双分子荧光互补技术(BiFC).pdf
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双分子荧光互补技术的原理及应用王愿MG1130060南京大学生命科学学院Inventor:
Dr.Chang-DengHuPhone:
(765)496-1971Fax:
(765)494-1414E-mail:
hu1purdue.eduPresentationOutlineProtein-ProteinInteractionsTheprincipleofBiFCTheApplicationsofBiFCPart1Protein-ProteinInteractions蛋白质相互作用(蛋白质相互作用(Protein-ProteinInteractions)Proteinproteininteractionsoccurwhentwoormoreproteinsbindtogether,oftentocarryouttheirbiologicalfunction.DNAreplicationSignaltransduction研究蛋白质相互作用的方法1.酵母双杂交技术(Yeasttow-hybrid)2.噬茵体展示技术(Phagedisplaytechnology)3.表面等离子共振技术(SurfacePlasmaresonancetechnique)4.荧光能量转移技术(Fluorescenceenergytransfer,FRET)5.抗体与蛋白质阵列技术(Antibodyandproteinarraytechnology)6.免疫共沉淀技术(Immunoprecipitation)7.pull-down技术(pull-downtechnology)8.双分子荧光互补(Bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC)Part2TheprincipleofBiFCGFP的发光机制GFP由238个氨基酸分子组成,分子量为26.9kDa。
来源于水母的野生型GFP在395nm和475nm分别有主要和次要的激发峰,它的发射峰在509nm,处于可见光谱的绿色区域;来源于海肾的GFP只在498nm有单个激发峰。
GFP是典型的桶形结构,包含折叠和螺旋,将荧光基团包含在其中。
严密的桶形结构保护着荧光基团,防止它被周围环境淬灭,内部面向桶形的侧链诱导Ser65Tyr66Gly67三肽环化,导致荧光基团形成。
双分子荧光互补(BiFC)荧光!
一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术。
在GFP的两个片层之间的环结构(loop)上有许多特异位点可以插入外源蛋白而不影响GFP的荧光活性,利用该荧光蛋白家族的这一特性,将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段,再分别与目标蛋白连接。
BimolecularFluorescenceComplementation(BiFC)Twofragments(YNandYC)oftheyellowfluorescentprotein(YFP)arefusedtotwoputativeinteractionpartners(AandB)AninteractionbetweentheproteinsfacilitatesassociationbetweenthefragmentstoproduceabimolecularfluorescentcomplexYNandYCdonotinteractontheirownBiFC的优点(Pros)1.Relevantbiologicalcontext2.Directvisualization3.Sensitivity4.Spatialresolution5.Nospecializedequipment6.Nostructuralinformationneeded7.MultipleapplicationsBiFC的缺点(Cons)1.Real-timedetection2.IrreversibleBiFCformation3.Independentfluorescentproteinfragmentassociations4.Alteringproteinstructureandsterichindrance5.Obligateanaerobes6.Useoffusionproteins7.Temperaturedependence8.ExactinteractionrelationshipunknownBiFC系统的扩展1、MulticolorBiFC(多色双分子荧光互补)2、TriFC(三分子荧光互补)3、BiFC-FRETMulticolorBiFC
(1)Manyproteinshavealternativeinteractionpartnersineachcell,manyaremutuallyexclusiveandresultincompetitionforsharedinteractionpartnersinthecell.
(2)Basedoncomplementationbetweenfragmentsoffluorescentproteinswithdifferentspectralcharacteristics(3)Allowssimultaneousvisualizationofmultipleproteincomplexesinthesamecell(4)EnablesanalysisofthecompetitionbetweenalternativeinteractionpartnersforcomplexformationTriFCBiFC-FRETDevelopmentofaBiFC-basedFRETassay.ShyuYJetal.PNAS2008;105:
151-1562008byNationalAcademyofSciencesThedosanddonts
(1)荧光片段和目标蛋白质之间最好加1个连接肽,以避免蛋白质空间位阻所导致的片段间不能相互靠近。
常用的连接肽氨基酸序列有RSIAT,RPACKIPNDLKQKVMNH和GGGGS等;
(2)温度对片段间互补影响很大,可以有两种解决方案。
一是在室温或低于室温(25)下培养细菌或细胞,二是在生理条件下培养细菌或细胞,使融合蛋白正常表达,然后将培养物低温处理1到2h或接着于室温培养1d;(3)建立阴性对照,以便更加确信BiFC信号反映的是蛋白质之间的相互作用。
阴性对照通常是将相互作用的蛋白进行突变,降低或缺失其相互作用能力,再采用相同策略的BiFC系统检测。
WorkflowForBiFCSelectionoffusionproteinexpressionsystemDeterminationoffusionsitesDesigninglinkersCreatingproperplasmidexpressionvectorsSelectionofappropriatecellculturesystemSelectionofappropriatecontrolsCelltransfectionVisualizationandanalysisCarefulselectionofthefluorescentproteinisimportant,asdifferentfluorescentproteinsrequiredifferentcellularenvironments.Forexample,GFPcanbeusedinE.colicells,whileYFPisusedinmammaliancells.Alinkerisashortaminoacidsequencethattethersthefluorescentreporterproteinfragmenttotheproteinofinterest,formingthefusionprotein.Whendesigningalinkersequence,onemustensurethatthelinkerissufficientlysolubleandlongtoprovidethefluorescentproteinfragmentswithflexibilityandfreedomofmovementsothatthefragmentanditspartnerfragmentwillcollidefrequentlyenoughtoreconstituteduringtheinteractionoftheirrespectivefusedproteins.Althoughitisnotdocumented,itispossiblethatthelengthorthesequenceofthelinkermayinfluencecomplementationofsomeproteins.N-terminalfragmentfusedattheN-terminalprotein1+C-terminalfragmentfusedattheN-terminalprotein2N-terminalfragmentfusedattheN-terminalprotein1+C-terminalfragmentfusedattheC-terminalprotein2N-terminalfragmentfusedattheC-terminalprotein1+C-terminalfragmentfusedattheN-terminalprotein2N-terminalfragmentfusedattheC-terminalprotein1+C-terminalfragmentfusedattheC-terminalprotein2C-terminalfragmentfusedattheN-terminalprotein1+N-terminalfragmentfusedattheN-terminalprotein2C-terminalfragmentfusedattheN-terminalprotein1+N-terminalfragmentfusedattheC-terminalprotein2C-terminalfragmentfusedattheC-terminalprotein1+N-terminalfragmentfusedattheN-terminalprotein2C-terminalfragmentfusedattheC-terminalprotein1+N-terminalfragmentfusedattheC-terminalprotein2Whendesigningplasmidvectorstoexpresstheproteinsofinterest,theconstructmustbeabletoexpressproteinsthatareabletoformfusionproteinswithfluorescentproteinfragmentswithou
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- 关 键 词:
- 分子 荧光 互补 技术 BiFC