生化大实验报告.docx
- 文档编号:4694825
- 上传时间:2022-12-07
- 格式:DOCX
- 页数:26
- 大小:316.07KB
生化大实验报告.docx
《生化大实验报告.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《生化大实验报告.docx(26页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
生化大实验报告
生化实验报告
[键入文档副标题]
实验一多酚氧化酶(PPO)的分离与提取
一、实验目的
1、本实验以马铃薯为主要的实验材料,通过细胞组织破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。
2、通过本项实验,学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法,掌握相关仪器设备的操作使用,以及蛋白质的提取、分离的系统技术。
二、实验原理
多酚氧化酶是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶,位于质体、微体内,参与植物抗体的调节,属于末端氧化酶的一种。
在植物体受到机械损伤和病毒感染后,PPO催化酚与氧氧化成醌,使组织形成褐变,对PPO弄得的测定便是通过PPO氧化酚产生醌的变色反应测定其酶活性。
在蛋白质水溶液中,加入少量的中性盐,如硫酸铵、氯化钠等,会增加蛋白质分子表面的电荷,增强蛋白质分子与水分子的作用,从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。
这种现象称为盐溶;而在蛋白质水溶液中继续加入无机盐类可以其溶解度降低而析出的过程,该现象称为盐析。
蛋白本身随盐浓度的溶解度变化曲线具有特征性,可以依据此分离蛋白,硫酸铵分级便依据此原理,首先在蛋白质溶解度最高时,离心取上清,去除此时未溶解或已经沉淀的杂蛋白,之后再其溶解度最低且未变性的时候离心取沉淀复溶,去除尚未析出的杂蛋白,从而达到纯化目的蛋白的目的。
多酚氧化酶在40%硫酸铵溶液中溶解度最高,而在75%硫酸铵溶液中沉淀量最高,由此可分离提取多酚氧化酶。
但使用硫酸铵分级,分离后的产物中会有铵根离子残留,如果采用凯氏定氮法测定蛋白质浓度时,残留的铵根离子会造成测定时高于实际值,同时该样品之后会用于离子交换层析纯化,所以需要去除其中的离子,故需要透析去除其中铵根离子。
多酚氧化酶提取在PH6.0的中性偏酸条件下进行,在此PH值下,磷酸缓冲液的缓冲能力最强,故选择使用其作为缓冲液,其中加入的EDTA为螯合剂,聚乙烯比咯烷酮是用于吸附醌,本身为固体颗粒,不需要溶解。
三、仪器与试剂:
(1)马铃薯200g
(2)试剂:
溶液A:
0.03M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02M巯基乙醇,0.001MEDTA,5%甘油,1%的聚乙烯比咯烷酮)
固体硫酸铵
溶液B:
0.03M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02M巯基乙醇,0.001MEDTA,0.005M氯化镁)
实验器械与仪器设备:
烧杯,玻璃棒,量筒,天平,高速冷冻离心机,离心杯,透析袋,植物组织匀浆器,过滤纱布。
四、实验步骤:
1、将马铃薯切削块,按照1g:
1ml的比例加入0.03M磷酸缓冲液,放入植物组织匀浆器,将马铃薯充分粉碎使PPO从细胞中释放出来。
2、将处理过的溶液用四层纱布过滤,去除溶液中的大颗粒固性物质,装离心瓶配平后,12000转离心10min。
3、离心后取上清液162ml,查表知欲得到0℃硫酸铵40%饱和度需要加入无水硫酸铵29.92g,称量加入溶液中,用玻璃棒轻轻搅拌,避免因为机械剪切导致蛋白变性,0℃静置一小时。
4、静置一小时后,装离心瓶,调平后离心机12000转离心10min,弃沉淀得上清液192ml,查表知欲得0℃硫酸铵75%饱和度需要再加无水硫酸铵35.90g,称量后加入,用玻璃棒轻轻搅拌,0℃静置2小时沉淀。
5、将透析前样品抽500ul作为粗酶样品。
6、两小时后,装离心瓶,调平后12000转离心10min,弃上清液,沉淀加10ml溶液B复溶,装透析袋绑好透析过夜。
实验二离子交换柱层析纯化多酚氧化酶(PPO)及活性测定
一、实验目的
1、本实验拟通过离子交换层析分离纯化PPO的操作,掌握该层析的基本原理、运用及操作技术。
2、通过纯化PPO检验之前提取PPO的实验是否成功。
3、通过本实验学习并掌握传统的蛋白质活性及浓度测定的方法、原理及相关仪器设备的操作。
二、实验原理
离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。
离子交换层析的固定相是离子交换剂,它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。
离子交换剂可以分为3部分;高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。
电荷基团与高分子聚合物共价结合,形成一个带电的可进行离子交换的基团。
平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子,它能与溶液中其他的离子基团发生可逆的交换反应。
平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用,称为阳离子交换剂;平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用,称为阴离子交换剂。
离子交换反应可以表示为;
阳离子交换反应:
(R—X-)Y++A+(R—X-)A++Y+
阴离子交换反应:
(R—X+)Y-+A-(R—X+)A-+Y-
R代表离子交换剂的高分子聚合物基质,X-和X+分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团,Y+和Y-分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子,A+和A-分别代表溶液中的离子基团。
当A离子与离子交换剂的结合力强于Y离子,或者提高A离子的浓度,或者通过改变其他一些条件,可以使A离子将Y离子从离子交换剂上置换出来。
也就是说,在一定条件下,溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来,并通过电荷基团结合到固定相上,而平衡离子则进入流动相,这就是离子交换层析的基本置换反应。
通过在不同条件下的多次置换反应,就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。
PPO是通过DE52弱碱性阴离子交换剂分离纯化的,过程大体为:
阴离子交换剂的电荷基团带正电,装柱平衡后,与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。
待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。
加样后,负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应,而结合到离子交换剂上。
而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合,随流动相流出而被去除。
通过选择合适的洗脱方式和洗脱液,如增加离子强度的梯度洗脱。
随着洗脱液离子强度的增加,洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上的各种负电基团进行交换,而将各种负电基团置换出来,随洗脱液流出。
与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来,而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度才能被置换出来,这样各种负电基团就会按其与离子交换剂结合力从小到大到顺序逐步被洗脱下来,从而达到分离目的。
分离过程中的蛋白质浓度是通过考马斯亮蓝技术测定的,考马斯亮蓝法(Bradford法)是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。
考马斯亮蓝G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的位置(λmax),由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色,该染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595nm,与蛋白质浓度成正比。
PPO催化各种酚与氧气氧化为醌,以邻苯二酚为底物,在0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液pH=8.5的反应体系中,PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌,在分光光度计410nm处使反应体系的OD值发生变化,通过OD值上升的度数变化确定PPO的酶活力大小。
三、仪器与试剂:
试剂:
0.02MTris-HCl缓冲液PH7.4(内含0.001MEDTA),考马斯亮蓝试剂,
柠檬酸缓冲液,邻苯二酚,氯化钠;聚乙二醇;DEAE-纤维素DE52;
设备:
试管与试管架、烧杯、玻璃棒、滴管等、层析柱,PH试纸,恒流泵,梯度混合仪,核酸蛋白检测仪,GL-20C高速冷冻离心机,酶标板、分光光度计、分析天平、容量瓶、移液管和试管等。
四、实验步骤
(1)将经过透析的PPO蛋白粗酶溶液放入50ml离心管中12000转4℃离心10min,取上清液备用,以此确保无固性物质,防止其破坏胶体。
(2)将层析柱洗净,并确保在下出水口处没有气泡存留且可以正常出水,将已经配置好的柱材轻轻倒入层析柱中,匀速添加防止出现多个柱面,直到柱面到达8cm左右时停止。
(3)装好的层析柱上端连接恒流泵,下端用一烧杯承液,恒流泵首先连接缓冲液,利用缓冲液将层析柱中的溶液置换出来,约5分钟后开始用PH试纸检测下出水口流出液体PH值,直到流出液PH与缓冲液PH相同时停止。
(4)将粗酶液上柱,用微量移液器缓慢加入,加样过程中连续,保证液面在柱面上1cm处,防止液体低于柱材破碎,共上样10ml。
(5)用含氯化钠(0.2-0.6M)的0.02MTris-HCl缓冲液PH7.4(内含0.001MEDTA)进行梯度洗脱。
(6)每5ml一个试管收集并进行编号,首先收集4管,编号1-4,为杂蛋白,之后收集16管样品,编号5-20,为可能含有PPO的样品。
(7)从1-20号样品管中抽取20ul样品分别加至酶标板中,加20ul考马斯亮蓝溶液,室温下静置2min,测其OD595值并进行记录,该数据说明其中粗蛋白含量。
(8)从1-20号样品管中抽取20ul样品分别加至酶标板中,加20ul柠檬酸缓冲溶液并加20ul邻苯二酚于30℃环境中静置2min,测其OD410值并进行记录,该数据说明其中多酚氧化酶的含量。
(9)对上一实验中的粗酶提取物样品重复第(7)(8)两步,测其粗蛋白含量及比活力。
(10)0-100μg/ml标准曲线的绘制:
准确吸取0.5ml含20、40、60、80、100μg蛋白标准液,分别放入10ml的试管中,加5.0ml考马斯亮蓝G-250蛋白试剂,将溶液混匀,2min后在分光光度计594nm处测定其吸光值,空白以去离子水或蒸馏水代替。
吸光值为纵坐标,蛋白含量为横坐标,绘制标准曲线。
(11)样品中蛋白浓度的测定:
要求待测样品中的蛋白浓度范围为1-1000μg/ml之间,若浓度过高,需要对其进行适当的稀释,再用制作标准曲线的方法对样品进行测定,测定的0.D595值结果由标准曲线求出样品的蛋白浓度。
五、结果及分析
考马斯亮蓝OD595
试管编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
OD值
0.206
0.605
0.037
0
0
0
0
0.024
0.144
0.31
试管编号
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
OD值
0.172
0.211
0.386
0.084
0.168
0.132
0.231
0.186
0.118
0.164
柠檬酸缓冲液OD410
试管编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
OD值
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0.026
试管编号
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
OD值
0.042
0.05
0.062
0.071
0.094
0.112
0.201
0.174
0.064
0.03
粗酶提取物比活力:
OD410=0.192
纯化倍数=纯化后比活力/粗酶比活力:
0.201/0.192=1.047
结果分析:
图1-1多酚氧化酶(PPO)离子交换柱纯化结果
多酚氧化酶(PPO)通过离子交换柱纯化的结果如图1-1,横坐标为洗脱体积,对应1-20号试管,共总洗脱体积为100ml。
纵坐标为OD值,其中蓝色OD595Z折线表示考马斯亮蓝测定时粗蛋白含量的变化,数值高低表示其中粗蛋白含量多少;红色OD410折线为柠檬酸缓冲液测定时多酚氧化酶含量的变化,数值高低表示其中酶比活力的高低。
所有OD值除0值外,均在0.1-0.8之间,无异常值,无需稀释后在测定。
考马斯亮蓝测定结果中,2号试管即5-10ml的OD595值最高为0.605,为杂蛋白中蛋白含量最高的。
而在含有目的蛋白的5-20号试管中,13号试管OD595值最高为0.386,;4-7管OD595最低为0,该OD值说明的是其中的粗蛋白含量,其中共有5个蛋白峰,分别为2号,10号,13号,15号,17号管,其中2号管为杂蛋白峰。
杂蛋白洗脱为1-4号试管,通过折线图可观察到,在4号管处,OD595值为0,并在之后5-7管仍然为0,可认为大部分杂蛋白榆次已经几乎洗脱,柠檬酸缓冲液结果也证明了这一观点。
柠檬酸缓冲液中OD410测定过程中,从10号试管开始出现不为0,此时为多酚氧化酶开始洗脱的体积,为45-50ml,其浓度一直处于增加状态,直至17号试管处,此处有峰值为0.201,之后酶活性下降明显,与20号试管处其值仅为0.3,可认为PPO以全部洗脱,故PPO洗脱体积共50ml。
纯化倍数为1.047,相较于纯化之前,纯化效果不明显,这与预期的纯化结果相差较多。
出现纯化效果不好的原因较多,主要原因可能存在于三个方面:
①在多酚氧化酶提取过程中存在问题。
可能搅拌时措施不当导致了蛋白质变性,并且有时会碰到烧杯壁,搅拌溶解过程出现的很多气泡都说明很可能是这一步导致了最后纯化倍数偏低。
因为全班检测结果均不是很良好,甚至部分组纯化倍数低于1,由此怀疑可能是透析袋存在问题,因孔径太大导致目的蛋白流出,导致纯化倍数降低,这可能是因为原本透析袋口径就过大或在处理过程中导致用力挤压或拉伸导致透析袋孔径变大。
②可能是在离子交换柱分离过程中操作不当,灌柱的过程中,柱面高度或许不够高,上柱过程中柱面上方的液体体积过多,导致柱体过密,分离效果不好。
③测定OD值时出现问题,在使用时,仪器读数变化极大,每次测定时很不稳定,甚至有20孔全部没有读数的情况出现,可能是使用人数过多,时间过长,导致仪器温度升高,测定值不准导致的。
以上三个方面均有可能导致纯化倍数过低,但是无法确认是某一方面单独导致,还是综合因素引起纯化倍数过低,只能在下次实验进行过程中多加注意,避免类似问题再次发生。
实验三分子筛层析纯化多酚氧化酶(PPO)
一、实验目的
通过分子筛纯化多酚氧化酶(PPO),学习分子筛纯化原理,了解分子筛层析纯化步骤。
二、实验原理
分子筛层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。
分子筛层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒,凝胶颗粒内部具有立体网状结构形成许多孔穴。
当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后,各个组分就向固定相的孔穴内扩散,组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。
比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部,完全被排阻在孔外,只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动,它们经历的流程短,流动速度快,所以首先流出;而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部,经历的流程长,流动速度慢,所以最后流出;而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透,渗透的程度取决于它们分子的大小,所以它们流出的时间介于二者之间,分子越大的组分越先流出,分子越小的组分越后流出。
这样样品经过分子筛层析后,各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出,从而达到了分离的目的。
三、仪器与试剂:
试剂:
0.02MTris-HCl缓冲液PH7.4(内含0.001MEDTA)配置是X10倍浓缩液1000ml;葡萄糖凝胶SePHadexG-200、兰葡萄糖、考马斯亮蓝试剂、柠檬酸缓冲液,邻苯二酚。
设备:
试管与试管架、烧杯、玻璃棒、微量移液器、层析柱、PH试纸、恒流泵、核酸蛋白检测仪,GL-20C高速冷冻离心机、DL-7A大容量低俗冷冻离心机、酶标板。
四、实验步骤
(1)将二中的OD410值最高的17号试管与5ml一中离心后的粗酶提取物混合后离心5分钟,取上清液加入兰葡萄糖,搅拌使其完全溶解后备用。
(2)将层析柱洗净,并确保在下出水口处没有气泡存留且可以正常出水,将已经配置好的柱材轻轻倒入层析柱中,匀速添加防止出现多个柱面,直到柱面到距层析柱柱口1.5-2cm左右时停止。
(3)装好的层析柱上端连接恒流泵,下端用一烧杯承液,恒流泵首先连接缓冲液,利用缓冲液将层析柱中的溶液置换出来,约5分钟后开始用PH试纸检测下出水口流出液体PH值,直到流出液PH与缓冲液PH相同时停止。
(4)用1000ul微量移液器将
(1)中加入兰葡萄糖后的样品加入层析柱中,加样过程连续,保证不因为人为因素导致样品分层。
(5)每5ml一个试管收集并进行编号,共收集20管,并记录蓝色于何时开始出现,何时结束
(6)从1-20号样品管中抽取20ul样品分别加至酶标板中,加20ul考马斯亮蓝溶液,室温下静置2min,测其OD595值并进行记录,该数据说明其中粗蛋白含量。
(7)从1-20号样品管中抽取20ul样品分别加至酶标板中,加20ul柠檬酸缓冲溶液并加20ul邻苯二酚于30℃环境中静置2min,测其OD410值并进行记录,该数据说明其中多酚氧化酶的含量。
五、结果及分析
蓝色于第5管中出现,于第14管中消失,即于20ml开始出现,于70ml时消失。
考马斯亮蓝OD595值:
试管编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
OD值
0
0
0
0
0.156
0.440
0.400
0.316
0.124
0.253
试管编号
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
OD值
0.101
0.07-
0.023
0.064
0
0.077
0
0
0
0
柠檬酸缓冲液OD410值:
试管编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
OD值
0
0
0
0
0
0
0.031
0.072
0.101
0.227
试管编号
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
OD值
0.062
0.042
0.017
0.006
0
0
0
0
0
0
纯化倍数:
纯化后比活力/纯化后比活力=0.227/0.192=1.18
结果分析:
图1-2多酚氧化酶(PPO)分子筛层析纯化结果
(1)多酚氧化酶(PPO)通过分子筛层析纯化的结果如图1-2,横坐标为洗脱体积,对应1-20号试管,共总洗脱体积为100ml。
纵坐标为OD值,其中蓝色OD595Z折线表示考马斯亮蓝测定时粗蛋白含量的变化,数值高低表示其中粗蛋白含量多少;红色OD410折线为柠檬酸缓冲液测定时多酚氧化酶含量的变化,数值高低表示其中酶比活力的高低。
无高于,0.8的数值,无需稀释后在测定,低于0.1的数值,认为其含量过低,近似于0处理。
(2)考马斯亮蓝测定结果中,6号试管即25-30ml的OD595值最高为0.356,其中粗蛋白含量最高蛋白含量最高的。
1-4管与15-20管OD595最低为0,这与蓝色出现与消失的试管号相符,该折线图有其中共有2个蛋白峰,分别为6号,1-号管,蛋白峰和峰值明显低于离子交换层析结果,纯化结果较好。
(3)柠檬酸缓冲液中OD410测定过程中,从6号试管开始出现不为0,此时为多酚氧化酶开始洗脱的体积,为45-50ml,其浓度一直处于增加状态,直至10号试管处,此处有峰值为0.227,为酶峰,之后一直下降,与14号管处完全消失。
此比活力为0,227高于之前的0.201,纯化效果较上一步好。
(4)纯化倍数为1.18,相较于纯化之前,纯化效果不明显,但较离子交换层析结果有一定这与预期的纯化结果相差较多。
该步奏出现纯化效果不好的原因主要问题应存在于两个方面,其一是离子交换层析柱中的多酚氧化酶活性本身就不是很高,分子筛纯化后,提升幅度有限;其二,仪器问题可能仍然会干扰本不实验中的蛋白质以上两个方面综合起来,导致纯化倍数过低,在下次实验进行过程中会多加注意,避免类似问题再次发生。
实验四胰酶分离提取
一、实验目的
1.本实验拟通过从猪胰脏中之美胰酶结晶实验,掌握酶的制备、一般分离、提取、纯化和结晶的操作技术。
2.为亲和层析、免疫学实验准备实验样品。
二、实验原理
胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中,在Ca2+的存在下,被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活,从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开,失去一段六肽,分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原的相对分子质量约为24000,其等电点约为PH值为8.9,胰蛋白酶的相对分子质量与其酶原接近(23300),其等电点约为PH值为10.8,最适PH值为7.6~8.0,在PH值为3时最稳定,低于此PH值时,胰蛋白酶易变性,在PH值>5时易自溶。
Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。
重金属离子、有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性,胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。
最近发现在一些植物的块茎(如土豆、白薯、芋头等)中也存在有胰蛋白酶抑制剂。
从动物胰脏中提取胰蛋白酶时,一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来,然后再根据等电点的沉淀原理,调节PH值以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质,再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等(包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质,再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等(包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原)沉淀析出。
经溶解后,以极少量活性胰蛋白酶激活,使其酶原转变为有活性的胰蛋白酶(糜蛋白酶和弹性蛋白酶同时也被激活),被激活的酶溶液再以盐析分级的方法除去糜蛋白酶及弹性蛋白。
三、仪器与试剂:
(1)冻猪胰脏
(2)PH2.5乙酸酸化水、2.5mol/LH2SO4、5mol/LNaOH、硫酸铵、氯化钙、2mol/LNaOH、0.8mol/L,PH值为9.0硼酸缓冲液:
取20ml0.8mol/L硼酸溶液,加80ml0.2mol/L四硼酸钠溶液,混合后,用PH计检查校正、0.4mol/LPH值为9.0硼酸缓冲液(稀释1倍即可)、0.2mol/LPH值为8.0硼酸缓冲液:
取70ml0.2mol/L硼酸溶液,加30ml0.5mol/L四硼酸钠溶液,混合后,用PH值计校正)、2mol/LHCl、0.01mol/LHCl、BAEE-0.15mol/L、PH值为8.0Tris-HCl缓冲液(每毫升Tris缓冲液含0.11mgBAEE和2.22mg的氯化钙)。
(3)恒温水浴锅、离心机、组织粉碎机、PH试纸、烧杯、离心瓶、量筒、微量移液器、透析袋。
四、实验步骤:
(1)将冷冻的猪胰脏在冰水冲洗下剥离其上的脂肪与结缔组织,减少杂蛋白含量。
(2)将洗净的胰脏放入组织粉碎机后加2倍体积的冷却的PH2.5-3.0的乙酸酸化水后进行粉碎。
(3)检测提取液中PH,若高于3.0则用10%乙酸调节之后再4℃过夜。
(4)将过夜后的样品用四次纱布过滤
(5)将滤液在12000r/min下离心十分钟,取上清液
(6)在上清液中加入硫酸铵至75%饱和度,静置两小时
(7)将溶液装离心瓶12000r/min离心十分钟,弃上清液
(8)将沉淀用10ml去离子水复溶后装透析袋透析过夜备用
实验五卵清蛋白分离提取
一、实验目的
通过对鸡卵粘蛋白的分离提取,掌握蛋白质分离提取的主要技术和操作,以及相关仪器设备的操作。
二、实验原理
鸡卵黏蛋白存在于鸡蛋清中,对以担保有强烈的抑制作用,高纯度的鸡卵黏蛋白抑制胰蛋白酶的分子比为1:
1,故此可以用鸡卵黏蛋白作为亲和配基制备纯化胰酶的亲和柱材。
鸡卵黏蛋白是糖蛋白,分子量为28000,但糖成分上有差别。
有四种不同组分,等电点的范围为PH3.9-4.5,280nm的消光系数为:
A=4.13(1%,1cm)。
同时鸡卵黏蛋白在中性或酸性溶液中,在25-30℃较高温度下或高浓度的脲中都很稳定,而且本身耐机械剪切,可以根据此设计卵清蛋白提取实
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 生化 实验 报告