第二节 化妆品毒理学检测方法.docx
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第二节化妆品毒理学检测方法
第二节化妆品毒理学检测方法
一、总则
GeneralPrinciples
1范围
本规范规定了化妆品原料及其产品安全性评价的毒理学检测要求。
2化妆品原料的检测
化妆品的新原料,一般需进行下列毒理学试验:
1)急性经口和急性经皮毒性试验;
2)皮肤和急性眼刺激性/腐蚀性试验;
3)皮肤变态反应试验;
4)皮肤光毒性和光敏感试验*(原料具有紫外线吸收特性需做该项试验);
5)致突变试验(至少应包括一项基因突变试验和一项染色体畸变试验);
6)亚慢性经口和经皮毒性试验;
7)致畸试验;
8)慢性毒性/致癌性结合试验;
9)毒物代谢及动力学试验*;
10)根据原料的特性和用途,还可考虑其它必要的试验。
如果该新原料与已用于化妆品的原料化学结构及特性相似,则可考虑减少某些试验。
*试验方法参照GB7919-87化妆品安全性评价程序和方法;OECD化学物质试验指南(OECDGuidelinesforTestingofChemicals)。
3化妆品产品的检测
1)检测项目
在一般情况下,新开发的化妆品产品在投放市场前,应根据产品的用途和类别进行相应
的试验,以评价其安全性。
2)检测项目的选择原则
由于化妆品种类繁多,在选择试验项目时应根据实际情况确定。
3)每天使用的化妆品需进行多次皮肤刺激性试验,进行多次皮肤刺激性试验者不再进行急性皮肤刺激性试验,间隔数日使用的和用后冲洗的化妆品进行急性皮肤刺激性试验。
4)与眼接触可能性小的产品不需进行急性眼刺激性试验。
二、毒理学方法的原理与方法基础
香波是一种主要的发用化妆品,其发展已有较长的历史。
三、急性经皮毒性试验
AcuteDermalToxicityTest
1范围
本规范规定了动物急性皮肤毒性试验的基本原则、要求和方法。
本规范适用于化妆品原料安全性毒理学检测。
2规范性引用文件
OECDGuidelinesforTestingofChemicals(No.402,Feb.1987)
USEPAOPPTSHarmonizedTestGuidelines(Series870.1200,Aug.1998)
3试验目的
急性皮肤毒性试验可确定受试物能否经皮肤吸收和短期作用所产生的毒性反应,可为化妆品原料毒性分级和标签标识以及确定亚慢性毒性试验和其它毒理学试验剂量提供依据。
4定义
1)急性皮肤毒性(Acutedermaltoxicity):
经皮一次涂敷受试物后,动物在短期内出现的健康损害效应。
2)经皮LD50(半数致死量,Mediumlethaldose):
经皮一次涂敷受试物后,引起实验动物
总体中半数死亡的毒物的统计学剂量。
以单位体重涂敷受试物的重量(mg/kg或g/kg)来表
示。
5试验的基本原则
受试物以不同剂量经皮给予各组实验动物,每组用一个剂量。
染毒后观察动物的毒性反
应和死亡情况。
试验期间死亡的动物要进行尸检,试验结束时仍存活的动物要处死并进行尸
检。
若已知受试物具有腐蚀性或强刺激性可不进行急性经皮毒性试验。
6试验方法
1)受试物
液体受试物一般不需稀释。
若受试物为固体,应研磨成细粉状,并用适量水或无毒、无
刺激性、不影响受试物穿透皮肤、不与受试物反应的介质混匀,以保证受试物与皮肤有良好
的接触。
常用的介质有橄榄油、羊毛脂、凡士林等。
2)实验动物和饲养环境
可选用健康成年大鼠、家兔或豚鼠作为实验动物,也可使用其它种属动物进行试验。
使用雌性动物应是未孕和未曾产仔的。
建议实验动物体重范围为:
大鼠200g~300g;家兔2kg~3kg;豚鼠350g~450g。
实验动物皮肤应健康无破损。
试验前动物要在实验动物房环境中至少适应3d~5d时间。
实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。
选用常规饲料,饮水不限制。
3)剂量水平
根据所选用的方法要求,原则上应设4~6个剂量组,每组动物一般为10只,雌雄各半。
各剂量组间距大小以兼顾产生毒性大小和死亡为宜,通常以较大组距和较少量动物进行预试。
如果受试物毒性很低,可采用一次限量法,即用10只动物(雌雄各半)皮肤涂抹2000mg/kg体重剂量,当未引起动物死亡,可考虑不再进行多个剂量的急性经皮毒性试验。
4)试验步骤
①试验开始前24h,剪去或剃除动物躯干背部拟染毒区域的被毛,去毛时应非常小心,不要损伤皮肤以免影响皮肤的通透性。
涂皮面积约占动物体表面积的10%,应根据动物体重确定涂皮面积。
体重为200g~300g的大鼠约为30cm2~40cm2,体重为2kg~3kg的家兔约为160cm2~210cm2,体重为350g~450g的豚鼠约为46cm2~54cm2。
②将受试物均匀涂敷于动物背部皮肤染毒区,然后用一层薄胶片覆盖,无刺激胶布固定,防止动物舔食。
若受试物毒性较高,可减少涂敷面积,但涂敷仍需尽可能薄而均匀。
一般封闭接触24h。
③染毒结束后,应使用水或其它适宜的溶液清除残留受试物。
④观察期限一般不超过14d,但要视动物中毒反应的严重程度、症状出现快慢和恢复期长短而定。
若有延迟死亡迹象,可考虑延长观察时间。
⑤对每只动物都应有单独全面的记录,染毒第1d要定时观察实验动物的中毒表现和死亡情况,其后至少每天进行一次仔细的检查。
包括被毛和皮肤、眼睛和粘膜以及呼吸、循环、自主神经和中枢神经系统、肢体运动和行为活动等的改变。
特别注意观察动物是否出现震颤、抽搐、流涎、腹泻、嗜睡、和昏迷等症状。
死亡时间的记录应尽可能准确。
观察期内存活动物每周称重、观察期结束存活动物应称重,处死后进行尸检。
⑥对实验动物进行大体解剖学检查,并记录全部大体病理改变。
对死亡和存活24h和24h以上动物并存在大体病理改变的器官应进行病理组织学检查。
⑦可采用多种方法测定LD50,建议采用霍恩氏法、上-下法、概率单位-对数图解法和寇氏法等。
5)试验结果评价
评价试验结果时,应将经皮LD50与观察到的毒性效应和尸检所见相结合考虑,LD50值是受试物毒性分级和标签标识以及判定受试物经皮肤吸收后引起动物死亡可能性大小的依据。
引用LD50值时一定要注明所用实验动物的种属、性别、染毒途径、观察期限等。
评价应包括动物接触受试物与动物异常表现(包括行为和临床改变、大体损伤、体重变化、致死效应及其它毒性作用)的发生率和严重程度之间的关系。
毒性分级见表1。
7试验报告
试验报告应包括如下内容:
1)受试物名称、理化性状、配制方法、所用浓度;
2)实验动物的种属、品系和来源(注明合格证号和动物级别);
3)实验动物饲养环境,包括饲料来源、室温、相对湿度、实验动物房合格证号;
4)所用剂量和动物分组,每组所用动物性别、数量及体重范围;
5)染毒后动物中毒表现和死亡情况及出现时间,大体解剖及病理所见;
6)计算LD50的方法;
7)列表报告结果和计算LD50及其95%可信区间(建议的表格形式见表2);
8)结论。
8试验结果的解释
急性经皮毒性试验研究和经皮LD50的确定提供了受试物经皮染毒的毒性。
其结果外推到人类的有效性很有限。
急性经皮毒性试验的结果应与经其它途径染毒的急性毒性试验结果
相结合进行综合评价。
四、眼刺激性实验
AcuteEyeIrritation/CorrosionTest
1范围
本规范规定了动物急性眼刺激性或腐蚀性试验的基本原则、要求和方法。
本规范适用于化妆品原料及其产品安全性毒理学检测。
2规范性引用文件
OECDGuidelinesforTestingofChemicals(No405,April2002)
USEPAOPPTSHarmonizedTestGuidelines(Series870.2400,Aug.1998)
3试验目的
确定和评价化妆品原料及其产品对哺乳动物的眼睛是否有刺激作用或腐蚀作用及其程度。
4定义
1)眼睛刺激性(Eyeirritation):
眼球表面接触受试物后所产生的可逆性炎性变化。
2)眼睛腐蚀性(Eyecorrosion):
眼球表面接触受试物后引起的不可逆性组织损伤。
5试验的基本原则
受试物以一次剂量滴入每只实验动物的一侧眼睛结膜囊内,以未作处理的另一侧眼睛作为自身对照。
在规定的时间间隔内,观察对动物眼睛的刺激和腐蚀作用程度并评分,以此评价受试物对眼睛的刺激作用。
观察期限应能足以评价刺激效应的可逆性或不可逆性。
动物如果在试验的任何阶段出现严重抑郁、痛苦的表现,则应该给予人道地处死,依据试验情况对受试物进行适当评价。
动物如出现角膜穿孔、角膜溃疡、角膜4分超过48h、缺乏光反射超过72h、结膜溃疡、坏疽、腐烂等情况,通常为不可逆损伤的症状,也应该给予
人道地处死。
6试验方法
1)受试物
液体受试物一般不需稀释,可直接使用原液,染毒量为0.1mL。
若受试物为固体或颗粒状,应将其研磨成细粉状,染毒量应为体积0.1mL或重量不大于100mg(染毒量应进行记录)。
受试物为强酸或强碱(pH值≤2或≥11.5),或已证实对皮肤有腐蚀性或强刺激性时,可以不再进行眼刺激性试验。
气溶胶产品需喷至容器中,收集其液体再使用。
2)实验动物和饲养环境
首选健康成年白色家兔。
至少使用3只家兔。
试验前动物要在实验动物房环境中至少适应3d时间。
在试验开始前的24h内要对试验动物的两只眼睛进行检查(包括使用荧光素钠检查)。
有眼睛刺激症状、角膜缺陷和结膜损伤的动物不能用于试验。
实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。
选用常规饲料,饮水不限制。
3)试验步骤
①轻轻拉开家兔一侧眼睛的下眼睑,将受试物0.1mL(100mg)滴入(或涂入)结膜囊中,使上、下眼睑被动闭合1s,以防止受试物丢失。
另一侧眼睛不处理作自身对照。
滴入受试物后24h内不冲洗眼睛。
若认为必要,在24h时可进行冲洗。
②若上述试验结果显示受试物有刺激性,需另选用3只家兔进行冲洗效果试验,即给家兔眼滴入受试物后30s,用足量、流速较快但又不会引起动物眼损伤的水流冲洗至少30s。
③临床检查和评分:
在滴入受试物后1、24、48、72h以及第4d和第7d对动物眼睛进行检查。
如果72h未出现刺激反应,即可终止试验。
如果发现累及角膜或有其它眼刺激作用,7d内不恢复者,为确定该损害的可逆性或不可逆性需延长观察时间,一般不超过21d,并提供第7d、14d、21d的观察报告。
除了对角膜、虹膜、结膜进行观察外,其它损害效应均应当记录并报告。
在每次检查中均应按表1眼损害的评分标准记录眼刺激反应的积分。
可使用放大镜、手持裂隙灯、生物显微镜或其它适用的仪器设备进行眼刺激反应检查。
在24h观察和记录结束之后,对所有动物的眼睛应用荧光素钠作进一步检查。
④对用后冲洗的产品(如洗面奶、发用品、育发冲洗类等)只做30s冲洗试验,即滴入受试物后,眼闭合1s,至第30s时用足量、流速较快但又不会引起动物眼损伤的水流冲洗30s,然后按③进行检查和评分。
⑤对染发剂类产品,只做4s冲洗试验,即滴入受试物后,眼闭合1s,至第4s时用足量、流速较快但又不会引起动物眼损伤的水流冲洗30s,然后按6.3.3进行检查和评分。
7结果评价
化妆品原料——以给受试物后动物角膜、虹膜或结膜各自在24、48和72h观察时点的刺激反应积分的均值和恢复时间评价,按表2眼刺激反应分级判定受试物对眼的刺激强度。
8试验报告
试验报告应包括如下内容:
1)受试物名称、理化性状、配制方法和用量,必要时说明受试物的pH值;
2)实验动物的种属、品系和来源(注明合格证号和动物级别);
3)实验动物饲养环境,包括饲料来源、室温、相对湿度、实验动物房合格证号;
4)列表显示每只动物在每一观察时点(如染毒1,24,48和72h)的刺激反应(建议的表格形式见表4),将实验条件不冲洗和30秒冲洗或4秒冲洗的结果分别列表;
5)具体描述除眼部以外的其它作用;
6)描述在各观察时点积分时的检查方法(如手持裂隙灯、用荧光素钠);
7)结论。
9试验结果的解释
急性眼刺激性试验结果从动物外推到人的可靠性很有限。
白色家兔在大多数情况下对有刺激性或腐蚀性的物质较人类敏感。
若用其它品系动物进行试验时也得到类似结果,则会增加从动物外推到人的可靠性。
五、皮肤变态反应试验与光毒性试验
SkinSensitisationTest
1范围
本规范规定了动物皮肤变态反应试验的基本原则、要求和方法。
本规范适用于化妆品原料及其产品安全性毒理学检测。
2规范性引用文件
OECDGuidelinesforTestingofChemicals(No406,July1992)
USEPAOPPTSHarmonizedTestGuidelines(Series870.2600,Aug.1998)
3试验目的
确定重复接触化妆品及其原料对哺乳动物是否可引起变态反应及其程度。
4定义
(1)皮肤变态反应(过敏性接触性皮炎)(Skinsensitization,allergiccontactdermatitis)是皮肤对一种物质产生的免疫源性皮肤反应。
在人类这种反应可能以瘙痒、红斑、丘疹、水疱、融合水疱为特征。
动物的反应不同,可能只见到皮肤红斑和水肿。
(2)诱导接触(Inductionexposure)
指机体通过接触受试物而诱导出过敏状态的试验性暴露。
(3)诱导阶段(Inductionperiod)
指机体通过接触受试物而诱导出过敏状态所需的时间,一般至少一周。
(4)激发接触(Challengeexposure)
机体接受诱导暴露后,再次接触受试物的试验性暴露,以确定皮肤是否会出现过敏反应。
5试验的基本原则
实验动物通过多次皮肤涂抹(诱导接触)或皮内注射受试物10d~14d(诱导阶段)后,给予激发剂量的受试物,观察实验动物并与对照动物比较对激发接触受试物的皮肤反应强
度。
(1)实验动物和饲养环境
一般选用健康、成年雄性或雌性豚鼠,雌性动物应选用未孕或未曾产仔的。
实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。
选用常规饲料,饮水不限制,需注意补充适量Vc。
(2)动物试验前准备
试验前动物要在实验动物房环境中至少适应3d~5d时间。
将动物随机分为受试物组和对照组,按所选用的试验方法,选择适当部位给动物备皮(去毛),避免损伤皮肤。
试验开始和结束时应记录动物体重。
(3)无论在诱导阶段或激发阶段均应对动物进行全面观察包括全身反应和局部反应,并作完整记录。
(4)试验方法可靠性的检查
使用已知的能引起轻度/中度致敏的阳性物每隔半年检查一次。
局部封闭涂皮法至少有30%动物出现皮肤过敏反应;皮内注射法至少有60%动物出现皮肤过敏反应。
阳性物一般采用2,4-二硝基氯代苯,肉桂醛,2-巯基苯并噻唑或对氨基苯酸乙酯。
6试验方法
(1)局部封闭涂皮试验(BuehlerTest,BT)
a)动物数
试验组至少20只,对照组至少10只。
b)剂量水平
诱导接触受试物浓度为能引起皮肤轻度刺激反应的最高浓度,激发接触受试物浓度为不能引起皮肤刺激反应的最高浓度。
试验浓度水平可以通过少量动物(2~3只)的预试验获得。
水溶性受试物可用水或用无刺激性表面活性剂作为赋形剂,其它受试物可用80%乙醇(诱导接触)或丙酮(激发接触)作赋形剂。
c)试验步骤
1)试验前约24h,将豚鼠背部左侧去毛,去毛范围为4cm2~6cm2。
)
2)诱导接触:
将受试物约0.2mL(g)涂在实验动物去毛区皮肤上,以二层纱布和一层玻璃纸覆盖,再以无刺激胶布封闭固定6h。
第7d和第14d以同样方法重复一次。
3)激发接触:
末次诱导后14d~28d,将约0.2mL的受试物涂于豚鼠背部右侧2cm×2cm
去毛区(接触前24h脱毛),然后用二层纱布和一层玻璃纸覆盖,再以无刺激胶布固定6h。
4)激发接触后24h和48h观察皮肤反应,按表1评分。
5)试验中需设阴性对照组,使用6.1.3.2和6.1.3.3的方法,在诱导接触时仅涂以溶剂作为对照,在激发接触时涂以受试物。
对照组动物必须和受试物组动物为同一批。
在实验室开展变态反应试验初期,或使用新的动物种属或品系时,需同时设阳性对照组。
d)结果评价
1)当受试物组动物出现皮肤反应积分≥2时,判为该动物出现皮肤变态反应阳性,按表3判定受试物的致敏强度。
2)如激发接触所得结果仍不能确定,应于第一次激发后一周,给予第二次激发,对照组作同步处理或按6.2的方法进行评价。
(2)豚鼠最大值试验(GuineaPigMaximinatimTest,GPMT)采用完全福氏佐剂(FreundCompleteAdjvant,FCA)皮内注射方法检测致敏的可能性。
a)动物数
试验组至少用10只,对照组至少5只。
如果试验结果难以确定受试物的致敏性,应增加动物数,试验组20只,对照组10只。
b)剂量水平
诱导接触受试物浓度为能引起皮肤轻度刺激反应的最高浓度,激发接触受试物浓度为不能引起皮肤刺激反应的最高浓度。
试验浓度水平可以通过少量动物(2~3只)的预试验获得。
c)试验步骤
1)诱导接触(第0d)
受试物组:
将颈背部去毛区(2cm×4cm)中线两侧划定三个对称点,每点皮内注射0.1mL下述溶液。
第1点1:
1(v/v)FCA/水或生理盐水的混合物。
第2点耐受浓度的受试物。
第3点用1:
1(v/v)FCA/水或生理盐水配制的受试物,浓度与第2点相同。
对照组:
注射部位同受试物组。
第1点1:
1(v/v)FCA/水或生理盐水的混合物。
第2点未稀释的溶剂。
第3点用1:
1(v/v)FCA/水或生理盐水配制的浓度为50%(w/v)的溶剂。
2)诱导接触(第0d):
将涂有0.5g(mL)受试物的2cm×4cm滤纸敷贴在上述再次去毛的注射部位,然后用两层纱布,一层玻璃纸覆盖,无刺激胶布封闭固定48h。
对无皮肤刺激作用的受试物,可加强致敏,于第二次诱导接触前24h在注射部位涂抹10%十二烷基硫酸钠(SLS)0.5mL。
对照组仅用溶剂作诱导处理。
3)激发接触(第21d)
将豚鼠躯干部去毛,用涂有0.5g(mL)受试物的2cm×2cm滤纸片敷贴在去毛区,然后再用两层纱布,一层玻璃纸覆盖,无刺激胶布封闭固定24h。
对照组动物作同样处理。
如激发接触所得结果不能确定,可在第一次激发接触一周后进行第二次激发接触。
对照组作同步处理。
d)观察及结果评价
激发接触结束,除去涂有受试物的滤纸后24、48和72h,观察皮肤反应(如需要清除受试残留物可用水或选用不改变皮肤已有反应和不损伤皮肤的溶剂),按表2评分。
当受试物组动物皮肤反应积分≥1时,应判为变态反应阳性,按表3对受试物进行致敏强度分级。
表
7试验报告
报告应包括如下内容:
(1)受试物名称、理化性状、配制方法、所用浓度;
(2)实验动物的种属、品系、来源(注明合格证号和动物级别)、性别、数量;
(3)实验动物饲养环境,包括饲料来源、室温、相对湿度、实验动物房合格证号;
(4)试验方法;
(5)试验开始和结束时动物体重;
(6)结果:
以表格形式报告各组动物皮肤反应情况和致敏率等(建议的表格形式见表4
和表5);
(7)结论。
8试验结果的解释
试验结果应能得出受试物的致敏能力和强度。
这些结果只能在很有限的范围内外推到人类。
引起豚鼠强烈反应的物质在人群中也可能引起一定程度的变态反应,而引起豚鼠较弱反应的物质在人群中也许不能引起变态反应。
七、皮肤光毒性试验
SkinPhototoxicityTest
1范围
本规范规定了皮肤光毒性试验的基本原则,要求和方法。
本规范适用于化妆品原料及其产品安全性毒理学检测。
2试验目的
评价化妆品原料及其产品引起皮肤光毒性的可能性。
3定义
光毒性(Phototoxicity):
皮肤一次接触化学物质后,继而暴露于紫外线照射下所引发的一种皮肤毒性反应,或者全身应用化学物质后,暴露于紫外线照射下发生的类似反应。
4试验的基本原则
将一定量受试物涂抹在动物背部去毛的皮肤上,经一定时间间隔后暴露于UVA光线下,观察受试动物皮肤反应并确定该受试物有否光毒性。
5试验方法
(1)受试物
液体受试物一般不用稀释,可直接使用原液。
若受试物为固体,应将其研磨成细粉状并用水或其它溶剂充分湿润,在使用溶剂时,应考虑到溶剂对受试动物皮肤刺激性的影响。
对于化妆品产品而言,一般使用原霜或原液。
阳性对照物选用8-甲氧基补骨脂
(8-methoxypsoralen,8-Mop)。
(2)实验动物和饲养条件
使用成年白色家兔或白化豚鼠,尽可能雌雄各半。
选用6只动物进行正式试验。
试验前动物要在实验动物房环境中至少适应3d~5d时间。
实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。
选用常规饲料,饮水不限制,需注意补充适量Vc。
(3)UV光源
a)UV光源:
波长为320nm~400nm的UVA,如含有UVB,其剂量不得超过0.1J/cm2。
b)强度的测定:
用前需用辐射计量仪在实验动物背部照射区设6个点测定光强度(mW/cm2),以平均值计。
c)照射时间的计算:
照射剂量为10J/cm2,按下式计算照射时间。
(4)试验步骤
a)进行正式光毒试验前18h~24h,将动物脊柱两侧皮肤去毛,试验部位皮肤需完好,无损伤及异常。
备4块去毛区(见图1),每块去毛面积约为2cm×2cm。
b)将动物固定,按表1所示,在动物去毛区1和2涂敷0.2mL(g)受试物。
所用受试物浓度不能引起皮肤刺激反应(可通过预试验确定),30min后,左侧(去毛区1和3)用铝箔复盖,胶带固定,右侧用UVA进行照射。
c)结束后分别于1、24、48和72h观察皮肤反应,根据表2判定每只动物皮肤反应评分。
d)为保证试验方法的可靠性,至少每半年用阳性对照物检查一次。
即在去毛区1和2涂阳性对照物,方法同5.4.2。
表1
6结果评价
单纯涂受试物而未经照射区域未出现皮肤反应,而涂受试物后经照射的区域出现皮肤反应分值之和为2或2以上的动物数为1只或1只以上时,判为受试物具有光毒性。
7试验报告
报告应包括下列内容:
(1)受试物名称、理化性状、配制方法、所用浓度;
(2)动物种属、品系、性别、体重、来源(注明合格证号和动物级别);
(3)实验动物饲养环境,包括饲料来源、室温、相对湿度、实验动物房合格证号;
(4)光源的生产厂、规格;
(5)光强度和照射时间以及试验方法;
(6)结果:
以列表方式报告动物出现皮肤反应的积分(见表3和表4);
(7)结论。
表
3
第三节人体安全性评价方法
一、总则
Generalprinciples
1范围
本规范规定了化妆品安全性和功效评价的人体检验项目和要求。
本规范适用于化妆品终产品的人体安全性和功效性评价。
2化妆品人体检验的基本原则
(1)选择适当的受试人群,并具有一定例数。
(2)化妆品人体检验之前应先完成必要的毒理学检验并出具书面证明,毒理学试验不合格的样品不再进行人体检验。
(3)化妆品人体斑贴试验适用于检验防晒类、祛斑类和除臭类化妆品。
(4)化妆品人体安全性检验适用于检验健美类、美乳类、育发类、脱毛类
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