药厂常见细菌鉴定方法.docx
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药厂常见细菌鉴定方法
4.1细菌同定流程图
4.2纯化培养
4.2.1实验器具
4.2.1.1酒精灯
4.2.1.2接种环
4.2.1.3SA平板
4.2.1.4恒温培养箱
4.2.1.5超净工作台
4.2.2实验过程
用灼烧后接种环取一点菌苔或细菌悬液,在平板一侧边缘处,反复涂抹在直径约为1cm大小的面积上;灼烧接种环,冷却后,从上述涂菌处划出7∽8条直线,前3∽4条线从涂菌处划出,后3∽4条可不通过涂菌处,划线时接种环与平板表面成30°∽40°角,轻轻接触,不要使接种环划破表面;如上述烧灼、划线操作再重复数次,以划满整个平板为宜;倒置平板,于最适温度培养1∽2天,出现单菌落即为纯化细菌。
划线分离纯化法
4.3细菌染色及镜检
4.3.1实验器具
4.3.1.1相差显微镜
4.3.1.2香柏油
4.3.1.3二甲苯
4.3.1.4擦镜纸
4.3.1.5载玻片
4.3.1.6接种环
4.3.1.7革兰氏染色液:
草酸铵结晶紫染液(A液:
2克结晶紫+20ml乙醇;B液:
0.8克草酸铵+80ml水;混合A、B二液,静置48小时后使用)。
碘液(碘1g,碘化钾2g,先将碘化钾溶解在少量水中,再将碘溶解在碘化钾溶液中,后加水至300ml,保存于棕色瓶中)。
番红液(2.5g番红+100ml乙醇溶解,取10ml与80ml水混合即可)。
95%乙醇
4.3.1.8生理盐水
4.3.1.9空平皿
4.3.1.10滤纸片(新华滤纸)
4.3.1.11烘箱(55℃±1℃)
4.3.1.125%孔雀绿水溶液(5g孔雀绿溶于100ml水中);
4.3.1.130.5%番红水溶液(0.5g番红溶于100ml水中);
4.3.1.14滴管
4.3.2革兰氏染色实验过程
操作顺序
方法要点和注意事项
1制片:
取一小滴生理盐水于干净载玻片上,用接种环蘸取少许待测菌于水滴中,涂磨成菌浆;
2固定:
手持载玻片,将背面迅速通过火焰2-3次,待冷却后重复此动作,至表面干燥;
3初染:
将固定好的涂片加滴结晶紫一分钟,用流水冲去染液,;
4媒染:
加碘液一分钟,流水冲去碘液并吸干
5脱色:
慢慢滴加95%乙醇直到染料不再流去,一般约为30秒,;立即用流水冲去并吸干;
6复染:
加番红液复染1-2分钟,水洗;
7镜检:
干燥后,用油镜观察;
8报告:
镜检呈紫色为阳性菌,红色为阴性菌;
注意接种环无菌操作,菌体量适中
注意玻片温度不能超过60℃(以玻片背面不烫手为宜),否则会改变甚至破坏细胞形态
水洗时不要直接冲洗涂面,而应使水从载玻片的一端流下,水流不宜过急、过大,以免涂片薄膜脱落
脱色时间需严格掌握,否则易造成假阳性或假阴性
以分散开的细菌的革兰氏染色为准,过于密集的细菌,常常呈假阳性。
4.3.3芽孢染色实验过程
操作顺序
方法要点和注意事项
1制片:
取一小滴生理盐水于干净载玻片上,用接种环取少许待测菌于水滴中,涂磨成菌浆。
2固定:
手持载玻片,将背面迅速通过火焰2-3次,待冷却后重复此动作,至表面干燥。
3初染:
将涂片放入平皿内,片上放两层滤纸,滴加足量的5.0%孔雀绿水溶液。
将平皿盖好,放54℃~56℃条件下,加热30min。
4水洗:
去除滤纸,用自来水冲洗残留孔雀绿溶液。
5复染:
用0.5%番红水溶液复染1min。
6水洗:
用流水洗后吸干。
7镜检:
待干燥后,直接用油镜观察。
8报告:
芽胞呈绿色,芽胞囊及营养体为红色。
注意接种环无菌操作,菌体量适中
注意玻片温度不能超过60℃
控制冲洗水流量,以免细菌被水冲掉
4.4定向生化实验
4.4.1氧化酶实验
4.4.1.1实验对象:
革兰氏阴性杆菌
4.4.1.2实验器具
4.4.1.2.1氧化酶试剂(梅里埃)
4.4.1.2.2无菌空平皿
4.4.1.2.3无菌竹签
4.4.1.2.4定性滤纸
4.4.1.2.5打孔器
4.4.1.3氧化酶实验过程
操作顺序
方法要点
1用打孔器将定性滤纸裁成直径约4-5mm的小圆片。
2滤纸片平摊在平皿内。
3用拇指和食指用力捏住氧化酶实验试剂的塑料瓶外侧,一次性将玻璃内管捏碎。
4每片滤纸上滴加1滴氧化酶实验试剂,润湿纸片。
5用无菌牙签从培养基上挑取单一菌落均匀涂在滤纸片上,在10∽30秒内颜色变为紫到深紫色为阳性,不变色或黄色为阴性反应。
6可用大肠杆菌作阴性对照,铜绿假单孢菌作阳性对照,进行控制实验。
不要反复挤捏,以免碎玻璃穿透塑料管扎破手指。
菌落需为新鲜培养物
超过30秒的变色反应视为阴性。
菌落pH值≥6.0,否则会出现假阴性。
4.4.2过氧化氢酶实验(接触酶实验)
4.4.2.1实验对象:
革兰氏阳性球菌
4.4.2.2实验用具
4.4.2.2.1无菌竹签
4.4.2.2.2载玻片
4.4.2.2.33%过氧化氢溶液
4.4.2.2.4滴管
4.4.2.2.5酒精灯
4.4.2.3过氧化氢酶实验过程
操作顺序
方法要点
1用无菌竹签挑取新鲜待检菌的纯菌苔置于洁净的载玻片上。
2向玻片上的菌落滴加3%的过氧化氢溶液1滴(或于琼脂培养物上直接滴加);
3立即观察结果,产生气泡为阳性反应,不产生气泡为阴性反应。
4可用铜绿假单胞菌作阴性对照,金黄色葡萄球菌作阳性对照,进行控制实验。
不要用铂金类接种环混合培养物和过氧化氢酶水溶液以免引起假阳性。
将过氧化氢溶液加到生长于血琼脂平板上的菌落时会产生假阳性结果。
必须将过氧化氢溶液滴到菌落上,操作顺序不能颠倒,否则会产生假阳性结果。
4.4.3OF实验(氧化发酵实验)
4.4.3.1实验对象:
过氧化氢酶实验阳性的革兰氏阳性球菌。
4.4.3.2实验用具
4.4.3.2.1接种针
4.4.3.2.2OF培养基
4.4.3.2.3具塞试管
4.4.3.2.4高压蒸汽灭菌锅
4.4.3.2.5恒温培养箱
4.4.3.2.6天平
4.4.3.2.7酒精灯
4.4.3.2.8无菌矿物油
4.4.3.3实验过程
操作顺序
方法要点
1用铂金针将琼脂培养基培养出来的单个纯菌落刺入OF培养基约1cm深,分别接种两个试管进行穿刺培养。
2向其中一支试管内加入无菌矿物油,覆盖在培养基表面约1cm高,作为发酵管(OF/F);
3另一支不加矿物油作为氧化管(OF/O)。
4将接种后培养基放入32℃±2℃的培养箱中培养2~14日。
5培养基变为黄色,反应结果记为阳性。
培养基不变色,反应结果记为阴性。
6可用铜绿假单胞菌作阴性对照,大肠杆菌作阳性对照,进行控制实验。
如果培养基的颜色变为蓝色,是由微生物产碱反应所致,记为阴性。
若为葡萄球菌,在APIStaph鉴定条上的LSTR栏记为阴性。
微生物利用葡萄糖的类型见下表。
氧化管
发酵管
微生物
属
+
-
氧化型
微球菌
+
+
发酵型
葡萄球菌
-
-
无作用
微球菌
4.4.4细菌运动性观察(MOB)
4.4.4.1实验对象:
API20E鉴定菌需做补充实验时。
4.4.4.2实验用具
4.4.4.2.1显微镜
4.4.4.2.2香柏油
4.4.4.2.3二甲苯
4.4.4.2.4载玻片
4.4.4.2.5盖波片
4.4.4.2.6擦镜纸酒精灯
4.4.4.2.7酒精灯
4.4.4.2.8接种环
4.4.4.2.9待测菌新鲜培养物
4.4.4.2.10滴管
4.4.4.2.11无菌纯水
4.4.4.3实验过程
操作顺序
方法要点
1载玻片上加一滴无菌水,用接种环挑取少许培养物至无菌水,制成菌悬液。
2菌悬液上加盖玻片。
3加一滴香柏油于集光器透镜顶端平面上,再将细菌水浸片放在镜台上,使玻片下表面与香柏油接触。
4拨动集光器转盘至“DF”档,用低倍镜对光,调节焦距至得到清晰的物像。
5低倍镜观察后,转动物镜转换器,换用高倍镜观察。
6细菌细胞间有明显位移才能判断为运动性。
需为新鲜培养物,制成幼龄菌悬液。
避免产生气泡。
目镜倍数不超过40倍。
细菌细胞的布朗运动是每个细胞在原地颤动,彼此位置关系没有改变,不要误判成具运动性。
4.5API鉴定实验
4.5.1芽孢杆菌鉴定实验
4.5.1.1实验对象:
产生内生孢子的直杆菌。
4.5.1.2纯化培养:
先将待同定菌在SA平板上划线分离,以检出菌时的培养温度来决定培养温度和时间。
类别
培养温度
培养时间
低温菌
20℃
48hr
中温菌
25∽45℃
16∽18hr
高温菌
55℃
12∽16hr
4.5.1.3实验用具
4.5.1.3.1恒温培养箱
4.5.1.3.2麦氏比浊管
4.5.1.3.3API50CHB鉴定条
4.5.1.3.4酒精灯
4.5.1.3.5具栓试管(无菌)
4.5.1.3.6涡旋震荡仪
4.5.1.3.7移液枪(1mL)
4.5.1.3.8无菌棉签
4.5.1.3.9接种环
4.5.1.3.10SA平板
4.5.1.3.11无菌纯水(新灭菌,不含CO2及Cl2等气体)
4.5.1.3.12滴管
4.5.1.3.131mL移液枪头(无菌)
4.5.1.3.14无菌生理盐水(新灭菌)
4.5.1.4培养液的调制
制作流程见“附件1:
芽孢菌培养液调制流程图”。
4.5.1.5接种及孵育
4.5.1.5.1用移液枪吸取10mL无菌纯水均匀的倒在培养盒底座的蜂窝小凹槽中,造成一个湿室。
蜂窝小凹槽
菌株标识处
4.5.1.5.2在底座的沿边写上菌株号。
4.5.1.5.3将鉴定条按顺序放到培养盒底座内。
4.5.1.5.4用1mL的无菌移液枪头移取培养液按顺序滴加到鉴定条小管内。
注意枪头的顶部靠在小管内缘加液体,以避免形成气泡。
加至小管满而管顶部的小杯空着。
小管
小杯
4.5.1.5.5盖上培养盒盖,于相应温度下孵育。
类别
孵育温度
孵育时间
结果判读时间
低温菌
20℃
96hr
培养48和96hr
中温菌
30℃或37℃
48hr
培养24和48hr
高温菌
55℃
24hr
培养24hr
4.5.1.6结果判读
4.5.1.6.1以位于第1的控制管为基准,颜色比控制管黄为阳性,红色为阴性。
4.5.1.6.2将判读结果输入APILABPLUS软件,得到同定结果。
每一个结果附有相应的ID%和T值
同定结果评价
%ID
T
极好的鉴定结果
≥99.9
≥0.75
非常好的鉴定结果
≥99.0
≥0.50
好的鉴定结果
≥90.0
≥0.25
可接受的鉴定结果
≥80.0
≥0
不可接受的鉴定结果
≥80.0
/
4.5.1.6.3如果同定结果为低分辨率的细菌,需添加补充实验。
4.5.1.6.4如果同定结果为有问题的生化谱,需从生化图谱的典型性、技术操作要领的执行、同定菌株纯度、试剂保存是否遵守要求等角度查找原因。
4.5.1.6.5不同时间判读的两次结果,以首次结果为准,如果首次结果得不到可接受的同定结果,再输入第二次判读数据以期得到可接受的同定结果;如果两次结果都不好,按4.5.1.6.4调查原因。
4.5.2葡萄球菌、微球菌鉴定实验
4.5.2.1实验对象:
革兰氏阳性和过氧化氢酶实验阳性的球菌。
4.5.2.2纯化培养:
将微生物在血琼脂平板上进行传代于36°C±2°C培养18-24小时。
确认菌株是革兰氏阳性、过氧化氢酶实验阳性的球菌。
4.5.2.3实验用具
4.5.2.3.1恒温培养箱
4.5.2.3.2麦氏比浊管
4.5.2.3.3APIStaph鉴定条
4.5.2.3.4酒精灯
4.5.2.3.5接种环
4.5.2.3.6涡旋震荡仪
4.5.2.3.7移液枪(1mL)
4.5.2.3.8血琼脂平板
4.5.2.3.91mL移液枪头(无菌)
4.5.2.3.10无菌纯水(新灭菌,不含CO2及Cl2等气体)
4.5.2.3.11无菌矿物油
4.5.2.4培养液的调制
打开一安瓿APIStaph培养基,在血琼脂平板上挑取2~6个单独菌落,制备浊度相等于0.5个麦氏单位的均匀的菌悬液。
4.5.2.5接种及孵育
4.5.2.5.1用移液枪吸取5mL无菌纯水均匀的倒在培养盒底座的蜂窝小凹槽中,造成一个湿室。
蜂窝小凹槽
菌株标识处
4.5.2.5.2在底座的沿边写上菌株号。
4.5.2.5.3将鉴定条放入培养盒底座,用1mL的无菌移液枪头移取培养液按顺序滴加到鉴定条小管内。
注意枪头的顶部靠在小管内缘加液体,以避免形成气泡。
加至小管满而管顶部的小杯空着。
4.5.2.5.4在试验ADH和URE小杯内加入矿物油形成新月形凸起以保证厌氧环境。
4.5.2.5.5盖上培养盒盖,于36°C±2°C孵育18-24小时。
4.5.2.6结果判读
4.5.2.6.1NIT实验:
各加一滴NIT1和NIT2试剂到NIT管内,等待10分钟出现红色为阳性反应。
4.5.2.6.2PAL实验:
各加一滴ZYMA和ZYMB试剂到PAL管内,等待10分钟出现紫红色为阳性反应。
4.5.2.6.3VP实验:
VP1和VP2试剂等待10分钟出现紫红-粉红色为阳性反应十分钟后颜色为浅粉色或亮粉色认为是阴性反应,粉红-紫红色是阳性反应。
4.5.2.6.4其他实验根据下表判读,结果记在记录纸上。
试验
有效成分
反应/酶
结果
阴性
阳性
0
没有底物
阴性控制
红色
—
GLU
FRU
MNE
MAL
LAC
TRE
MAN
XLT
MEL
D-葡萄糖
D-果糖
D-甘露糖
D-麦芽糖
D-乳糖(牛源的)
D-海藻糖
D-甘露醇
木糖醇
D-蜜二糖
阳性控制(D-GLUcose)
产酸(D-果糖)
产酸(D-甘露糖)
产酸(麦芽糖)
产酸(乳糖)
产酸(D-海藻糖)
产酸(D-甘露醇)
产酸(木糖醇)
产酸(D-蜜二糖)
红色
黄色
NIT
硝酸钾
硝酸盐还原为亚硝酸盐
NIT1+NIT2/10分钟
亮粉色红色
PAL
ß-萘基硝酸盐
碱性磷酸酶
ZYMA+ZYMB/10分钟
黄色紫红色
VP
丙酮酸钠
乙酰-甲基-甲醇产生
VP1+VP2/10分钟
无色-亮粉色紫红-粉红色
RAF
XYL
SACMDGNAG
D-棉子糖
D-木糖
D-蔗糖
甲基-aD-葡萄糖甙
N-乙酰-葡萄糖胺
产酸(棉子糖)
产酸(木糖)
产酸(蔗糖)
产酸(甲基-aD-葡萄糖甙)
产酸(N-乙酰-葡萄糖胺)
红色
黄色
ADH
L-精氨酸
精氨酸双水解酶
黄色
橙色-红色
URE
尿素
脲酶
黄色
红色-紫红色
4.5.2.6.5LSTR实验:
以OF实验为准:
若OF实验结果为发酵型,LSTR记为阴性;若OF实验结果为氧化型或无作用,LSTR记为阳性。
4.5.2.6.6注意事项:
产酸反应应与阴性对照(0)和阳性对照(GLU)相比较;当MNE和XLT过早或过晚出现阳性结果时应将橙色结果视为阴性反应。
4.5.2.6.7根据4.5.1.6.2-4.5.1.6.4步骤,得到同定结果。
4.5.3革兰氏阴性非发酵杆菌鉴定实验
4.5.3.1实验对象:
革兰氏阴性无内生孢子、氧化酶实验阳性杆菌。
4.5.3.2纯化培养:
先将待同定菌在SA平板上划线分离,29±2℃培养18-24小时。
4.5.3.3实验用具
4.5.3.3.1恒温培养箱
4.5.3.3.2麦氏比浊管
4.5.3.3.3API20NE鉴定条
4.5.3.3.4酒精灯
4.5.3.3.5无菌生理盐水(新灭菌)
4.5.3.3.6具栓试管
4.5.3.3.7涡旋震荡仪
4.5.3.3.8移液枪(1mL)
4.5.3.3.9无菌移液枪头(1mL)
4.5.3.3.10SA平板
4.5.3.3.11接种环
4.5.3.3.12无菌纯水(新灭菌,不含CO2及Cl2等气体)
4.5.3.3.13氧化酶实验试剂(BD生产)
4.5.3.3.14定性滤纸
4.5.3.3.15打孔器
4.5.3.3.16无菌竹制牙签
4.5.3.3.17一次性平皿
4.5.3.3.18矿物油(bioMerieux生产)
4.5.3.3.19NIT1+NIT2试剂(bioMerieux生产)
4.5.3.3.20锌粉(bioMerieux生产)
4.5.3.3.21VP1+VP2试剂(bioMerieux生产)
4.5.3.4培养液调制
详见“附件2API20NE培养液调制流程图”。
4.5.3.5接种及孵育
4.5.3.5.1用移液枪吸取5mL无菌纯水均匀的倒在培养盒底座的蜂窝小凹槽中,造成一个湿室。
4.5.3.5.2在底座的沿边写上菌株号。
4.5.3.5.3将鉴定条放到培养盒底座内。
4.5.3.5.4用1mL的无菌移液枪头移取培养液1按顺序滴加,从NO3到PNPG8个鉴定条小管内。
注意枪头的顶部靠在小管内缘加液体,以避免形成气泡。
加至小管满而管顶部的小杯空着。
3个划线的实验(GLU、ADH、URE)用矿物油覆盖,直至凸出的新月形成。
4.5.3.5.5换用新的无菌枪头移取培养液2注满后面12个小管及小杯(GLU至PAC),杯的表面液面必须平或稍凸,不能内凹成新月形,否则将影响结果。
4.5.3.5.6盖上培养盒盖,于29±2℃温度下培养24±2小时。
4.5.3.6结果判读
4.5.3.6.1NO3实验
各加1滴NIT1和NIT2试剂到NO3管内,5分钟后红色表示阳性反应,记录于报告单。
若溶液未变色,加2∽3mg锌粉,5分钟后颜色变为粉红色是阴性,不变色为阳性。
4.5.3.6.2TRP实验
各加1滴VP1和VP2试剂到TRP管内,立即发生反应,全管粉红色表明阳性结果,记录于报告单上。
4.5.3.6.3培养24±2小时后,根据结果判读表判读各反应结果,记录在结果报告单上。
实验
有效成分
反应/酶
结果
阴性
阳性
NO3
KNO3
硝酸盐还原到亚硝酸盐
NO3→NO2
NIT1+NIT2/5分钟
无色粉红/红色
硝酸盐还原到氮
NO3→N2
Zn/5分钟
粉红色无色
TRP
色氨酸
吲哚
VP1+VP2/立即
无色/浅绿/黄色粉红
GLE
葡萄糖
酸化
蓝或绿
黄色
ADH
精氨酸
精氨酸双水解酶
黄色
橙/粉红/红
URE
脲素
脲酶
黄色
橙/粉红/红
ESC
七叶灵
水解(-葡萄糖甙酶)
黄色
灰/棕/黑色
GEL
明胶
水解(蛋白酶)
无色素扩散
黑色素扩散
PNPG
对硝基-D甲级半乳糖
-半乳糖甙酶
无色
黄色
GLU
葡萄糖
同化
透明
不透明
ARA
阿拉伯糖
同化
透明
不透明
MNE
甘露糖
同化
透明
不透明
MAN
甘露醇
同化
透明
不透明
NAG
N-乙酰-葡萄糖胺
同化
透明
不透明
MAL
麦芽糖
同化
透明
不透明
GNT
葡萄糖酸盐
同化
透明
不透明
CAP
葵酸
同化
透明
不透明
ADI
已二酸
同化
透明
不透明
MLT
苹果酸
同化
透明
不透明
CIT
柠檬酸
同化
透明
不透明
PAC
苯乙酸
同化
透明
不透明
OX
-
细胞色素氧化酶
详见4.4.1.3
4.5.3.6.4将判读结果输入APILABPLUS软件,得到同定结果。
每一个结果附有相应的ID%和T值
4.5.3.6.5如果结果是“培养不足48小时,鉴定结果不可靠”,需立即用吸管吸走NIT1,NIT2,VP1,VP2试剂并用矿物油覆盖NO3和TRP管,使成凸的新月形。
于29±2℃再培养24小时,除前3管应在24小时观察结果之外,其余实验再读一次结果,重新输入APILABPLUS软件得到48小时同定结果。
4.5.3.6.6如果同定结果为低分辨率的细菌,需添加补充实验,补充实验项目根据软件结果确定。
4.5.4肠杆菌和其他非苛养革兰阴性杆菌鉴定实验
4.5.4.1实验对象:
革兰氏阴性无内生孢子、氧化酶实验阴性杆菌。
4.5.4.2纯化培养:
先将待同定菌在SA平板上划线分离,36±2℃培养18-24小时。
4.5.4.3实验用具
4.5.4.3.1恒温培养箱
4.5.4.3.2VP1+VP2试剂(bioMerieux生产)
4.5.4.3.3JAMES(bioMerieux生产)
4.5.4.3.4TDA试剂(bioMerieux生产)
4.5.4.3.5矿物油(bioMerieux生产)
4.5.4.3.6API20E鉴定条
4.5.4.3.7涡旋震荡仪
4.5.4.3.8移液枪(1mL)
4.5.4.3.9无菌移液枪头(1mL)
4.5.4.3.10SA平板
4.5.4.3.11接种环
4.5.4.3.12无菌纯水(新灭菌,不含CO2及Cl2等气体)
4.5.4.3.13氧化酶实验试剂(BD生产)
4.5.4.3.14定性滤纸
4.5.4.3.15打孔器
4.5.4.3.16无菌竹制牙签
4.5.4.3.17一次性平皿
4.5.4.3.18酒精灯
4.5.4.3.19无菌生理盐水(新灭菌)
4.5.4.4培养液调制
打开一安瓿API20E培养基,在SA平板上挑取单个分纯菌落放入培养基,震荡均匀。
4.5.4.5接种及孵育
4.5.4.5.1用移液枪吸取5mL无菌纯水均匀的倒在培养盒底座的蜂窝小凹槽中,造成一个湿室。
4.5.4.5.2在底座的沿边写上菌株号。
4.5.4.5.3将鉴定条放到培养盒底座内。
4.5.4.5.4用1mL的无菌移液枪头移取培养液按顺序滴加,注意枪头的顶部靠在小管内缘加液体,以避免形成气泡,加至小管满而管顶部的小杯空着;CIT、VP和GEL实验填满管部和杯部;ADH、LDC、ODC、H2S和URE实验用矿物油覆盖,以形成厌氧环境。
4.5.4.5.5盖好培养盒盖,于36±2℃孵育18-24小时。
4.5.4.6结果判读
4.5.4.6.1TDA实验:
加一滴TDA试剂。
深褐色为阳性反应,记录于报告单上。
4.5.4.6.2IND实验:
加一滴JAMES试剂,整个反应杯呈粉红色为阳性,记录于报告
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