6工作手册第四章第六节生物毒素.docx
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6工作手册第四章第六节生物毒素
第六节生物毒素
1、需要讨论/说明的内容:
1.1脱氧镰刀雪腐菌烯醇
1.1.1GB/T23503-2009检出限高,是否可以使用
1.1.2缺少婴幼儿谷类辅助食品中DON及其衍生物的测定方法
1.1.3手册中方法是否可以?
有无需要修改的地方
1.2黄曲霉毒素
手册及国标方法是否可以?
手册方法有无需要修改的地方
1.3伏马菌素
国标GB/T25228-2010方法只适用于玉米及其制品,缺少小麦粉、玉米油的检测方法
1.4玉米赤霉烯酮
国标GB/T23504-2009方法,检出限高,是否可以使用
1.5麻痹性贝类毒素
GB/T23215-2008中方法和手册中方法检出污染物有矛盾,采用哪种方法?
1.6河豚毒素
监测手册中方法除适用范围比国标方法外,与国标方法完全一致,因此只保留监测手册方法
1.7手册中其他方法是否有需要修改或补充的
2、手册以外可以使用的方法(如国标等)
监测方法名称_方法来源_仪器_适用范围_检出限_定量限__谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定_GB/T5009.111-2003第二法_酶联免疫法_谷物及其制品_0.1ng/kg___食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定_GB/T23503-2009_免疫亲和层析净化-高效液相_粮食和粮食制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品_粮食0.5mg/kg,其他0.1mg/kg___食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定_GB/T5009.23-2006第三法_高效液相_大米、玉米、花生、杏仁、核桃、松子等_0.2ug/kg;0.05ug/kg___食品中黄曲霉毒素的测定_GB/T18979-2003第一法_免疫亲和层析净化一高效液相_玉米、花生及其制品、大米、小麦、植物油脂、酱油、食醋等_1ug/kg___粮油检验玉米及其制品中伏马毒素含量测定_GB/T23228-2010第一法_免疫亲和-高效液相_玉米和玉米制品_0.1mg/kg___谷物中玉米赤霉烯酮的测定_GB/T5009.209-2008_免疫亲和柱净化-液相_谷物_5ug/kg___食品中玉米赤霉烯酮的测定_GB/T23504-2009_免疫亲和层析净化-高效液相_粮食及其制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品_粮食20ug/kg___贝类中多种麻痹性贝类毒素含量的测定_GB/T23215-2008_液相色谱-荧光_贝类____水产品中腹泻性贝类毒素残留量的测定_DB33/T743-2009_液相色谱-串联质谱_水产品__0.02mg/kg_
1食品中脱氧雪腐镰刀烯醇及其衍生物测定的标准操作程序
1适用范围
本程序规定了高效液相色谱-质谱法测定大米、小麦、玉米、坚果等食品或制品中脱氧雪腐镰刀烯醇(DON),隐蔽型脱氧雪腐镰刀烯醇(Deepoxy-DON),3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-ADON),15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-ADON),雪腐镰刀菌烯醇(NIV),镰刀菌烯酮(FusX)等毒素的条件和详细分析步骤。
本程序适用于大米、小麦、玉米、坚果等食品或制品中B类单端孢烯霉族类真菌毒素的测定。
当采用低分辨质谱对真菌毒素进行定量分析,毒素的两个MRM离子通道均需要出比较明显的色谱峰。
根据此原则,以定性离子通道中信噪比(S/N)为3时样品溶液中各种真菌毒素的浓度为检测限,以定量离子通道信噪比(S/N)为10时样品溶液中各种真菌毒素的浓度为定量限,各种真菌毒素的检测限和定量限分别低于0.8和2μg/kg。
2原理
试样加入适量的同位素内标13C-脱氧雪腐镰刀烯醇(13C-DON),经乙腈-水溶液浸泡、超声波震荡提取,离心后,上清液经固相萃取柱净化,浓缩定容后进液相色谱—质谱系统分析,同位素稀释法定量。
3试剂
3.1乙腈,色谱纯、分析纯。
3.2甲醇,色谱纯。
3.3氨水,分析纯
3.4(84+16,V/V)乙腈—水提取液:
用1000mL量筒量取乙腈(分析纯)840mL,加水160mL,混匀。
3.510mM醋酸铵溶液:
取0.79g醋酸铵加入1000mL超纯水,混匀。
3.6(20+80,V/V)的乙腈-醋酸铵水溶液:
用1000mL量筒量取乙腈(分析纯)200mL,加入3.5配置的醋酸铵溶液800mL,混匀。
3.7标准品
雪腐镰刀菌烯醇(NIV)、镰刀菌烯酮(FusX)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、隐蔽型脱氧雪腐镰刀烯醇(Deepoxy-DON)、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-ADON)、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-ADON)的固体或液体标准品,纯度≥99.9%。
13C-脱氧雪腐镰刀烯醇(13C-DON)液体同位素标准液,纯度≥99.9%。
(均购自ROMER公司或SIGMA公司)。
3.8单一标准储备液的配制
分别精确称取6种固体标准品1.000mg,用乙腈溶解定容至10mL,混匀。
此标准溶液浓度为0.100mg/mL,存储于棕色玻璃瓶中,-20℃下避光保存。
3.9混合标准工作液
用移液器分别吸取6种标准储备液1mL,用(20+80)的乙腈-10mM醋酸铵水溶液定容至10mL梯度稀释,制备成每毫升含10μg6种标准品的标准使用液。
在4℃冰箱中保存,可稳定1个月。
3.10同位素内标工作液
用250μL注射器吸取对照品溶液100μL(25μg/mL,纯度:
99%),用(20+80)的乙腈-10mM醋酸铵水溶液稀释配置成250ng/mL的工作液。
在4℃冰箱中保存,可使用1个月。
4仪器与耗材
4.1串联液质联用仪。
4.2涡旋器。
4.3高速离心机配有50mL的离心管。
4.4超声波振荡器。
4.5氮吹仪。
4.6粉碎机。
4.7多功能净化柱:
MycosepTM227多功能净化柱或相当者。
5操作步骤
5.1前处理
取样品2kg,经固体粉碎机粉碎成粉末状,混匀过筛,备用。
称取样品粉末2g,准确称量后置于50mL的离心管中,加入200μL内标后,加入(84+16)乙腈—水溶液10mL,浸泡60min,超声波超声60min,15000转/分下离心15分钟,收集上清液至MycosepTM227净化柱的玻璃管内,将净化柱的填料管插入玻璃管中并缓慢推动填料管,取5mL续滤液转移到氮吹瓶中。
在40-50℃下氮气吹干,用(20+80)乙腈-10mM醋酸铵水溶液定容至1mL,涡旋30s,用0.22μm微孔滤膜过滤于进样瓶中。
5.2液相色谱参考条件
a)色谱柱:
AcquityUPLCBEHC18柱,150mm×2.1mm,粒径1.7μm或相当者;
b)柱温:
40℃;
c)样品温度:
4℃;
d)进样体积:
5μL;
e)流动相为A:
0.2%氨水,B:
乙腈;
f)线性梯度洗脱条件:
0-4min,B%5%-19%;4-5min,B%19%-20%;5-6.5min,B%20%-21%,6.5-7min,B%21%-100%;7-7.5min,B%保持100%,7.5-7.8min,B%100%-5%,平衡2.2min,总运行时间10min;
g)流速:
0.35mL·min-1。
5.3质谱参考条件
a)毛细管电压:
2.5kV;
b)电离模式:
ESI-;
c)离子源温度:
150℃;
d)脱溶剂气温度:
500℃;
e)碰撞梯度:
1.5;
f)脱溶剂气流量:
900L/hr;
g)反吹气流量:
30L/hr;
h)电子倍增电压:
650V;
i)碰撞室压力:
3.0×10-3mbar。
各种真菌毒素的质谱条件参数见表1
表1目标化合物的主要参考质谱参数
真菌毒素
种类
母离子
(m/z)
锥孔电压
定量离子
(m/z)
碰撞电压
(eV)
定性离子(m/z)
碰撞电压
(eV)
NIV
311
22
281
10
205
22
DON
295
26
265
11
138
19
13C-DON
310
26
279
10
261
16
3-ADON
337
24
307
15
173
9
15-ADON
337
20
150
23
219
11
FusX
353
26
263
13
187
19
Deepoxy-DON
279
20
249
14
231
14
5.4标准曲线制备
用移液器吸取混标溶液和内标溶液适量,用(20+80)乙腈-10mM醋酸铵水溶液配成2,5,10,20,50,100,200,500,1000μg/mL的系列标准溶液,每份溶液含25ng/mL的同位素内标,经LC-MS/MS分析,采用同位素稀释法建立标准曲线。
5.5样品测定
试样液经LC-MS/MS分析,测得其峰面积,采用同位素稀释法通过上述标准曲线计算其浓度。
在测定过程中,建议每测定10~20个样品用同一份标准溶液或标准物质检查仪器的稳定性。
5.6色谱质谱图
图1标准图谱
图2样品图谱
6结果计算
试样中真菌毒素含量按式
(1)进行计算。
………………………………
(1)
式中:
X——试样中真菌毒素的含量,单位为微克每千克(μg/kg);
C1——测定样品溶液中真菌毒素的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL);
V——试样消化液总体积,单位为毫升(mL);
m——试样质量,单位为克(g)。
按照数值修约规则保留结果的有效数字。
测定结果的表述:
报告平行样测定值的算术平均值。
7精密度
在重现性条件下对参照物或添加材料进行重复分析的实验室之间的变异系数(CV),不应超过用Horwitz公式计算得到的水平。
公式如下:
………………………………
(2)
此处C是表示为10的幂数的质量范围(即1mg/g=10-3)。
参考值见表2
表2在分析物质量范围内定量方法的重复性CV参考值
质量范围(μg/kg)
≤1
1~10
10~100
100-1000
≥1000
重复性(%)
(*)
(*)
(*)
23
16
(*)对于低于100μg/kg的质量范围,用Horwitz公式计算会得出不可接受的高值。
因此,对于低于100μg/kg的浓度其CVs应尽可能地低。
对于在重复性条件下进行的分析,实验室内CV应特别地位于上述数值的1/2~2/3之间。
对于在实验室内重现性条件下进行的分析,实验室内的CV不应大于重现性CV。
对于有规定的允许限度的物质,方法应达到实验室内的重现性不大于在0.5倍允许限度的浓度时相应得到的重现性CV。
8说明
8.1由于试样中的真菌毒素存在着不均匀性,因此应在抽样中注意抽样量至少2kg。
样品采集和收到后,应尽快粉碎成粉末状,过筛混匀后,放入密闭容器中,于-20℃下避光保存。
8.2在检测中,尽可能使用有证标准物质作为质量控制样品,也可采用加标回收试验进行质量控制。
8.3质控物质尽量选用与样品基质相同或相似的质控样品作为质量监控的标准。
质控样与待测样品按相同方法同时进行处理后,测定其真菌毒素含量。
测定结果应在证书给定的标准值±不确定度的范围内。
每批样品至少分析1个质控样品。
8.4加标回收试验采取称取与样品量相同的样品,加入一定浓度的真菌毒素标准混合溶液,然后将其与样品同时处理后进行测定,计算加标回收率。
每10个样品测定1个加标回收率,若样品量少于10个,至少测定1个加标回收率。
加标回收率参考值见表3。
表3食品中真菌毒素测定的加标回收率参考值
质量范围(μg/kg)
≤1
1~10
≥10
加标回收率(%)
50~120
70~115
80~110
8.5提取的过程需要充分的浸泡和振荡;
8.6在使用mycosep227小柱过滤时注意需要缓慢的推进;氮吹过程气流不能太大,最后应吹至近干;
8.7进样前的定容液用(20+80)乙腈-10mM醋酸铵水溶液。
8.8清洗过的所有玻璃容器(试管和进样瓶)要75℃烘干后,再放入马弗炉400℃下灼烧,在放入马弗炉和从中取出时,应防止温度的变化引起的爆裂。
2食品中黄曲霉毒素(B1,B2,G1,G2)多功能柱净化-HPLC-RF法测定的标准操作程序
1适用范围
本程序规定了高效液相色谱-荧光法测定玉米、花生、大米、杏仁、核桃、松子等食品中黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2的条件和详细分析步骤。
本程序适用于玉米、花生、大米、杏仁、核桃、松子等食品中黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2的测定。
本法中黄曲霉毒素B2,G2,B1,G1的检测限分别为0.5,0.5,1.5,1.5μg/kg,定量限为1.5、1.5、5、5μg/kg;B1,G1的分析范围为5-50μg/kg,B2、G2的线性范围为1.0-25μg/kg。
2原理
试样经乙腈-水提取,提取液过滤后,经装有反相离子交换吸附剂的多功能柱净化,去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物质。
净化液中的黄曲霉毒素用三氟乙酸衍生,用带有荧光检测器的液相色谱系统定量分析,外标法定量。
3试剂
除有特殊指明外,本方法中使用的试剂均为分析纯,试验用水均为电导率为18.2兆欧的水。
3.1乙腈,色谱纯
3.2三氟乙酸
3.3正己烷
3.4乙腈—水(84+16)提取液:
量取乙腈840mL,加水160mL,混匀。
3.5乙腈—水(15+85)溶液:
量取乙腈150mL,加水850mL,混匀。
3.6衍生液:
量取三氟乙酸1mL,加正己烷2mL,混匀。
此溶液密封后4℃保存,一周有效。
3.7黄曲霉毒素标准储备液(B1:
5,B2:
1.5,G1:
5,G2:
1.5μg/mL):
购自Sigma公司(编号:
A9441),2—8℃保存。
3.8黄曲霉毒素B和G的标准稀释液(B1,G1为1μg/mL,B2,G2为0.3μg/mL):
将一定体积的储备液用乙腈定容至5mL,混匀,2—8℃保存三个月。
3.9黄曲霉毒素B和G的HPLC标准使用液
标准#
B1,G1浓度
(ng)
B2,G2浓度
(ng)
混合工作溶液体积
(μL)
1
5
1.5
25
2
10
3
50
3
20
6
100
4
30
9
150
5
40
12
200
6
50
15
250
4仪器与耗材
4.1高效液相色谱仪,ZorbaxSBC184.6×250mm,要求4种毒素的峰能够达到基线分离。
4.2高速离心机
4.3食品搅拌机
4.4漩涡混合器
4.5电动振荡器
4.6恒温箱
4.7吹氮仪
4.8多功能净化柱:
MycosepTM228多功能净化柱
5操作步骤
5.1试样提取
称取50g样品于食品搅拌机中,加入(84+16)乙腈—水提取液200mL,搅拌30分钟。
或称取20g经粉碎过20目筛的试样至250mL的三角瓶中,加入(84+16)乙腈-水溶液80mL,在电动振荡器上振荡30min。
定性滤纸过滤,收集滤液。
5.2试样净化
移取8mL提取液至多功能净化柱的玻璃管内,将多功能净化柱的填料管插入玻璃管中并缓慢推动填料管,净化液就被收集到净化柱的收集池中。
5.3试样衍生化
从净化柱的收集池内转移2mL净化液到衍生瓶中,在60℃水浴下氮气彻底吹干,注意不要使液体鼓泡、飞溅。
加入正己烷200μL和三氟乙酸100μL,混匀30sec后,在40℃±1℃烘箱中衍生15min。
室温下干燥后以(85+15)水—乙腈200μL溶解,混匀30sec,取上清液150μL至自动进样的样品瓶中,供液相色谱仪测定用(试样的提取、净化、衍生需在通风橱内进行)。
5.4标准系列溶液的制备
吸取标准系列溶液各200μL,在60℃水浴下氮气吹干,衍生化方法相同。
5.5高效液相色谱条件
色谱柱:
15cm×4.6mm,5m,ZobaxC18
柱温:
25℃
流动相:
乙腈(色谱纯),水,梯度洗脱的变化可参考表1。
调整洗脱梯度,使4种黄曲霉毒素的保留时间在4~25分钟。
表1流动相的梯度变化
时间(min)
乙腈(%)
水(%)
0.00
15.0
85.0
6.00
17.0
83.0
8.00
25.0
75.0
13.00
25.0
75.0
14.00
15.0
85.0
17.00
15.0
85.0
流速:
1.0mL/min。
进样量:
25μL。
荧光检测器:
激发波长:
360nm,发射波长:
440nm。
5.6测定
黄曲霉毒素按照G1、B1、G2、B2的顺序出峰,以标准系列的峰面积对浓度分别绘制每种黄曲霉毒素的标准曲线。
标准曲线的相关系数r必须大于0.995方可使用。
试样通过与标准色谱图保留时间的比较确定每一种黄曲霉毒素的峰,根据每种黄曲霉毒素的标准曲线及试样中的峰面积计算试样中各种黄曲霉毒素含量。
5.7色谱图
黄曲霉毒素的色谱图(出峰顺序依次为G1、B1、G2、B2)
6结果计算
按下
(1)式计算样品中每种黄曲霉毒素的浓度:
C=(A×V)/(m×f)…………………………
(1)
式中:
C——试样中每种黄曲霉毒素含量,单位为微克每千克(μg/kg);
A——试样按外标法在标准曲线中对应的浓度,单位为微克每升(μg/L);
V——试样提取过程中提取液的体积,单位为毫升(mL);
m——试样的取样量,单位为克(g);
f——浓缩倍数。
计算结果表示到三位有效数字。
7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的相对相差不得超过算术平均值的10%。
8说明
8.1由于试样中的真菌毒素存在着不均匀性,因此应在抽样中注意抽样量至少2kg。
样品采集和收到后应用纸袋或布袋储存在干燥凉爽的地方,以避免微生物或霉菌的生长。
8.2实验尽可能在通风橱中完成操作,当毒物处于干燥状态时因为静电作用会导致其分散在空气中,所以应进行必要的防护。
8.3如果黄曲霉毒素不小心溅出,可用次氯酸钠漂白剂处理。
8.4需要对空白样品进行加标实验,回收率达到70±20%。
每检测10个样品均要进行一次加标回收和检测一个重复样品。
在试验开始和结束时都应检测标准,以此来检察标准曲线。
每一批样品均要检测一个空白。
8.5对接触过黄曲霉毒素的所有玻璃器皿用1%次氯酸钠和丙酮清洗。
3食品中黄曲霉毒素(B1,B2,G1,G2)免疫亲和柱净化-光化学柱后衍生—HPLC-RF法测定的标准操作程序
1适用范围
本程序规定了免疫亲和柱净化-光化学柱后衍生-高效液相色谱-荧光法测定食品中黄曲霉毒素的条件和详细分析步骤。
本程序适用于玉米、花生及其制品(花生酱、花生仁、花生米)、大米、小麦、高粱、燕麦、植物油、坚果、八角、桂皮、辣椒、胡椒、酱油、食醋、大豆酱、芝麻酱、发酵酒(啤酒、黄酒)等食品中黄曲霉毒素的测定。
本方法黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检测限和定量限均为0.5g/kg和1.5g/kg。
2原理
试样经过甲醇-水提取,提取液经过滤、稀释后,滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和柱净化,此抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有专一性,黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。
用水或吐温/PBS将免疫亲和柱上杂质除去,以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱,洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪、柱后光化学衍生后测定黄曲霉毒素的含量。
3试剂
除非另有规定,仅使用分析纯试剂、重蒸馏水。
3.1甲醇:
色谱纯
3.2甲醇-水(7+3):
取70mL甲醇加30mL水
3.3甲醇-水(8+2):
取80mL甲醇加20mL水
3.4甲醇-水(45+55):
取45mL甲醇加55mL水
3.5氯化钠,分析纯,北京化学试剂公司
3.6磷酸氢二钠,分析纯,北京化学试剂公司
3.7磷酸二氢钾,分析纯,北京化学试剂公司
3.8氯化钾,分析纯,北京化学试剂公司
3.9PBS缓冲溶液:
称取8.0g氯化钠,1.2g磷酸氢二钠,0.2g磷酸二氢钾,0.2g氯化钾,用990mL纯水溶解,然后用浓盐酸调节pH值至7.0,最后用纯水稀释至1000mL。
3.10吐温-20/PBS溶液(0.1%):
取1mL吐温-20,加入PBS缓冲溶液并定容至1000mL。
3.11pH7.0磷酸盐缓冲溶液:
取0.2mol/L的磷酸二氢钾溶液22.3mL与0.1mol/L的氢氧化钠溶液29.1mL混匀后,稀释到100mL。
2.3.12黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合标准溶液:
纯度≥99%,美国SIGMA。
3.13黄曲霉毒素混合标准工作液:
准确移取适量的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准溶液,用甲醇稀释成混合标准工作液。
4仪器与耗材
4.1高效液相色谱仪:
具有360nm激发波长和大于420nm发射波长的荧光检测器。
4.2高速均质器:
18,000r/min22,000r/min。
4.3黄曲霉毒素免疫亲和柱(Afla-P),美国VICAM。
4.4玻璃纤维滤纸:
直径11cm,孔径1.5μm,美国VICAM。
4.5玻璃试管:
直径12mm,长75mm,无荧光特性。
4.6色谱柱:
C18柱(柱长150mm,内径4.6mm,填料直径5m),Cloversil,美国CLOVER。
4.9光化学衍生器,PHRED,美国AURA。
5操作步骤
5.1提取
5.1.1玉米、花生及其制品(花生酱、花生仁、花生米)、大米、小麦、高粱、燕麦、植物油、坚果、八角、桂皮、辣椒、胡椒、大豆酱、芝麻酱、饲料、棉籽、烟草:
准确称取经过磨细(粒度小于2mm)的试样25.0g于250mL具塞锥形瓶中,加入5.0g氯化钠及准确加入125.0mL(
)甲醇-水(7+3),以均质器高速搅拌提取2min。
定量滤纸过滤,准确移取15.0mL(
)滤液并加入30.0mL(
)水稀释,用玻璃纤维滤纸过滤1~2次,至滤液澄清,备用。
5.1.2植物油和啤酒:
准确称取试样25.0g于250mL具塞锥形瓶中,加入5.0g氯化钠及加入甲醇-水(7+3)至125.0mL(
),以均质器高速搅拌提取2min。
定量滤纸过滤,准确移取15.0mL(
)滤液并加入30.0mL(
)水稀释,用玻璃纤维滤纸过滤1~2次,至滤液澄清,备用。
5.1.3酱油:
称取试样50.0g于250.0mL具塞锥形瓶中,加入2.5g氯化钠及加入甲醇-水(8+2)至100.0mL(
),以均质器高速搅拌提取1min。
定量滤纸过滤,准确移取10.0mL(
)滤液并加入40.0mL(
)水稀释,用玻璃纤维滤纸过滤1~2次,至滤液澄清,备用。
5.1.4食醋:
准确称取5.0g样品,加入1.0g氯化钠,以pH2.5.0磷酸盐缓冲溶液稀释至25.0mL(
),混匀,定量滤纸过滤。
取10.0mL(
)滤液加入10.0mL(
)缓冲液,混匀。
以玻璃纤维滤纸过滤1~2次,至滤液澄清,备用。
5.2净化
将免疫亲和柱连接于10.0mL或者15.0mL玻璃注射器下。
准确移取15.0mL(
)样品提取液注入玻璃注射器中,将空气压力泵与玻璃注射器连接,调节压力使溶液以约6mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱,直至2~3mL空气通过柱体。
以10.0mL水淋洗柱子2次
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- 工作手册 第四 第六 生物 毒素