湖州师范学院 基因工程复习提纲.docx
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湖州师范学院基因工程复习提纲
基因工程复习重点
一、载体PTXBⅠ
Ori原核生物复制起点
T7promotorT7启动子是最强的启动子,指导转录起始。
Lacopterator乳糖操纵基因,可被LacI编码的阻遏蛋白结合抑制转录。
SD原核生物翻译起始时核糖体的识别序列位于mRNA上
MCS多克隆位点可插入外源基因,不影响其复制。
内含多个酶切位点、如图。
Intein内含肽
CBDchitinbindingdomain(几丁质结合位点)可与Tag(亲和标记)结合
Stopcode终止密码子
Amp氨苄抗性基因可用作抗性筛选的重要标记
LacI乳糖调控基因编码阻遏蛋白
二、质粒提取原理:
答:
三种溶液:
溶液1:
50mmol/l葡萄糖---维持渗透压,防止DNA受机械损伤降解;
25mmol/lTri·Cl(pH8.0)---维持pH;
10mmol/lEDTA(pH8.0)------螯合Ca2+,DNase失活,保护DNA
溶液2:
0.2mol/NaOH----------核酸变性(pH>12或pH<3)(解链)
1%SDS-----------------蛋白变性,裂解细胞。
溶液3:
7.5mol/LNH4AC(pH7.6)-------沉淀蛋白,大分子核酸,调节pH,使小分子核酸复性(可溶)。
其它溶液:
(1)2MNH4AC------------------------------沉淀蛋白,溶解核酸;
(2)异丙醇-----------------------------沉淀质粒
(3)70%乙醇----------------沉淀质粒,除去异丙醇,盐分。
(4)RNase--------------------------------除去细菌RNA
过程及作用:
(1)1.5ml菌液,12000rpm*1min,弃上清(repeat)--收集细菌
(2)溶液1(200ul),剧烈混匀-------------提供缓冲液
(3)溶液2(400ul),温柔混匀,冰中5min;-------裂解细胞,蛋白核酸变性
(4)溶液3(300ul),温柔混匀,冰中10min;-------质粒复性
(5)13000rpm*5min,取上清;------------除去细菌蛋白,基因DNA
(6)540ul异丙醇,室温10min;------------沉淀质粒
(7)14000rpm*10min,弃上清;------------除去可溶性杂质
(8)100ul2MNH4AC
(9)13000rpm*5min,取上清;
(10)100ul异丙醇,室温10min;
(11)14000rpm*10min,弃上清;
(12)70%乙醇500ul,14000rpm*10min,弃上清;-----除去异丙醇,盐分
(13)烘干10-30min,-----------------除去乙醇
(14)50ulddH2O(含0.1mg/mlRNase),37°C*30min.----除去细菌RNA
(15)电泳鉴定
三、连接反应
答:
1、总体积为10ul;
2、16℃连接过夜;(为什么是16℃?
答:
连接反应包括两步一是将碱基50%连接(变性):
Tm=2(A+T)+4(G+C),一般在8℃左右。
二是将连接末端、DNA连接酶最适温度在37℃左右。
综上,要两个同时很好的进行,就将温度调到16℃左右。
)
3、基因mol/载体mol≈10;【平端≈15】
四、重组克隆的筛选,各方法的优缺点。
答:
1、抗性筛选;
原理:
利用载体上具有的抗性基因,进行筛选。
优点:
可确定有无载体转入。
缺点:
不能保证外源基因插入,空载体不能被检测出来。
2、蓝白斑筛选;
原理:
LacZ由4个亚基构成;细菌表达一部分(无活性),载体表达一部分(无活性),合在一起构成有活性的LacZ,可分解培养基平板中的底物X-gal,生成蓝色物质。
(需要IPTG诱导表达)--蓝斑;外源基因插入载体后,使载体部分LacZ失活,无法进行α互补--白斑。
优点:
未转入载体的细菌也会形成白斑,需同时用抗性筛选
缺点:
无法确定基因插入的方向;基因过小,且读框正确,可能无法使载体部分LacZ失活,将产生α互补,产生蓝斑。
3、酶切电泳筛选(*);
原理:
选用不同的酶切组合,通过电泳检测DNA片断的大小。
优点:
可鉴定外源基因的重组和插入方向。
缺点:
结果可靠但操作比较麻烦;无法检测基因内部的突变。
4、PCR筛选;
原理:
通过特异引物扩增,电泳检测,筛选重组质粒
优点:
可用2ul菌液做模板,快速,方便,可批量检测重组子。
缺点:
不能检测基因插入方向;不能检测基因内部突变。
5、测序验证;
原理:
选取阳性克隆,送公司测序;
优点:
最可靠的检测方法。
可确定基因的重组,插入的方向,基因内部的突变等。
缺点:
价格贵,适于1~2个克隆的验证。
6、表达筛选;
SDS-PAGE
原理:
小量诱导表达;全菌液裂解后进行SDS-PAGE电泳;重组的表达克隆将在特定的位置出现较浓的蛋白条带。
(需加不诱导的对照)
优点:
可检测外源基因的表达。
(一般基因的插入,方向,读框都正确)
缺点:
无法筛选不能有效表达的重组质粒。
亲和筛选:
原理:
50ml菌液诱导表达,超声破菌,用少量亲和beads吸附上清;
SDS-PAGE检测,在特点位点将出现一条蛋白带。
优点:
适用于有亲和Taq的融合蛋白的检测;比SDS-PAGE筛选更灵敏(富集),可靠;
缺点:
比较麻烦。
免疫筛选:
原理:
利用抗体检测目标蛋白。
做western-blot或ELISA。
优点:
western-blot能准确检测出是否表达。
缺点:
需要有抗体。
ELISA实验可能会受到交叉反应的干扰
7、生物活性筛选。
酶:
测定酶活;
亲和蛋白:
与亲和底物作用。
其它的生物活性。
五、有哪些克隆策略?
各有什么优缺点?
答:
1、平端克隆;机械打断,化学合成,EcoRV酶切,或其它酶切位点末端改造(klenow
酶补平,S1处理)产生平端;
特点:
克隆效率较低,ligase要加大量;载体需脱磷;方向可正可反。
2、粘端克隆
(1)TA克隆:
普通Taq酶扩增的PCR产物3‘末端会多加一个A;
公司提供的T-vector的5’末端有一个粘性的T;故不需要酶切。
用途①PCR产物快速克隆:
②基因测序(可正可反);
③利用T-vector上的MCS,为下一步克隆调整酶切位点
(2)单酶切不定向克隆:
载体需要脱磷(否则,自连效率极高,外源基因无法插入);
基因插入可正可反,需要筛选。
但当考虑各种因素时,有的时候不得不用。
(3)双酶切定向克隆①粘-粘连接:
最有效、最快捷
②粘-平连接:
适用于外源基因仅与载体有一个相同酶切位点,可将另一末端补平。
特点:
①基因和载体都用两种酶切割;
②连接效率高;
③外源基因插入方向固定,不用鉴定。
注意点:
①两个同尾酶切出的末端一样,相当于单酶切不定向克隆;
②载体MCS中的两个酶切位点要远一点,防止一端没切透;
(可选用中间插入其它基因片断的载体酶切回收制备)
六、PCR引物设计和程序设计
答:
引物设计:
原则:
1.长度:
15~37nt,一般20nt左右;(仅binding,不含接头)
2.G+C含量40%~60%
3.避免聚嘌呤或聚嘧啶或有回文对称结构;
4.引物自身不能互补(<3个)
5.引物之间不能互补(<5 个)
6.引物3端不能错配,不能修饰,尽量不用A,不能超过3个连续的G或C;
7.5’端可变化修饰,附加酶切位点;
8.两引物的Tm值应比较接近;
9.正链引物:
mRNA序列照抄;
负链引物:
先写出mRNA序列的互补序列,然后翻转重写。
10.解链温度Tm=4(G+C)+2(A+T)[=<20nt]
Tm=81.5+0.41*(GC%)-600/L[>20nt]
Tm一般55℃~80℃ [55℃~58℃最佳]
PCR反应中结合温度(anneaningtemperature)T=Tm-5℃
特殊用途引物设计技巧
1.5’附加酶切位点(定向克隆):
保护碱基(提高酶切效率)
2.引入点突变:
一条引物最多引入3个点突变,可延长引物长度.突变位点要靠近5’端
注意密码子的偏好性和简并性。
3.有不确定序列:
当被扩增序列未知时,可根据其同种、或种间已知序列来设计引物。
4.PCR产物直接测序
程序设计:
94℃<5min真核加帽,使其他杂蛋白变性。
30~32循环
94℃<=30s,解链温度
50℃30s,退火温度=Tm-5
72℃ 2min(1min/kb)
72℃10min反应到最后Taq酶活性有所下降,为使不完整的双链反应完全成完整双链。
七、琼脂糖凝胶电泳原理、操作要点、用途。
原理:
1.DNA电泳迁移:
电荷效应+分子筛效益
(1)DNA带负电,电场中,向正极移动;
(2)决定移动速度三因素:
DNA大小,电荷数,构型;
(3)线性DNA分子移动速度与其分子质量的对数成反比;(分子量越大,跑得越慢)
2、检测原理:
溴化乙锭(EB)可插入双链DNA分子中,在紫外光照射下,发射荧光。
操作要点:
1.不同浓度凝胶分辨DNA片段能力不一样
(1)低:
不利于小片段的分辨(扩散)
(2)高:
不利于大片段的分辨(迁移不动)
(3)一般选1.0%
2.凝胶要用缓冲液配(TBE或TAE)
3.EB强致癌,带手套操作;
4.agarose(琼脂糖)---电泳
agar(含琼脂糖和琼脂胶)---平板培养基
用途:
1.DNA分子量测定(距离->分子量)
2.基因,克隆的鉴定(通过1完成)
3、不同长度的基因片断的分离
4、DNA浓度的测定(荧光的强度与DNA含量成正比)。
也可用于蛋白的分离鉴定
八:
SDS-PAGE原理、技术要点、用途。
原理:
1.SDS(带负电)和还原剂破坏蛋白的高级结构,同时SDS与蛋白定量结合,消除蛋白之间
的电荷差异,使得蛋白的迁移率主要依赖分子量(分子小跑得快).
2.不连续电泳:
上层为浓缩胶,可将样品压缩到同一起跑线,下层为分离胶;可获得更高的分辨率.
3.考马斯亮蓝进行染色.
技术要点:
1.浓缩胶一般用5%,
分离胶:
次高分子(10万-20万)用7%,低分子(1.4万-10万)用12%
2、PAGE配制时带手套,(Acr-Bis液体有积累性神经毒,聚合后无毒)
3.SDS-PAGE测定的是单体蛋白分子量;(多亚基不行)
4、SDS-PAGE不适于:
(1)电荷异常蛋白:
组蛋白(+电多)、
(2)构象异常的蛋白
(3)带有较大辅基的蛋白--糖蛋白,脂蛋白。
用途:
1.蛋白分子量的测定2.蛋白浓度的测定3.蛋白的鉴定(通过分子量的测定来实现)
九、双脱氧法测序(末端终止法)用于单链测序原理
原理:
合成DNA时在反应物中加入一定量的2’,3’ddTTP时,因ddT的3`碳原子不含-OH,故
DNA不能延伸。
不是加一种dNTP或减一种dNTP,而是加入某一种双脱氧核苷,来终止聚合反应。
测定的序列靠近引物(起点)20~30bp不准,500bp后的序列也不准。
(?
)
十、基因工程工具酶。
1、限制性内切酶:
基因工程中主要用到Ⅱ型核酸内切酶
其特征:
Ⅰ、每一种酶都有各自特异的识别序列。
(1)序列不同
(2)长度不同:
4-7bp
(3)但与DNA来源无关
Ⅱ、识别序列一般具有回文结构。
Ⅲ、切割后,产物的特点
(1)5’-pi,3’—OH
(2)平端。
粘端--都是5’突出或都是3’突出
(3)粘端可重新通过氢键配对
Ⅳ、特殊性质①同位酶:
识别相同序列,但切割位点不一样的酶(如SmaI和XmaI)
②同尾酶:
识别位点不同,但切割出相同的末端序列(BamHI和BclI);
③同裂酶:
识别位点和切割位点都相同的酶(HpaI和HincⅡ);
④甲基化的调节:
MspI(所有)和HpaⅡ(非甲基化)
⑤Star活性(星号活性):
在非标准反应条件下,也能切割一些与其特异识别序列类似的序列。
在酶的名称右上角加一个星号(*)表示,如EcoRⅠ*。
6位置效应:
酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同(侧翼序列太短无法切)
2、DNA连接酶:
能催化DNA中相邻的3`-OH和5`-P之间形成磷酸二脂键。
(1)能封闭DNA双链或RNA/DNA杂种双链中的单链缺口,而不能封闭双链RNA中的单链缺口
(2)能封闭粘性末端退火后出现的缺口;
用途:
(1)通过粘端连接DNA分子;
(2)连接平端双链DNA分子或平端DNA与人工接头的连接。
3、DNA聚合酶:
(1)Taq酶:
耐热DNA聚合酶:
94℃能较长时间保持活性,最适温度72℃;
方向:
5’→3’;底物:
模板+引物+dNTP(还需Mg2+);反应速度:
1kb/min
不同种类的Taq酶功能不同。
用途:
PCR、sequence、TAclone
(2)Klenow酶:
DNA聚合酶Ⅰ的C-端大片段(被枯草杆菌蛋白酶切割);MW=76kD;
5`→3`聚合酶活性(合成);3`→5`外切酶活性(矫正)
用途:
DNA探针的标记;平端化:
补平3’凹端或切除3’凸端。
(3)反转录酶:
有两种:
AMV(来源于鸟类肿瘤病毒)--------42℃反应
M.MLV(来源于鼠白血病毒)-------37℃反应
主要特点:
①RNA→DNA
②DNA→DNA
③外切RNA
④不具有纠错功能
用途:
mRNA转录成cDNA;以ssDNA或RNA为模板合成杂交探针
(4)末端转移酶:
取自小牛胸腺
催化脱氧核苷酸与DNA的3`-OH结合
引物或底物是带有3`-OH基的ssDNA或带有突出的双链DNA。
不要求模板。
两种反应:
Mn2+或Mg2+
ssDNAOH+ndNTPDNA-(pdN)n+nppi
Co2+
dsDNAOH+ndNTPDNA-(pdN)n+nppi
用途:
加一个同源多聚物,便于未知序列的操作。
4、修饰酶:
Ⅰ、T4多核苷酸激酶
作用原理:
催化ATP的γ-Pi转移到DNA或RNA的5’-OH,使之磷酸化。
用途:
放射性标记DNA链的5‘末端,探针标记
注意:
(1)铵离子是该酶的强烈抑制剂,处理前,DNA不能溶解于含铵盐的缓冲液中。
(2)低浓度的磷酸也可抑制该酶活性。
(3)该酶很难纯化,酶制品经常不纯。
Ⅱ、碱性磷酸化酶
作用原理:
切除DNA、RNA、rNTP和dNTP上的5‘磷酸基团,变成5’OH。
来源:
(1)细菌碱性磷酸酶(BAP):
BAP活性更高,对热和去污剂抗性更强,因此脱磷酸化后
很难完全抑制BAP活性。
(2)牛小肠碱性磷酸酶(CIP):
除去CIP可用蛋白酶K降解
用途:
(1)从DNA片段上除去5‘磷酸以防自身连接。
(2)在放射性标记DNA5‘末端前,除去磷酸。
Ⅲ、核酸酶
(1)核酸酶Bal31
(2)核酸外切酶Ⅲ
(3)单链核酸酶S1:
是单链(ssDNA,ssRNA)特异性核酸酶。
产物5‘-pi;
pH4.5,Zn2+
用途:
(1)分析RNA·DNA杂合结构(内含子);
(2)除去DNA的单链末端,生成平端;
(3)切断双链DNA的发夹结构。
Ⅳ、DNA甲基化化酶:
保护不受切割;帮助切割(Dpn1)
注意区两种分平端化酶:
S1酶和Klenow酶。
十一、BH5α菌株(克隆菌株、受体菌)和BL21(DE3)菌株(表达菌株)?
答:
BH5α菌株一种用于铺制与培养质粒平板的重组缺陷的抑制型菌株,其基因产物可与
pUC载体编码的β--半乳糖苷酶氨基α端实现互补。
BL21(DE3)菌株:
该基因用于高效表达克隆于含有T7噬菌体启动子的表达载体的基因,
T7噬菌体RNA聚合酶位于噬菌体DE3区,该区整合于BL21的染色体上。
T7启动子只与T7RNA聚合酶作用进行转录。
因此,没有T7RNA聚合酶BH5α菌株不能作为表达菌株。
十二、质粒的作为载体基本要求,质粒的不亲和性,质粒功能分类。
答:
要求:
1.复制原点--能自主复制,宿主专一性;
2.选择标记--便于筛选,;
3.多克隆位点--插入外源基因,不影响本身的复制;
质粒功能分类:
1、克隆载体(PUC)
2、表达载体(pET,pGEX,pTXB1等)
3、特殊用途载体:
(1)体外转录ssRNA载体
(2)表达ssDNA载体
质粒的不亲和性:
(1)质粒具有不相容性,即在没有选择压力的条件下,两种不同的质粒
不能稳定地共存于同一细胞.
(2)宿主细胞内.相互不相容的质粒属于同一个不相容群;而属于不同的不相容群的质粒
可稳定地共存于同一宿主细胞中。
原因:
竞争相同的转录,复制因子.
十三、融合蛋白的功能,为什么要进行融合表达?
答:
功能:
1、提高外源基因的表达量
2、帮助外源基因正确折叠(可溶)
3、提供亲和标记,方便纯化;
4、提供亲和标记的还可作为检测靶点,方便检测。
N端融合:
比较有利于基因产物的表达和正确折叠,防止出现表达量太少或形成包涵体。
C端融合:
(1)表达情况一般不如N端融合
(2)要克隆基因的下游引物不能含有stopcode.
N,C端都融合,方便纯化和进行功能实验。
十四、常用融合蛋白表达的载体及常用系列的标记。
答:
PGEX系列:
N端融合GST蛋白,用GST柱亲和纯化;谷胱甘肽洗脱,用Xa因子酶切
除去亲和Taq。
PTXB(pTYB)系列:
N端(或C端)融合CBD蛋白,用chitin柱亲和纯化;
DTT诱导柱上切割纯化。
pET系列:
融合6hisTaq,用镍柱亲和纯化,用Xa因子酶切除去亲和Taq。
咪唑。
十五、蛋白表达过程中如何防止产生包涵体?
答:
(1)使用融合蛋白,帮助正确折叠;
(2)使用辅助质粒,产生分子伴侣,帮助正确折叠
(3)降低温度,缓慢表达,帮助正确折叠;
(4)减少诱导剂的量,缓慢表达,帮助正确折叠;
(5)使用不同的培养基和金属添加剂。
(6)使用低拷贝的质粒
十六、名词了解:
GenBank:
NCBI美国国立生物技术信息中心中的一个数据库
NCBI:
美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)所属的
一个研究所的计算生物学研究室,包括GenBank、UniGene、dbSNP、COG、LoccusLink等
BLAST:
“局部相似性基本查询工具”(BasicLocalAlignmentSearchTool)的缩写,Blast是NCBI
研制的一个生物基因数据库系统的查询工具,功能强大,检索速度快,流行于世界上几乎所有的
生物信息中心。
功能名称
功能
Blastn
用核酸序列搜索核酸序列数据库
Blastp
用蛋白质序列搜索蛋白质序列数据库
Blastx
用核酸序列(翻译成蛋白质)搜索蛋白质序列数据库
十六、设计题:
1、克隆引物的设计期中那个上交的作业看看、原理知道就好了、
2、基因表达设计:
注意原核真核系统表达的优缺点、蛋白表达的常见问题、以下流程图。
实验流程:
- 配套讲稿:
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- 特殊限制:
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