部分细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致:
1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里,PBS洗三遍。
注意:
有的时候作的细胞爬片可能比较小,因此夹取的时候要小心,注意反正面,放在皿里洗比较方便,避免了来回夹取,另外洗的时候加PBS不要太冲,不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加PBS,稍晃一下就倒掉,没有等5分钟或10分钟。
2.4%冷的多聚甲醛固定20分钟,PBS洗三遍。
3.0.2%TritonX-100通透10分钟,PBS洗三遍。
4.与二抗相同宿主的血清封闭30分钟,PBS洗三遍。
5.一抗4度湿盒内过夜,也可37度2小时,感觉前者效果好,PBS洗三遍。
6.二抗室温2小时(避光),或者37度1半小时,PBS洗三遍。
7.最好用DAPI染核,然后直接照荧光片。
8.蒸馏水洗掉PBS,甘油封片,指甲油封片子的四周,因为甘油不象树脂那样会干,所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
建议:
1.还是染完之后没有封片前直接照一些,因为有的时候可能封片会出现问题,再想照反而没有了,另外不要拖太长时间,荧光会崔灭的。
2.荧光的片子一定要避光保存,保存的好的话,过一段时间仍然能照出很好的片子。
3.二抗用之前一定离心,不然有的时候有那种沉淀,在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点,非常难看。
我要做的是occludin,可是效果不是很好,可以用甲醇固定吗,和甲醛比那个合适
各位同仁:
我现在急于做人乳腺癌细胞MCF-7的免疫荧光实验,目的是测凋亡时,基因bax、bcl-2的蛋白表达变化。
不知道怎么选一抗和二抗试剂盒。
请高手指教。
万分感谢!
能发一个邮件更好,再一次感谢!
我的E-mail:
hudaxj2005@
抗淬灭剂可拿来直接封片,20微升即可.之后片子可保留更长时间
bu不是原创
我是做悬浮细胞THP-1的,是人单核细胞系,主要问题是悬浮细胞在洗涤以及孵育次数多了会越洗越少,请问各位怎么洗法细胞不会变少。
(离心转速比较重要,还有有人说离心后上清不用移液器吸,直接倒比较好,我也试过,可还是越来越少)
顶一下
我也遇到了同样的问题,不知那位高人能够指点迷津?
另悬浮培养的细胞是不是也需要先固定在做后面的处理?
我听说悬浮细胞是最后一步才固定,我的实验步骤中太多道听途说啊,没办法,找不到完全相同的文献,很多protocol都是针对贴壁细胞。
。
。
不是悬浮细胞,是检测的蛋白在细胞膜上的是最后一步固定
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