胰岛细胞特异性敲除基因appl1小鼠模型的制备.docx
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胰岛细胞特异性敲除基因appl1小鼠模型的制备
尊敬的《上海医学》编辑老师:
您好!
首先非常感谢您及评审专家对我们文章的审修,目前已按照修改意见进行了修改,以下是对修改意见的具体答复,希望回答专家的问题,谢谢。
1.“胰岛细胞特异性敲除APPL1基因”和“β细胞APPL1特异性敲除APPL1基因”这两种表达方法应该统一;
在文章中已做修改。
2.从图3可以看出,β细胞APPL1敲除小鼠脂肪组织APPL1的表达显著高于野生型,原因何在?
正如文章所提及,我们收集APPL1flox/flox和β-APPL1KO两组小鼠多例样本,western结果并未发现APPL1蛋白水平表达的脂肪组织中有统计学差异,为了消除之前结果容易给人的误解,我们另外选择两组实验数据来作为结果图。
3.该研究目的是建立β细胞APPL1基因敲除小鼠模型,因此在表型分析方面应多关注β细胞功能,至少要提供血胰岛素水平方面的数据,而不是仅仅提供血糖数据。
这个意见提得很好,事实上我们研究组已经研究了APPL1flox/flox和β-APPL1KO小鼠的空腹血胰岛素水平差异,这部分内容我在文章的方法和结果中也已作了修改和补充。
4.如可以请引用《上海医学》杂志和《中国实用内科杂志》的参考文献各一条
在文章中我已做补充。
此致
敬礼
李晓雯
2015.1.30
胰岛细胞特异性敲除基因APPL1小鼠模型的制备
李晓雯1李羚1林紫薇1孙赟1陈辰2王琛1*贾伟平1
【摘要】目的制备转接蛋白APPL1胰岛细胞特异性敲除小鼠模型。
方法采用基因剔除打靶技术,囊胚显微注射法制备嵌合小鼠,利用Cre-loxp系统繁育APPL1胰岛特异性敲除小鼠。
Westernblot检测APPL1蛋白表达水平。
结果成功制备胰岛细胞特异性敲除基因APPL1小鼠模型,与APPL1flox/flox小鼠相比,胰岛细胞特异性敲除基因APPL1并不影响小鼠体重,空腹血糖以及空腹胰岛素水平,westernblot从蛋白水平印证敲除小鼠胰岛中的APPL1蛋白无表达。
结论胰岛细胞特异性敲除基因APPL1小鼠模型制备成功,为探讨APPL1在胰岛中的功能提供研究工具。
【关键词】APPL1;胰岛;条件性敲除
EstablishmentofAPPL1conditionalknockoutmodelinmiceisletLIXiaowen1,LILing1,LINZeiwei1,SUNYun1,CHENChen2,WANGChen1*,JIAWeiping1.
1ShanghaiJiaoTongUniversityAffiliatedSixthPeople’sHospital,ShanghaiDiabetesInstitute,ShanghaiKeyLaboratoryofDiabetesMellitus,Shanghai200233,China
2ShanghaiResearchCenterforModelOrganisms,Shanghai201210,China
Correspondingauthor:
WANGChen,wangchen@
【Abstract】ObjectiveTodiscussthemethodofAPPL1knockoutmousemodelinislet.
MethodsMouseembryonicstem(ES)cellsweretargetedknockoutofAPPL1bythehomologousrecombinationvector,andscreened.TheAPPL1-knockoutembryonicstemcellsweremicroinjectedintoblastulaofC57BL/6Jmice.F1hybridmicewerebredtoobtainmouseaggregationchimeras.TheconditionalKOmiceweregeneratedbycross-breedingAPPL1floxedmicewithmiceexpressingCreinislets.Westernblotwasconductedtomeasureproteinexpression.ResultsMicewithconditional APPL1 knockout(KO)inisletsweregenerated.ComparedwithAPPL1flox/floxmice,APPL1 conditionalknockout inisletsdoesnotaffectthemiceweight,fastingplasmaglucoseandfastinginsulinlevels,noAPPL1proteinexpressionwasfoundinAPPL1KOmiceisletswithwesternblot.ConclusionsTheconditionalAPPL1-knockoutmousemodelissuccessfullyestablished,itlaysafoundationforstudyAPPL1functioninmouseislets.
【Keywords】APPL1;islet;conditionalknockout
2型糖尿病是一种复杂的慢性代谢性疾病,对公共健康造成严重威胁,是由胰岛素抵抗和β细胞受损/死亡造成胰岛素分泌缺乏共同作用而引起的一种进展性疾病[1]。
近年研究表明,脂肪细胞因子对糖尿病的发病起着重要作用,其中脂联素(Adiponectin)因其可增加胰岛素敏感性、降低胰岛素抵抗、增加胰岛β细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌[2,3],在2型糖尿病的发生和发展中可能起重要作用,因而引起了极大的关注并成为研究热点。
脂联素通过脂联素受体发挥作用,2006年[4]报道APPL1(AdaptorproteincontainingPHdomain,PTBdomainandLeucinezippermotif1)可与脂联素受体1(Adiponectinreceptor-1,adipoR1)结合,介导脂联素信号传导,该发现为药物干预提供了一个潜在靶点[5]。
遗传研究结果显示,APPL1基因单核苷酸多态性位点rs4640525和rs3806622的变异与中国人2型糖尿病患者肥胖发病风险有关[6]。
为了从生物整体水平上来探讨脂联素-APPL1传导系统在胰岛素抵抗发生和发展中的作用以及APPL1对胰岛β细胞功能的影响,本研究利用Cre-LoxP系统介导技术及RIP-Cre转基因小鼠在胰岛细胞中特异性表达特点,建立胰岛细胞特异性APPL1基因敲除小鼠。
1材料与方法
1.1实验动物
所有实验小鼠饲养于上海市第六人民医院实验动物中心SPF级动物室,小鼠自由进食消毒颗粒饲料(上海斯莱克公司),及饮用消毒水,室温控制于23±1℃,湿度56%,12h间隔照明,定期紫外线消毒与通风。
实验和操作程序经所在单位的动物实验伦理委员会审核通过(实验动物合格证号:
SYXK(沪)2008-0052)。
对照组和APPL1基因敲除纯合子小鼠于8-12周龄测定体重,空腹血糖采用ACCU-CHEK血糖仪(美国罗氏公司)检测,空腹胰岛素水平用ELISA药盒测定(瑞典Mercodia公司)。
分离上述小鼠的胰岛,脂肪组织于-80℃冻存备用。
1.2APPL1flox/+小鼠建立及鉴定
APPL1flox/+小鼠模型在上海南方模式生物研究中心[SYXK(沪)2008-0035]制备,具体为基因剔除打靶载体构建、胚胎干细胞(Embryonicstemcells,ES)基因打靶、囊胚显微注射法制备嵌合小鼠、嵌合小鼠与野生型C57BL/6J雌性小鼠繁殖后代灰色小鼠(APPL1flox/+)。
APPL1基因含有22个外显子,本研究LoxP插入位点在第5外显子两端。
RIP-Cre转基因小鼠购自南京大学模式动物研究所[许可证编号:
SYXK(苏)2010-0003]。
1.3小鼠鉴定
小鼠尾DNA提取剪取4周龄小鼠尾端于1.5mlEP管,经蛋白酶K(美国Merck公司)和裂解液裂解过夜后,次日震荡后离心,留上清加入无水乙醇后析出DNA,留沉淀,室温晾干后取适量ddH2O溶解,室温放置1h待完全溶解后4℃保存待用。
PCR扩增及电泳PCR管中先后加入PCR预混液(上海天根公司)、DNA,引物以及ddH2O,混匀后上机。
在梯度PCR仪(美国ABI公司)设定相应PCR条件进行扩增。
取适量PCR产物,加入PCR上样缓冲液,混匀后加入电泳槽的样品孔内。
接通电源,恒压250V。
根据指示剂泳动的位置判断是否终止电泳。
Cre小鼠的鉴定方法同既往研究所述[7]。
APPL1flox/flox小鼠的鉴定上游引物序列为:
5’-TTTAAAAGTTTTAGTCTGGGCATGG-3’,下游引物为:
5’-CTCCCATAGCATTTCAATCTGTAAT-3’。
APPL1flox/flox小鼠与RIP-Cre转基因PCR结果示Cre阳性,且APPL1为杂合子的小鼠留用,记为APPL1+/-/RIP-Cre+。
然后用其与APPL1flox/flox小鼠交配获得的子代经提取尾部DNA,PCR筛选出胰岛细胞特异性敲除APPL1纯合子小鼠,记为β-APPL1KO鼠。
1.4Westernblot检测
胰岛细胞和脂肪组织用裂解液提取蛋白定量,取一定量蛋白质在10%SDS-PAGE凝胶上电泳分离,然后转移到硝酸纤维素膜上,转膜后5%脱脂牛奶封闭1h[8],分别用APPL1抗体(1:
1000稀释)和β-actin抗体(1:
1000)孵育过夜。
显影采用TermoPierce ECL发光试剂盒,曝光利用LAS4000化学发光成像分析系统进行。
β-actin和APPL1抗体均购自CellsignalingTechnology公司。
1.5统计学处理
采用SPSS19.0统计软件进行数据分析。
计量资料用均数±标准误(x±sx),2组间比较采用独立样本t检验。
以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1APPL1flox/flox小鼠的繁殖及鉴定
APPL1flox/+小鼠之间交配成功保种并获得APPL1纯合子(APPL1flox/flox)小鼠,其基因组示意图及鉴定策略见图1。
鉴于APPL1flox/flox小鼠的基因型2条染色体都带有两端含2个LoxP序列,因此,PCR仅扩增得到1条879bp左右的条带(图2)。
APPL1flox/+小鼠则扩增出685bp和879bp两条带。
对照小鼠PCR仅扩增出一条685bp的条带(图2)。
2.2胰岛细胞中敲除APPL1基因小鼠的繁殖及鉴定
APPL1flox/flox小鼠与RIP-Cre小鼠交配可以获得APPL1基因敲除的杂合子小鼠,其与APPL1flox/flox小鼠交配,下代繁育出APPL1flox/flox、APPL1flox/+、APPL1基因敲除的杂合子小鼠以及APPL1基因敲除的纯合子小鼠(β-APPL1KO)。
为增加β-APPL1KO的产出,之后用β-APPL1KO小鼠和APPL1flox/flox小鼠回交,即获得1:
1的β-APPL1KO和APPL1flox/flox。
2.3胰岛细胞中敲除APPL1基因小鼠的表型分析
分别取APPL1flox/flox和β-APPL1KO小鼠的胰岛,用Western-blot方法分析,图3可见APPL1flox/flox小鼠有APPL1表达,而β-APPL1KO小鼠无表达。
而对于脂肪组织来说无论是APPL1flox/flox还是β-APPL1KO来源均有APPL1蛋白的表达。
为了精确的观察APPL1基因条件性敲除对小鼠基本表型的影响,我们分别取8,10,12周龄小鼠对其进行体重测量,发现与APPL1flox/flox组小鼠相比,APPL1敲除小鼠体重略低,但其差异并无明显统计学意义。
此外,8和10周龄小鼠空腹血糖以及10周空腹胰岛素,两组间也无明显差异(图4)。
讨论
本研究将含APPL1打靶载体的质粒显微注射到胚胎干细胞中,随后转到小鼠体内形成嵌合体,并利用RIP-Cre系统介导的位点特异性重组技术经繁殖保种最终获得在胰岛细胞特异性敲除APPL1的小鼠模型,经westernblot检测从蛋白水平鉴定该模型成功建立。
条件性基因敲除技术是在特定的发育时期或特定的组织和器官中使某个基因失活,从而用于研究感兴趣基因在某时间段或某特定组织和器官中的生理病理功能。
广义上的全身敲除某基因的基因打靶技术尽管克服了经受精卵原核显微注射技术引起的,诸如外源基因随机整突变,往往引起严重的发育缺陷或胎儿死亡,不利于在发育后期阶段基因功能的分析[9]。
以Cre-LoxP系统与基因打靶技术相结合的条件性基因打靶克服了上述的局限[10-12]。
当然,与传统的完全性基因敲除技术相比,条件性基因敲除技术也有其缺点:
建立模型所需的步骤更为复杂,花费的时间更长。
目前,条件性敲除小鼠模型已经越来越广泛的应用于糖尿病分子机制研究领域[13-15],但APPL1的胰岛特异性敲除模型未见报道。
APPL1是近年发现的一种细胞内转接蛋白,其由709个氨基酸组成,人APPL1基因定位在染色体3p14.3-21.1,全长45.6kb,包含22个外显子及21个内含子,在人体骨骼肌、卵巢、胰腺、心脏中APPL1蛋白表达最为丰富[16]。
APPL1具有多个功能结构域,包含羧基端的磷酸酪氨酸结合(PTBphosphotyrosinebinding)结构、PH(Pleckstrinhomology)结构域和氨基端的BAR(Binamphiphysin-Rvs)结构域,其通过自身功能结构域与近14种蛋白相互作用,包括膜受体和信号分子,参与细胞生存、增殖和凋亡等各种信号转导通路[17]。
目前,对APPL1在细胞内的作用尚未完全知晓。
RIP(ratinsulinpromoter)是大鼠β细胞特异的胰岛素启动子[18,19],通过它可以实现Cre特异性的在胰岛细胞中表达,进而在Cre重组酶的作用下[20]切除两个LoxP位点之间的APPL1第5外显子,达到在胰岛细胞中特异性敲除APPL1的目的。
研究发现,APPL1在多种组织中发挥重要作用:
在骨骼肌中过表达APPL1可以显著提高AMPK及p38MAPK的磷酸化水平,从而促进骨骼肌的葡萄糖摄取、脂肪酸氧化,调节糖脂代谢[4];敲除脂肪细胞中APPL1可以抑制Akt磷酸化、降低葡萄糖摄取和GLUT4的功能[21]。
在肝脏中,APPLl表达上调可增强胰岛素介导的Akt激活并且通过抑制糖异生作用可提高肝脏对胰岛素的敏感性[22]。
此外,我们的研究发现,APPL1在大鼠,小鼠和人的胰腺及胰岛细胞中也大量表达。
观察APPL1全身敲除小鼠显示,葡萄糖耐量和葡萄糖刺激的胰岛素分泌较对照小鼠明显降低,在胰岛细胞过表达APPL1可降低高葡萄糖和炎症因子导致的细胞凋亡,并增加葡萄糖刺激的胰岛素释放。
表明APPL1对高糖和炎症因子诱导的胰岛β细胞损伤具有保护作用,可降低β细胞凋亡并改善胰岛细胞功能。
提示APPL1在2型糖尿病发病中可能起重要作用[23,24]。
上述研究结果基于APPL1全身敲除小鼠水平或是胰岛β细胞系水平,如前所述,APPL1在多种组织中参与调控代谢和胰岛素敏感性,所以利用全身敲除的动物模型来探明APPL1对胰岛细胞的影响及分子机制并不能排除胰岛细胞外的组织对实验结果叠加的影响,为此,建立胰岛细胞特异性APPL1敲除模型显得尤为重要。
总之,本研究利用特异性重组技术,在RIP-Cre系统首次建立胰岛细胞特异性APPL1敲除的小鼠模型,该模型的建立为后续研究APPL1在胰岛细胞中的作用提供了良好的模型,为临床2型糖尿病的治疗开发了新的研究工具。
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