辣椒各组分含量测定.docx

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辣椒各组分含量测定

辣椒各组分含量测定

一、辣椒中可溶性糖的测定----蒽铜比色法

1.原理：

糖与硫酸反应脱水生成羟甲基呋喃甲醛，生产物再与蒽铜缩合成兰色化合物，其颜色深浅与溶液中糖的浓度成正比，可比色定量。

2.试剂

（1）硫酸锌溶液：

溶解500g化学纯硫酸锌于500ml水中

（2）亚铁氰化钾溶液：

溶解10.6g化学纯亚铁氰化钾于100ml水中

（3）0.2％蒽铜试剂：

溶解蒽铜0.2g于100ml95％硫酸中，置棕色瓶中冷暗处保存

（4）0.1％葡萄糖液：

准确称干燥葡萄糖0.1000g定容100ml

3.操作方法

（1）标准曲线绘制

（2）100ml容量瓶编号

沸水浴加热6分钟，取出冷却→用1cm比色杯→610nm测定吸光度→作出以吸光度为横坐标，糖液浓度为纵坐标的准曲线

（3）样品测定

称10g样品→于100ml热水加入500ml容量瓶中－加硫酸锌5ml→沸水浴5分钟→取出再摇动下加亚铁氰化钾5ml，→冷却→定容500ml→过滤→吸滤液25ml→于250ml容量瓶→定容250ml→取稀释液1ml，于比色管中→加10ml蒽铜试剂→摇匀→水浴加热6分钟→冷却→比色

试验注意

1，样液必须清澈透明，加热后不应有蛋白质沉淀

2，样品颜色较深时，可用活性炭脱色后再进行测定

3，此法与所用的硫酸浓度和加热时间有关

4，所取糖液浓度在1-2.5mg/100ml之间

（一）菲林试剂

1、试剂

费林试剂：

甲液：

称取15g硫酸铜（CuSO4·5H2O）及0.05g亚甲基蓝，溶于蒸馏水中并稀释到1000mL。

乙液：

称取50g酒石酸钾钠及75gNaOH，溶于蒸馏水中，再加入4g亚铁氰化钾［K4Fe（CN）6］，完全溶解后，用蒸馏水稀释到1000mL，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。

0.1％葡萄糖标准溶液：

准确称取1.000g经98～100℃干燥至恒重的无水葡萄糖，加蒸馏水溶解后移入1000mL容量瓶中，加入5mL浓HCl（防止微生物生长），用蒸馏水稀释到1000mL。

6mol/LHCl：

取250mL浓HCl（35%～38%）用蒸馏水稀释到500mL。

碘－碘化钾溶液：

称取5g碘，10g碘化钾溶于100mL蒸馏水中。

6mol/LNaOH：

称取120gNaOH溶于500mL蒸馏水中。

0.1%酚酞指示剂。

2、材料

辣椒，淀粉。

3、器材

试管3.0×20cm（×1）；移液管5mL（×2）；烧杯100mL（×1）;250mL锥形瓶;调温电炉;滴

定管25mL（×1）。

（二）样品中还原糖的提取

准确称取1g辣椒粉，放在100mL烧杯中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加入约40mL蒸馏水，混匀，于50℃恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出混。

过滤，将滤液全部收集在50mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。

（三）样品中总糖的水解及提取

准确称取1g淀粉，放在大试管中，加入6mol/LHCl10mL，蒸馏水15mL，在沸水浴中加热0.5h，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。

如已水解完全，则不呈现蓝色。

水解毕。

冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6mol/LNaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100mL，过滤取滤液10mL于100mL容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。

（四）空白滴定

准确吸取费林试剂甲液和乙液各5.00mL，置于250mL锥形瓶中，加蒸馏水10mL。

从滴定管滴加约9mL葡萄糖标准溶液，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以每2s1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。

记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。

平行操作3次，取其平均值，按下式计算：

式中：

F──10mL费林试剂（甲液和乙液各5.00mL）相当于葡萄糖的量，mg；

C──葡萄糖标准溶液的浓度，mg/mL；

V──标定时消耗葡萄糖标准溶液的总体积，mL。

（五）样品糖的定量测定

（1）样品溶液预测定：

吸取费林试剂甲液及乙液各5.00mL，置于250mL锥形瓶中，加蒸馏水10mL，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以先快后慢的速度从滴定管中滴加样品溶液，滴定时要保持溶液呈沸腾状态。

待溶液由蓝色变浅时，以每2s1滴的速度滴定，直至溶液的蓝色刚好褪去为终点。

记录样品溶液消耗的体积。

（2）样品溶液测定：

吸取费林试剂甲液及乙液各5.00mL，置于锥形瓶中，加蒸馏水10mL，加玻璃珠3粒，从滴定管中加入比与测试样品溶液消耗的总体积少1mL的样品溶液，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以每2s1滴的速度继续滴加样液，直至蓝色刚好褪去为终点。

记录消耗样品溶液的总体积。

平行操作3次，取其平均值。

（六）结果处理

其中：

m──样品重量，g；

式中：

F──10mL费林试剂（甲液和乙液各5.00mL）相当于葡萄糖的量，mg；

V──标定时平均消耗还原糖或总糖样品溶液的总体积，mL；

V1──还原糖或总糖样品溶液的总体积，mL；

1000──mg换算成g的系数。

注意事项

（1）费林试剂甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。

（2）滴定必须是在沸腾条件下进行，其原因一是加快还原糖与Cu2＋的反应速度；二是亚甲基蓝的变色反应是可逆的，还原型的亚甲基蓝遇空气中的氧时会再被氧化为氧化型。

此外，氧化亚铜也极不稳定，易被空气中的氧所氧化。

保持反应液沸腾可防止空气进入，避免亚甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加消耗量。

（3）滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。

二、维生素C的含量-----钼蓝比色分光光度法,

原理：

因为磷钼酸铵经还原剂维生素C还原后,可以生成亮蓝色的络合物,通过分光比色可以测定青椒中还原维生素C[6]。

本法快速、准确、灵敏度高。

仪器与实验材料

紫外-可见分光光度计（UV-1600,日本岛津）;6%的钼酸铵溶液:

准确称取钼酸铵30.0000g,加适量蒸馏水溶解后定容至500mL;草酸-EDTA溶液:

准确称取含结晶水的草酸6.5000g,EDTA0.0600g,充分溶解定容至1000mL;偏磷酸-醋酸溶液:

溶解20g片状偏磷酸于40mL醋酸中,稀释至500mL,用滤纸过滤,取滤液备用;标准Vc溶液:

准确称取Vc0.0500g;用上述配好的草酸-EDTA溶液定容于100mL的容量瓶中,使标准液浓度达到0.5mg?

mL;6%的硫酸溶液。

准确称取一定量的市售青椒,加入草酸-EDTA溶液,用搅碎机捣碎后移入250mL容量瓶中,定容,过滤,滤液即为待测样品的提取液。

吸取上述青椒的提取液1mL于25mL的容量瓶中,加入9.00mL草酸-EDTA溶液1.00mL偏磷酸-醋酸溶液和3.00mL的硫酸,最后再加入3.00mL钼酸铵,显色。

三、测微量元素Fe、Cu、zn、Mg、Na、Ca、Mn----吸光光度法

试剂：

HNO3，HC104，蒸馏水，均为分析纯。

仪器：

TAS一986型原子吸收分光光度计，DT一100型光电天平，DOB20003型恒温烤箱.

1样品处理将青辣椒、红辣椒自然晾干、粉碎。

放人恒温箱80℃恒温干燥至恒重，精确称取0．500g样品置于50mL带塞锥形瓶中，加入混合液（HNO3）+V（HC104）=2+110mL盖上塞子，放人70~C的恒温烤箱内进行消化8h，然后去塞，并按下列程序控温消化赶酸：

100℃30min，120℃30min，150℃120min。

消化赶酸完成时，溶液为淡黄色清亮液体，稍冷即为无色，冷却后，用2o％的稀硝酸定容至50mL的容量瓶中，待测。

同时作试剂空白对照。

2测定方法原子吸收分光光度法测定青辣椒、红辣椒中Fe、Cu、zn、Mg、Na、Ca、Mn的含量。

采用计算机程序控制，以非线性校正方式测定。

4、考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量

（一）原理：

考马斯亮蓝G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。

考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。

其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。

蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。

该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg/mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

（二）材料、主要仪器和试剂

1．实验材料

新鲜辣椒

2．主要仪器

（1）分析天平、台式天平

（2）刻度吸管

（3）具塞试管、试管架

（4）研钵

（5）离心机、离心管

（6）烧杯、量筒

（7）微量取样器

（8）分光光度计

3．试剂

（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：

准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1000μg／mL的原液。

（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制：

称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。

此溶液在常温下可放置一个月。

（3）乙醇

（4）磷酸（85％）

（三）操作步骤

1．标准曲线制作

（1）0~100μg／mL标准曲线的制作：

取6支10mL干净的具塞试管，按表1取样。

盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。

表1低浓度标准曲线制作

管号

1

2

3

4

5

6

1000μg／mL标准蛋白液（mL）

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

蒸馏水（mL）

1.00

0.98

0.96

0.94

0.92

0.90

考马斯亮蓝G-250试剂（mL）

5

5

5

5

5

5

蛋白质含量（μg）

0

20

40

60

80

100

OD595

（2）0~1000μg／mL标准曲线的制作：

另取6支10mL具塞试管，按表2取样。

其余步骤同

（1）操作，做出蛋白质浓度为0~1000μg／mL的标准曲线。

表2高浓度标准曲线制作

管号

7

8

9

10

11

12

1000μg／mL标准蛋白液（mL）

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

蒸馏水（mL）

1.00

0.8

0.6

0.4

0.2

0

考马斯亮蓝G-250试剂（mL）

5

5

5

5

5

5

蛋白质含量（μg）

0

200

400

600

800

1000

OD595nm

2．样品提取液中蛋白质浓度的测定

（1）待测样品制备：

称取新鲜辣椒2g放入研钵中，加2mL蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.5~1h以充分提取，然后在4000r/min离心20min，弃去沉淀，上清液转入10mL容量瓶，并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。

（2）测定：

另取2支10mL具塞试管，按下表取样。

吸取提取液0.1mL（做一重复），放入具塞刻度试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录光密度OD595nm，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（μg）。

以标准曲线1号试管做空白。

把x、y数据分别输入上下二行中，点击这个数据表中任一单元格，然后插入-图表，图表类型选xy散点图，子图表可任选一个自已需要的，再按提示一路下一步，最后点完成。

在生成的图中右击数据线，在出现的下拉快捷菜单中点击添加趋势线，在类型中选线性（因你的方程是一次线性方程），在选项中选显示公式（还可勾选“显示R平方值，这是相关系数，表示线性程度）最后按确定，ok了。

这时在图出现的公式就是你要的回归方程。

当然，你也可不用图表的方式，可用函数LINEST，INTERCEPT来分别求出A、B值，但本人用下来这个方法最方便。

1、输入数据后，单击“图表向导”，启动“图表向导”后，选择绘制“xy散点图”；

2、完成后，执行“图表/添加趋势线/"根据散布图的线的变化趋势，结合函数图像，选择相应的线形；

3在选项标签中，选中“显示公式”，单击确定。

A，B和表达式全有了！

五、辣椒素含量测定---高相液相色谱