蛋白质中二硫键的定位及其质谱分析解析.docx
- 文档编号:28277985
- 上传时间:2023-07-10
- 格式:DOCX
- 页数:36
- 大小:41.24KB
蛋白质中二硫键的定位及其质谱分析解析.docx
《蛋白质中二硫键的定位及其质谱分析解析.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《蛋白质中二硫键的定位及其质谱分析解析.docx(36页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
蛋白质中二硫键的定位及其质谱分析解析
第20卷第6期2008年6月
化
学进展
PROGRESSINCHEMISTRY
V01.20No.6June,2008
蛋白质中二硫键的定位及其质谱分析*
仇晓燕1’2
崔
勐1
(1.中国科学院长春应用化学研究所长春质谱中心
刘志强1
刘淑莹H‘
长春130022;2.中国科学院研究生院
北京100039)
摘
要
二硫键是一种常见的蛋白质翻译后修饰,对稳定蛋白质的空间结构,保持及调节其生物活性有
着非常重要的作用。
因此,确定二硫键在蛋白质中的位置是全面了解含二硫键蛋白化学结构的重要方面。
在众多实验方法中,现代质谱技术因其操作简单、快速、灵敏等优点而成为分析二硫键的重要手段。
本文介绍了目前主要的定位二硫键的方法以及质谱在二硫键定位分析中的应用与进展。
关键词
二硫键定位质谱串联质谱三羧乙基膦稳定同位素标记
中图分类号:
0657.63;Q51
文献标识码:
A文章编号:
1005.281X(2008)06.0975—09
ProteinDisulfideBondDeterminationandItsAnalysisbyMassSpectrometry
Qiu
Xiaoyanl'2
CuiMen91Liu劢iqian91LiuShu乒n91‘‘
(1.ChangchunCenterofMassSpectrometry,ChangchunInstituteofAppliedChemistry,ChineseAcademyofSciences,
Changchun130022,China;2.GraduateSchooloftheChineseAcademyof
Sciences,Beijing100039,China)
AbstractDisulfidebonds
areone
ofthemostcommoncovalentposttranslationalmodificationsofproteins.Theyplay
an
importantrole
in
maintaining
the
three-dimensionalstructures
ofproteins
and
theirbiological
activities.
Therefore.thedeterminationofdisulfidebondsbecomesanimportantaspectforobtaininga
comprehensiveunderstanding
ofthechemicalstructureof
a
protein.Numerousexperimentalmethodshavebeendevelopedforthe
determinationof
disulfidebondsinproteins.Modernmassspectrometryhasdevelopedas锄importanttoolfortheanalysisofdisulfidebondpatternsduetoits
advantagesofbeingsimple,rapidandsensitive.Someusefulmethodsforassignmentofdisulfide
bondsinproteins
are
introduced.thedevelopmentsandapplicationsofrnass
spectrometryinthis
areaare
reviewed.
Keywords
assignmentofdisulfidebond;lll越Sspectrometry;MS/MS;TCEP;stable
isotopelabeling
1
引言
二硫键广泛存在于原核和真核生物的激素、酶、
免疫球蛋白、血浆、抑制剂和毒液等蛋白质中,是一种常见的蛋白质翻译后修饰。
二硫键作为共价键交联多肽链内或链间的两个半胱氨酸,对稳定蛋白质的空间结构¨-5】、维持正确的折叠构象№’7]、保持及调节其生物活性¨-1训等都有着举足轻重的作用。
因此,确定二硫键在蛋白质中的位置对于鉴定蛋白质一级结构有着重要的意义,是研究含有二硫键结构的活性多肽/蛋白质化学结构的重要方面。
定位二
收稿:
2007年7月,收修改稿:
2007年9月
*国家自然科学基金项目(No.30672600,20675079)资助
**通讯联系人e.衄il:
syliul9@yahoo.tom.ca
硫键还将有助于我们进一步揭示蛋白的高级结构及其生物功能¨“,指导定向化学合成和审评基因工程重组蛋白的折叠¨2叫引,便于X射线晶体衍射法(x.
ray
crystallography)的三维结构研究¨纠以及为通过核
磁共振波谱法(NMR)正确解析溶液中的构象奠定基础㈨。
当蛋白质分子中存在二硫键时,在完成其氨基酸测序分析后,需要对二硫键的位置加以确定。
1955年Ryle等【17’坞3对胰岛素二硫键结构的分析是蛋白质化学研究史中的里程碑。
胰岛素分子的A、B两链通过两个链间二硫键连在一起,A链还有一个
化
学进展
第20卷
链内二硫键,而且包含一对邻位的半胱氨酸(Cys
A6,Cys
A7)。
1960年,Moore等¨引完成牛胰核糖核
酸酶(RNase)全序及二硫键分析。
该酶含有124个氨基酸,4个链内二硫键。
这些早期的研究确立了如今仍在使用的二硫键定位研究的基本思路,包括:
(1)将样品蛋白在避免二硫键重排或交换的条件下,尽可能地在其所有半胱氨酸残基之间断裂而形成二硫键相连的肽段;(2)分离这些肽段混合物;(3)鉴定分离所得的各个肽段;(4)断开肽段中的二硫键;(5)分析断开二硫键后的肽段,与整个氨基酸序列比较,推断二硫键的位置。
同时这些早期的研究也提供了很多相关实验条件的经验¨7_21|。
比如强酸的环境会促进二硫键的重排,在弱碱性条件下进行酶切时也会产生二硫键的交换,因此要小心地控制裂解实验条件。
后来又有许多关于二硫键在碱性pH条件下交换反应增强的报道m一划。
但是在酸性条件下蛋白构象趋于展开从而更容易在半胱氨酸残基之间断裂,所以提议采用酸水解或胃蛋白酶(pepsin)酶解h9’死训。
酸水解法特异性不强,对较大蛋白和肽不合适。
胃蛋白酶可以在酸性条件下使用,其专一性较低,断裂位点多,所以也更容易在半胱氨酸残基之间断裂,生成的含二硫键肽段比较小,有利于后面的分离和鉴定。
目前常用的定位二硫键的主要方法分为非片段法和片段法:
非片段法包括x射线衍射晶体结构解析法、多维核磁共振波谱法和合成对照法¨1一圳等;片段法包括对角线法、二硫键异构及突变分析法"引、酶解法和化学裂解法、部分还原测序法以及氰化半胱氨酸裂解法等。
它们各具特色,也有各自的局限性。
随着质谱仪器在质量检测范围、分辨率、灵敏度、准确度和分析速度等方面的不断发展,从而使质谱法恤_铲4¨更加适合于蛋白质和肽的分析。
实践中,二硫键的定位多采用生化、质谱及测序等多种方法相结合来进行。
本文对二硫键定位分析的一些方法以及质谱在其中的应用进行了评述。
2二硫键定位的主要方法
x射线晶体衍射法m1依赖于纯蛋白高度有序结晶的形成,是确定蛋白质构象最准确的方法。
而后来的二维、多维NMR㈨1的独到之处在于可以在近似自然生理条件的溶液状态下测出较小蛋白质的构象。
不过用这两种方法进行二硫键研究时样品量的要求比较大。
一些柔性的蛋白质不易得到所需的晶体,并且结构复杂、分子量较大的蛋白的计算处理和
解谱也会非常复杂。
对角线电泳(diagonalelectrophoresis)是一种经典的二硫键定位分析方法旧1。
这种技术包括:
(1)胃蛋白酶酶切未经还原的蛋白质;(2)在酸性pH=6.5的条件下进行第一向电泳,酶解产物肽段将按其大小及电荷的不同而分离;(3)将滤纸暴露在过甲酸(CHOOOH)蒸气中,使二硫键氧化断裂,并进一步氧化成磺酸基(一sO,H),被氧化的半胱氨酸称为磺基丙氨酸;(4)将滤纸旋转90。
角,在与第一向完全相同的条件下进行第二向电泳。
无二硫键的肽不受酸的作用而在两向电泳中迁移率相等,将位于一条对角线上。
那些含二硫键的肽由于第二向电泳时被酸氧化,肽段大小和负电荷发生变化而使迁移率不同,将偏离对角线。
肽斑可通过茚三酮显色来确定。
将含磺基丙氨酸的肽段分别取下,进行氨基酸序列分析,推断二硫键的位置。
如果蛋白质中存在其他未成二硫键的半胱氨酸,要先用碘乙酰胺封闭其一sH后再酶解。
此外甲硫氨酸和色氨酸也能被氧化,这样可能会增加分析的复杂性。
根据这种最初的对角线电泳概念,随后产生出许多其他的分离及鉴定含有二硫键肽的双向方法。
例如,未经还原和已被还原的酶解肽段混合物分别通过高效液相色谱法(HPLC)来分离汹州一圳,含有二硫键的肽段由于被还原而在HPLC分离时迁移率改变,就像在对角线电泳中偏离对角线的情况一样。
同样,应用质谱分别对没有预先分离的未还原和已还原的酶解肽段混合物进行分析Ⅲ1,也可以获得二硫键的相关信息。
另外象Edman降解(Edmandegradation)¨31或氨基酸序列分析(amino
acid
analysis)¨钆圳等二硫键分
析技术样品用量较大,对样品纯度要求很高,所以纯化的手段也非常重要,纯化过程中所涉及的条件也必须主意避免二硫键的重排和交换¨乳伸盥瑚’“-抵鸽叫¨。
一般化学裂解的肽段较大,适合于自动测序仪采用标准Edman降解测序方法测定。
化学法常用试剂有溴化氢、亚碘酰基苯甲酸和羟胺等。
酶法的优点是专一性强、产率较高、副反应少。
常用酶有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶等。
有时为得到只含一对二硫键的肽片段,可以利用多种酶或化学试剂进行多步酶切或化学降解(multiple.stepenzymatic
or
chemical
digestion)来裂解蛋白质。
多数酶解是在碱性条件下进行的,所以二硫键交换的几率比较大,虽然用部分酸水解能避免二硫
第6期仇晓燕等蛋白质中二硫键的定位及其质谱分析
・977・
键交换,但是这样得到的数据不容易解释和处理;另外当被分析物有抗酶解性或含有相邻的半胱氨酸并参与形成二硫键时,找不到合适的酶切位点,无法通过传统的蛋白酶解法得到有用的特征片段信息;或者样品量很少,难以满足x射线衍射与核磁共振法对样品量的要求;或者因富含二硫键而使异构体数目增多,比如含3个二硫键理论上就会有15个异构体,应用合成对照法也比较困难时,可以采用部分还原测序法¨2。
引。
虽然从热力学的角度分析,每个二硫键都有相同的还原/氧化潜能,理论上被还原剂还原的机会应是相同的。
但实际上在溶液中不同的二硫键的还原动力学是不相同的,因为蛋白质具有一定的空间结构,二硫键在蛋白质中的分布是各不相同的,其构象能(conformationalenergy)以及与还原试剂的接近程度也互不相同,因而蛋白质中所包含的二硫键可以被还原剂选择性地还原。
水溶性的三羧乙基膦tris(2.carboxyethyl)phosphine(TCEP)是一种极为合适的部分还原试剂。
1993年Gray等b2’采用TCEP在酸性环境下对多肽进行部分还原,使其部分二硫键打开,用HPLC快速分离各种部分还原中间体并迅速用烷基化试剂如碘代乙酰胺(iodoacetamide,IAM)进行烷基化,通过序列分析鉴定被标记的Cys残基,得到二硫键的位置信息。
很多实验室应用这种部分还原与烷基化的方法来分析二硫键配对方式Ⅱ2j卜圳。
但是,即便是控制很短的反应时间或用很低的IAM浓度,当在碱性pH=8条件下进行烷基化时都会导致二硫键交换的发生哺“。
1996年wu等¨副用2.硝基.5.硫氰苯甲酸
2.nitro.5.thiocyanobenzoic
acid(NTCB)对游离的巯基
选择性地氰基化,然后在碱性条件下从被化学修饰的残基的N端肽键断裂,形成一个氨基端肽以及一系列2.亚氨基噻唑4.羧肽(2.iminothiazolidine-4.
carboxyl
peptides),然后用MALDI.MS进行分析从而
鉴定出蛋白中自由巯基和二硫键的数目和位置。
1997年Wu等旧1在此基础上提出用部分还原结合质谱法进行二硫键的定位分析(图1)。
该方法简便、快速、灵敏,特别适合富含二硫键或含有相邻半胱氨酸等复杂二硫键模式的多肽。
先将多肽用TCEP在pH=3的柠檬酸缓冲液中进行部分还原,通过还原新生成的巯基迅速用1.氰基_4.二甲基氨基.吡啶四氟硼酸盐(1-cyano-4.dimethylamino.pyridiniumtetrafluoro.borate,CDAP)在相同酸性缓冲液中进行衍生,这样有效减小了二硫键交换反应的发生阻潮一硎,而且不用更换缓冲液和重调pH值,使操
,—乒E净so
。
.I,patlial岗uc【ion:
TcEP@pH
3
,o冀导《,o焉*so‘cyanylation;CDAP@pH
3
,o鬻等s。
,再焉持so
J
HPLC
fract.ionati。
n
.identiflcation
1—9
ITCl0
2Q29
S、S
ITC30—_卜50
1~9
SH
ITC30——}一50
ITCl0
2Q29
SH
cleavage:
1mol/LNH40H
’
1—4L19
§、S
ITC20——卜39
ITC40——∞
reduction:
TCEP
+
SH
1—1卜19
ITC20—亩.39
ITC40——50
l
MSanalysis
(Cysl0-Cys30)(Cys20-Cys40)
图1部分还原法原理示意图(ITC代表亚氨基噻唑烷基
羧基)‘”1
rig.1Principleofthepartialreduction
method(ITC
standsfor
iminothiazolidinyl
carboxyl
residueBt
the
amino
terminus、【“】
作简单。
然后在Itool・L~NH。
OH碱性条件下,从被修饰为一sCN的残基的N端肽键断裂生成肽片段,完成断裂后N地OH可以很容易地从反应体系中除掉。
通过质谱分析所生成片段的质量数,可以推断出二硫键的连接方式。
应用这种方法Qi等旧・¨41成功地定位了含有3个连在一起的半胱氨酸的多肽(.Cys.Cys.Cys.)的二硫键模式。
不过这种衍生法的关键还取决于能否有效地在被修饰Cys的N端断裂,象脯氨酸和酪氨酸这样有刚硬的或较大侧链的氨基酸残基,有时就会阻碍衍生肽段的断裂,所以限制了这种方法的应用。
传统的生化还原试剂如口.巯基乙醇(卢一mercaptoethan01)和二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTr)能有效还原二硫键,但不能在酸性条件下进行,而且有时还能与肽段形成加合物,使质谱图复杂。
三正丁基膦(tributylphosphine,TBP)也是一种非常有效的还原剂|醇’,并且没有形成加合物的倾向,同时它的挥发性使其过剩的试剂在随后的分析中可以很容易地除去。
虽然它可以在酸性条件下使用,但其反应速度要比在弱碱性下慢得多,而且其难溶性、恶臭、剧毒性、易被空气氧化和强反应能力在实际操作中需要特另fJ/b心。
TCEP旧。
对半胱氨酸反应的活性强而
-978・
化
学进展第20卷
且几乎没有与其它氨基酸的副反应,与TBP相比,TCEP和其他生化试剂有更好的兼容性,并且能在更宽的pH范围包括酸性条件(pH=3)下使用【70’7“,从而有效减少二硫键交换的发生。
同时TCEP的反应活性比DTI"的温和、易溶、毒性小而更容易操作。
虽然它不易挥发,但进行二硫键还原所需的TCEP浓度并不妨碍随后的质谱分析b毛7引。
3质谱在二硫键定位分析中的应用
质谱技术自上世纪初发明以来"3’,由于电离技术的限制长期未能用在生物样品分析上。
上世纪80年代随着快原子轰击(fast
atom
bombardment,
FAB)m1和等离子体解吸(plasmadesorption,PD)[75-7s]以及电喷雾(electrospray
ionization,
ESI)旧驯和基质辅助激光解吸电离(matrix.assisted
laserdesorption
ionization,MALDI)1铲驯等软电离质
谱技术的出现,开辟了生物质谱的新纪元。
人们也意识到质谱在蛋白质二硫键定位研究中的潜在意义旧J9_81|。
用质谱分析二硫键的最初报道旧1与对角线电泳有很多类似之处,比如在酸性pH值条件下采用胃蛋白酶酶解肽段来避免二硫键交换发生,最大的不同在于质谱中分离和分析是同时进行的。
含有二硫键的肽段通过比较还原烷基化前后酶解肽段混合物的质谱图而确定。
然后被提议的二硫键配
对方式再通过Edman降解等方法得以确认。
到现
在已经有许多应用质谱法来定位复杂蛋白质中二硫键的报道(表1)。
现代生物质谱MALDI.TOF.MS具有样品用量少、快速、能耐受较高浓度缓冲液和盐等杂质的优点。
ESI.MS的特点是能方便地与液相色谱(1iquidchromatography,LC)或毛细管电泳等现代化的分离手段联用来进行二硫键的定量和定位。
Tetsuya等啪1通过LC/ESI.MS联用分析endolⅪ的胰酶酶解产物来确定其糖基取代位置及二硫键的
位置。
有时需要结合进一步的串联质谱(tandem
1D_flbS
spectrometry,or
MS/MS)离子碎裂信息来确定某些复
杂肽的二硫键配对方式,比如在半胱氨酸之间没有酶切位点的三链多肽或其中一条另有链内二硫键的双链多肽(图2)。
可使用各种不同的离子源与质量分析器互相组合成不同的串联质谱仪来完成,比如FAB与扇形磁场串联质谱∽“、ESI与三级四极杆串联质谱(ESI.triple—quadrupole.MS/MS)№圆1和反射式
MALDbTOF的源后裂解(post.sourcedecay,PSD)
等m皿】。
含有相邻半胱氨酸的复杂多肽也可通过
(a)_11r_—II_一
——L—Ir一
・___—・-_—_—_●L__・—・一
‘6’・1・r--一1
_・_I——_・—L__・—-山
圈2复杂的二硫键相连肽段㈣1
Fjg.2
Complexdisulfide.1inkedpeptides‘1圳
MS/MS从两个相邻半胱氨酸残基之间断裂来定位二硫键协瑚]。
Mhatie等阳引用MALDI.TOF分析还原前后的酶解产物,完成了重组IgGl单克隆抗体(mAb)部分二硫键的定位。
Zhang等旧。
用RP-HPLC/MS,nanoESI.QTOFMS/MS和Edman序列分析相结合的方法完成了IsG4mAb全部二硫键的定位。
Yen等b71用LC/ESI.MS/MS方法检测了模式较简单的蛋白质的二硫键位置。
还可以结合使用Sequest和Mascot程序检索蛋白数据库来分析蛋白质的糖基化位点及二硫键位置∽“。
后来他们又结合TCEP部分还原和LC/ESI.MS/MS来定位那些含有相邻半胱氨酸等复杂二硫键模式的蛋白和多肽中的二硫键ⅢJ。
他们优化了部分还原反应条件,将酶解后样品在
65℃改用低浓度TCEP(O.1珈.5
mmol・L“)反应,这
样部分还原产物相对稳定并且可以较长时间储存(>4周)。
同时还指出TCEP在酸性环境中进行还原时可能也有部分二硫键交换反应的发生,而烷基化试剂N.ethylmaleimide(NEM)或maleimide.biotin(M—biotin)的存在可以有效地减少这种现象。
另外部分还原法中对于含有n个二硫键的肽,需测定其n一1个部分还原中间体的结构以确定该肽二硫键连接方式。
他们采用NEM,M.biotin和IAM3种不同的烷基化试剂分步修饰各个成对的半胱氨酸,然后直接通过一次MS/MS分析判断全部二硫键的位置(图3)。
选用NEM或M.biotin是因为它们在相对
低的pH(<6.5)条件下还会有较高的反应力。
串联质谱的谱图可以给出更多定位二硫键的有用信息,但是有时不好解释。
前面提到使用胃蛋白酶在酸性pH条件下进行酶解可以有效减少二硫键交换反应的发生,但是胃蛋白酶因其专一性较低而酶解产物较复杂,有时还会妨碍有用的肽段的离子化或生成的谱图难以解释等等。
这些问题可以通过结合酶解标记方法来解决。
Schnolzer等旧。
将蛋白质在H2埔0中酶解后发现其C端羧基可稳定结合1个或两个培0原子。
他们同时发现,在一般的LG、ESI
第6期仇晓燕等蛋白质中二硫键的定位及其质谱分析
・979・
表1应用质谱定位蛋白质中二硫键的典型实例
Tablel
Representativeexamplesofdisulfidebondarrangementsinprotein
determinedby
m嘲spectrometry
proteinmethodology
ref.insalin
henandduekegg-whitelysozymes
hen
egg-whitelysozyme
andbovine
ribonueleaseA(RNasA)
RNa8eA
antothrombinⅢ
呻1,a-amylase
inhibitor
wheat
kernelQ-amylaseinhibifor
protozoanEr-IandEr-2
echistatin
bovinedopaminep-hydroxyinse∞p08in
Cand
B
brassicanapu¥seed
storageprotein,napin
plasmodiumapicalmembraneantigen-1bitisarieta/lsbitistatinhumaninsulinreceptorectodomain
human
respiratofy俨ytial
virus
attachment
glycopmtein
newcastle
disease、.i11=iB(NDV)hemagglutinin-
neuraminidase(HN)
humanagouti-related
pro把inhuman
leptinreceptor
humaninterleukin一6receptorhumansi伊1altransducer
gpl30ectodomain
huwentoIin一1I(HWTX.11)FAB-MSofpepticdigestpeptides
FAB—MSof
combined
CNBr/pepticdigestpeptides
FAB・MSofpeptides
from
variousdigestsinvolving
CNBr/u'ypsin/diluteacid/ehymotrypsin/
endoproteinsse
Glu—C
FAB-MSofcombined
CNBr/trypticdigestpeptides
FAB・MSof
combinedendopmteinsseGlu—C/tryptieor
peptic
digestpeptides
FAB・-MSofendoproteinsse
Glu-C
digestpeptides
FAB-MSof
different
combinations
of
elastase/trypsinor
elastase/trypsin/chymotrypsin
orelastase/trypEirdpepsinand
of目on'lepeptidesshortenedbymanualgdmandegradation
MALDI・TOF-MSandESI・・TOF-MSofthennolyticdigestpeptides
ESI—MSandES
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 蛋白质 二硫键 定位 及其 谱分析 解析