流式细胞技术.ppt
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流式细胞技术与流式细胞仪流式细胞技术与流式细胞仪flowcytometry&FlowCytometer(FCM)主要内容主要内容p基本原理基本原理p基本结构基本结构p主要性能指标主要性能指标p临床应用临床应用流式细胞仪的发展简史流式细胞仪的发展简史p19341934年年MoldavanMoldavan使悬浮的血红细胞从一个使悬浮的血红细胞从一个毛细玻璃管中流过,每个通过的细胞可被毛细玻璃管中流过,每个通过的细胞可被一个光电装置记录下来,这可谓流式细胞一个光电装置记录下来,这可谓流式细胞仪的最初模型。
仪的最初模型。
p19471947年,年,GuckerGucker首次采用鞘流原理对气体首次采用鞘流原理对气体中的微粒进行计数。
中的微粒进行计数。
p19531953年,年,Crosland-TaylorCrosland-Taylor利用同一原理,利用同一原理,成功的设计了一种鞘流系统,配合光电技成功的设计了一种鞘流系统,配合光电技术对红细胞进行计数。
术对红细胞进行计数。
p19691969年年VanVanDillaDilla和和LosAlamosLosAlamos采用了采用了Crosland-TaylorCrosland-Taylor设计的层流流动室和氩离子设计的层流流动室和氩离子激光器开发出了液流束、照明光轴,检测系统激光器开发出了液流束、照明光轴,检测系统三者互相垂直的流式细胞仪,成为目前各种流三者互相垂直的流式细胞仪,成为目前各种流式细胞测量仪的基础。
式细胞测量仪的基础。
p19721972年年,数位研究者在斯坦佛大学研制了一台,数位研究者在斯坦佛大学研制了一台荧光激活细胞分选仪,它标志着流式细胞仪商荧光激活细胞分选仪,它标志着流式细胞仪商品化时代的真正到来。
品化时代的真正到来。
19741974年,年,BDBD公司正式投公司正式投产,商品名产,商品名FACS-1FACS-1TMTM.p目前的主流生产商,目前的主流生产商,美国的美国的BDBD公司、公司、CoulterCoulter公司。
公司。
一、流式细胞仪的基本原理一、流式细胞仪的基本原理
(一)流式细胞仪的分析原理
(一)流式细胞仪的分析原理单细胞液柱单细胞液柱已标记的单细已标记的单细胞悬液和鞘液胞悬液和鞘液硅化管硅化管流动室流动室喷嘴喷嘴荧光检测系统和荧光检测系统和散射光感受系统散射光感受系统收集光信号收集光信号荧光染料被荧光染料被激发发光激发发光光电倍增管光电倍增管脉冲信号脉冲信号计算机系统计算机系统分析结果分析结果放大放大垂直相交垂直相交形成稳态形成稳态水平激光与之水平激光与之细胞组成细胞组成细胞功能细胞功能大小大小细胞表面细胞表面/胞浆胞浆/核核-特异性抗原特异性抗原粒度粒度细胞活性细胞活性DNA,RNADNA,RNA含量含量胞内细胞因子胞内细胞因子蛋白质含量蛋白质含量激素结合位点激素结合位点钙离子钙离子,PH,PH值值,膜电位膜电位酶活性酶活性流式细胞仪常检测的细胞特性流式细胞仪常检测的细胞特性FCMFCM的液流系统(如的液流系统(如何形成单个细胞流)何形成单个细胞流)通过流式细胞仪进行细胞分选通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。
进一步培养和研究时进行的。
(二)流式细胞仪的分选原理
(二)流式细胞仪的分选原理细胞悬液形成液流柱细胞悬液形成液流柱流动室振动流动室振动液流断裂成液滴液流断裂成液滴空白液滴空白液滴含细胞的液滴含细胞的液滴弃去弃去偏转落入收集器偏转落入收集器压电晶体压电晶体产生产生机械振动机械振动不充电不充电充电充电分选基本原理分选基本原理二、流式细胞仪的基本结构二、流式细胞仪的基本结构p流动室及液流驱动系统流动室及液流驱动系统p激发光源及光束成形系统激发光源及光束成形系统p光学系统光学系统p信号检测和存储系统信号检测和存储系统p显示分析系统显示分析系统p细胞分选系统细胞分选系统
(一)流动室
(一)流动室p是是FCM的核心部件,由的核心部件,由石英玻璃制成,并在石石英玻璃制成,并在石英玻璃中央开一个孔径英玻璃中央开一个孔径为为的长方形孔,供单个细的长方形孔,供单个细胞通过,检测区在该孔胞通过,检测区在该孔的中心或下方。
的中心或下方。
p流动室内充满了鞘流,流动室内充满了鞘流,其作用是将样品流环包。
其作用是将样品流环包。
鞘流原理鞘流原理p细胞悬液流过检测光束,约细胞悬液流过检测光束,约30%的细胞在的细胞在流动中明显偏离轴心,有向流速较慢的区流动中明显偏离轴心,有向流速较慢的区域聚焦的趋势。
域聚焦的趋势。
p阻塞管路阻塞管路p聚焦的细胞直接影响测量结果聚焦的细胞直接影响测量结果p由于细胞偏离轴心造成其移动时间延长,降低由于细胞偏离轴心造成其移动时间延长,降低检测速度。
检测速度。
p激光束无法对准照射在细胞中心激光束无法对准照射在细胞中心鞘流原理鞘流原理p流动的液体可分为流动的液体可分为稳流稳流(层流层流)和和湍流湍流两种状态两种状态p层流原理层流原理:
液体流动状态有一个分界点,即雷诺数:
液体流动状态有一个分界点,即雷诺数p其定义为:
在一个直径为其定义为:
在一个直径为的管子内,液体的流速的管子内,液体的流速为为v,密度为,密度为,黏滞系数为,黏滞系数为,p当当时,液流处于层流状态;当时,液流处于层流状态;当时,液流处于湍流状态。
时,液流处于湍流状态。
p流式细胞仪中要求标本处于层流状态。
常把流速限流式细胞仪中要求标本处于层流状态。
常把流速限制在制在10m/s10m/s以下。
以下。
鞘流原理鞘流原理p由此发展的鞘流技术,实现两种液体的同轴流动,由此发展的鞘流技术,实现两种液体的同轴流动,标本位于轴心稳定流动,外面包被有鞘液。
标本位于轴心稳定流动,外面包被有鞘液。
p鞘流处于湍流状态,围绕标本喷嘴高速流动,这鞘流处于湍流状态,围绕标本喷嘴高速流动,这样就使得标本流与鞘流形成稳定的同轴流动状态。
样就使得标本流与鞘流形成稳定的同轴流动状态。
p由于标本喷嘴处于流动室的中心,就使得标本流由于标本喷嘴处于流动室的中心,就使得标本流在鞘流包被下,恒定处于同轴流动的中心位置,在鞘流包被下,恒定处于同轴流动的中心位置,其精度可以稳定在几个微米之内。
其精度可以稳定在几个微米之内。
p标本流的位置的稳定可通过调整它与鞘液流速的标本流的位置的稳定可通过调整它与鞘液流速的比例来实现,一般比例在比例来实现,一般比例在1:
501:
50到到11:
几百之间:
几百之间。
鞘流原理鞘流原理pBernoulli定律:
当液体流经截面不同的管道时,定律:
当液体流经截面不同的管道时,有有,S和和v分别是两个管道分别是两个管道的截面积和液体的流速。
的截面积和液体的流速。
鞘液流鞘液流动动方向方向LowerpressureTheBernoulliEffectVelocityGradient液流驱动系统液流驱动系统
(二)激光光源
(二)激光光源p流式细胞仪的激发光源通常采用激光,通常流式细胞仪的激发光源通常采用激光,通常用的激光包括用的激光包括氩离子激光氩离子激光(488nm)、He-Ne激光激光(633nm)和和半导体激光半导体激光(635nm)。
p由于细胞快速流动,通过光照区的时间只有由于细胞快速流动,通过光照区的时间只有1微秒左右,且细胞所携带荧光物质被激发出微秒左右,且细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱,与被照射的时间和激光光的荧光信号强弱,与被照射的时间和激光光的强度有关,因此细胞必须达到足够的光照的强度有关,因此细胞必须达到足够的光照强度。
强度。
(二二)激光光源激光光源p激光光源的宽度大于被测细胞,为零分辨激光光源的宽度大于被测细胞,为零分辨率信号。
率信号。
p狭缝扫描技术:
狭缝扫描技术:
(三)光学系统(三)光学系统p主要元件为滤光片,分长通滤光片、短通主要元件为滤光片,分长通滤光片、短通滤光片、带通滤光片。
滤光片、带通滤光片。
长波通双色长波通双色性反射镜:
性反射镜:
大于特定波大于特定波长的光通过长的光通过而将小于特定而将小于特定波长的光反射波长的光反射光学系统示意图光学系统示意图细胞通过激光照射区时细胞通过激光照射区时,受激光激发,产生代表,受激光激发,产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号,这些信号以细细胞内不同物质、不同波长的荧光信号,这些信号以细胞为中心,向空间胞为中心,向空间360360度立体角发射,产生散色光和荧度立体角发射,产生散色光和荧光信号。
光信号。
(四)信号检测系统(四)信号检测系统(四)信号检测系统(四)信号检测系统p散射光检测散射光检测p前向光散射前向光散射(FSC,ForwardScatter)p侧向光散射侧向光散射(SSC,SideScatter)p散射光不依赖任何细胞样品的制备技术散射光不依赖任何细胞样品的制备技术(如染色如染色),因此被称为细胞的物理参数或称固有参数。
以,因此被称为细胞的物理参数或称固有参数。
以上两种信号都是来自激光的原光束,其波长与激上两种信号都是来自激光的原光束,其波长与激光的波长相同。
光的波长相同。
p荧光检测荧光检测(Fluoresencedetector)p(11)前向散射光)前向散射光:
激光束照射细胞时,光以激光束照射细胞时,光以相对轴较小角度相对轴较小角度(0.5(0.51010)向前方散射的信号向前方散射的信号用于检测细胞等粒子的表面属性,信号强弱与用于检测细胞等粒子的表面属性,信号强弱与细胞体积大小成正比。
细胞体积大小成正比。
FALSSensorLaser前向散射光示意图前向散射光示意图p(22)侧向散射光:
)侧向散射光:
激光束照射细胞时,光以激光束照射细胞时,光以9090角散射的信号,侧向散射光对细胞膜、角散射的信号,侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感,可提供有关胞质、核膜的折射率更为敏感,可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息细胞内精细结构和颗粒性质的信息。
FALSSensor90LSSensorLaser侧向散射光侧向散射光示意图示意图测得的测得的FSFS与与SSSS信信号通过计算机处理,号通过计算机处理,可得到可得到FS-SSFS-SS图,由图,由此可仅用散射光信号此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进对未染色的活细胞进行分析或分选。
行分析或分选。
此为血细胞分类此为血细胞分类的基本原理,但不能的基本原理,但不能分析表面分子分析表面分子。
淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞中性粒细胞中性粒细胞光散射测量最有效用途:
光散射测量最有效用途:
从非均一群体中鉴别出某些亚群从非均一群体中鉴别出某些亚群(3)荧光检测)荧光检测p荧光信号由被检细胞上标记的荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料特异性荧光染料受受激发后产生,发射的荧光波长与激发光波长不同。
激发后产生,发射的荧光波长与激发光波长不同。
p每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色,通每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色,通过波长选择通透性滤片,可将不同波长的散射光过波长选择通透性滤片,可将不同波长的散射光和荧光信号区分开,送入不同的光电倍增管。
和荧光信号区分开,送入不同的光电倍增管。
p选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。
的多个不同特征。
p线性放大器和对数放大器线性放大器和对数放大器FITCFITCTexasredTexasredPE.PC.APCPE.PC.APCPEcy5PEcy5FL1FL1FL2FL2FL3FL3FL4FL4激光激光细细胞胞悬悬液液异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素得州红得州红能量传递复合染料能量传递复合染料藻胆蛋白类藻胆蛋白类几种常见的荧光染料几种常见的荧光染料
(1)荧光信号的面积和宽度)荧光信号的面积和宽度p所谓荧光信号的面积是所谓荧光信号的面积是采用对荧光光通采用对荧光光通量进行积分测量,一般对量进行积分测量,一般对DNA含量测量含量测量时,均采用面积时,均采用面积(FL2A)来计算。
这是来计算。
这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度因为荧光脉冲的面积比荧光
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- 细胞 技术