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生物分离重点
第一章绪论
1、总体现状:
生物技术的最新进展
(1)基因工程方面:
试管婴儿、细胞融合、蛋白质序列分析、转基因
(2)生物反应器:
连续式,柱式、固定化酶、固定化细胞反应器
(3)发酵技术:
固定化酶、固定化细胞技术
2、发展趋势:
(1)操作与方法集成化
(2)亲和技术推广与配基合成(分子印迹)
(3)优质层析介质开发(大孔亲水介质,贯注层析介质)
(4)下游技术与上游技术相结合
(5)改进上游因素(菌种,培养基与发酵条件)
(6)改善环境相容性
3、三种原理:
1)物理性质:
力学性质:
重力、离心力、筛分;热力学性质:
状态变化、相平衡;
传质性质:
扩散;电磁性质:
磁化;
2)化学性质:
化学热力学:
化学平衡;化学反应动力学:
反应速率;化学解离性质:
极化、离子化;
3)生物学性质:
生物分子识别:
生物亲和作用;生物输送性质:
生物膜输送;
生物反应、控制:
酶反应、免疫系统。
4、生物技术上游加工过程:
优良生物物种的选育、基因工程、细胞工程、生物反应过程(酶反应、微生物发酵、动植物细胞培养等)。
5、生物技术下游加工过程:
目标产物的分离纯化。
第二章细胞分离与破碎
1、细胞破碎主要阻力:
来自于细胞壁。
细胞壁较坚韧。
常见方法:
破碎方法可归纳为机械法和非机械法两大类。
机械破碎法:
高压匀浆破碎法;高速搅拌珠研磨破碎法;超声波破碎法。
(1)高压匀浆器破碎原理:
物料的加工是在均质阀里进行的,物料在高压下进入调节间隙的阀件时,物料获得极高的流速(200-300m/s),从而在均质阀里形成一个巨大的压力下跌,在空穴效应,撞击和剪切的多种作用下把原先比较粗糙的乳浊液或悬浮液加工成极细微分散、均匀、稳定的液-液乳化物或液-固分散物。
(2)高速珠磨机工作原理:
水平位置的磨室内放置玻离小珠,装在同心轴上的园盘搅拌器高速旋转,使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动,细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起。
在料液出口处,旋转园盘和出口平板之间的狭缝很小,可阻挡玻离小珠,使不被料液带出。
由于操作过程中会产生热量,易造成某些生化物质破坏,故磨室还装有冷却夹套,以冷却细胞悬浮液和玻离小珠。
(3)超声波破碎法(Ultrasonication)利用超声波振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。
(4)一般认为在超声波作用下液体发生空化作用(cavitation),空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力,使细胞破碎。
超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。
非机械法:
酶解;渗透压冲击;冻结和融化;干燥法;化学法溶胞。
其中酶法和化学法溶胞应用最广。
酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞,使细胞壁受到部分或完全破坏后,再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜,进一步增大胞内产物的通透性。
溶菌酶(lysozyme)适用于革兰氏阴性菌细胞的分解,应用于革兰氏阴性菌时,需辅以EDTA使之更有效地作用于细胞壁。
真核细胞的细胞壁不同于原核细胞,需采用不同的酶。
渗透压冲击是较温和的一种破碎方法,将细胞放在高渗透压的溶液中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液),由于渗透压的作用,细胞内水分便向外渗出,细胞发生收缩,当达到平衡后,将介质快速稀释,或将细胞转入水或缓冲液中,由于渗透压的突然变化,胞外的水迅速渗入胞内,引起细胞快速膨胀而破裂。
冻结和融化:
将细胞放在低温下冷冻(约-15℃),然后在室温中融化,反复多次而达到破壁作用。
由于冷冻,一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂,从而增加细胞的亲水性能,另一方面胞内水结晶,形成冰晶粒,引起细胞膨胀而破裂。
对于细胞壁较脆弱的菌体,可采用此法。
干燥法:
经干燥后的细胞,其细胞膜的渗透性发生变化,同时部分菌体会产生自溶,然后用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时,胞内物质就会被抽提出来。
化学法:
采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。
常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂
第三章初级分离
1、盐析概念:
在蛋白质溶液中加入中性盐后会压缩扩散双电层、降低ζ电位,即中性盐既会使蛋白质脱水,又会中和蛋白质所带电荷,使颗粒间的相互排斥力失去,在布朗运动的互相碰撞下,蛋白质分子结合成聚集物而沉淀析出。
第四章膜分离
1、膜分离:
利用膜的选择性(孔径大小),以膜的两侧存在的能量差作为推动力(压力和电位),由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。
2、膜分离过程:
膜分离过程的实质是物质透过或被截留于膜的过程,近似于筛分过程,依据滤膜孔径大小而达到物质分离的目的,故而可以按分离粒子大小进行分类。
3、膜分离特点:
★处理效率高,设备易于放大;
★可在室温或低温下操作,适宜于热敏感物质分离浓缩;
★化学与机械强度最小,减少失活;
★无相转变,省能;
★有相当好选择性,可在分离、浓缩的同时达到部分纯化目的;
★选择合适膜与操作参数,可得到较高回收率;
★系统可密闭循环,防止外来污染;
★不外加化学物,透过液(酸、碱或盐溶液)可循环使用,降低了成本,并减少对环境的污染。
4、膜分离方法:
①微滤(Microfiltration,MF);②超滤(Ultrafiltration,UF)
③反渗透(Reverseosmosis,RO);④透析(Dialysis,DS)
⑤电渗析(Electrodialysis,ED)⑥渗透气化(Pervaporation,PV)
各种方法对比:
微滤分离原理:
利用筛分原理,分离、截留直径为0.05m到10m大小的粒子,即微滤膜的孔径为0.05m到10m。
采用压力为0.05~0.5MPa。
超滤分离原理:
超滤的分离原理也可基本理解为筛分原理,但在有些情况下受到粒子荷电性及其与荷电膜相互作用的影响。
它可分离分子量从1000到1000000道尔顿的可溶性大分子物质,对应孔径为0.002m到0.05m。
采用压力为0.1~1MPa。
反渗透分离原理:
在高于溶液渗透压的压力作用下,只有溶液中的水透过膜,而所有溶液中大分子、小分子有机物及无机盐全被截留住。
理想的反渗透膜应被认为是无孔的,它分离的基本原理是溶解扩散(也有毛细孔流学说)。
“膜孔径”为0.1到1nm。
采用压力为1~10MPa.
电渗析分离原理:
电渗析是利用分子的荷电性质和分子大小的差别进行分离的膜分离法,可用于小分子电解质(例如氨基酸、有机酸)的分离和溶液的脱盐。
电渗析操作所用的膜材料为离子交换膜,即在膜表面的孔内共价键合有离子交换基团.
透析分离原理:
利用具有一定孔径大小、高分子溶质不能透过的亲水膜,将含有高分子溶质和其它小分子溶质的溶液,与水溶液,或缓冲液分隔;由于膜两侧的溶质浓度不同,在浓差的作用下,左侧高分子溶液中的小分子溶质(如无机盐)透向右侧,右侧的水透向左侧,这就是透析。
纳滤:
纳滤(NF,Nanofiltration)是一种介于反渗透和超滤之间的压力驱动膜分离过程,纳滤膜的孔径范围在几个纳米左右。
但与反渗透相比,其操作压力更低,因此纳滤又被称作“低压反渗透”或“疏松反渗透”(LooseRO)。
纳滤分离作为一项新型的膜分离技术,技术原理近似机械筛分。
但是纳滤膜本体带有电荷性。
这是它在很低压力下仍具有较高脱盐性能和截留分子量为数百的膜也可脱除无机盐的重要原因。
几种主要膜分离技术特征:
各种分离法及适用范围:
5、膜组件形式:
1)管式膜组件
2)平板膜组件
3)螺旋卷式膜组件
4)中空纤维(毛细管管)式膜组件
各种模件性能比较:
各种膜组件的优缺点比较:
6、膜分离特点:
★处理效率高,设备易于放大;
★可在室温或低温下操作,适宜于热敏感物质分离浓缩;
★化学与机械强度最小,减少失活;
★无相转变,省能;
★有相当好选择性,可在分离、浓缩的同时达到部分纯化目的;
★选择合适膜与操作参数,可得到较高回收率;
★系统可密闭循环,防止外来污染;
★不外加化学物,透过液(酸、碱或盐溶液)可循环使用,降低了成本,并减少对环境的污染。
膜分离机理:
1)优先吸附-毛细管流动模型:
1963年由S.Sourirajan提出的。
其主要论点如下:
由于膜的化学性质对溶质具有排斥作用,根据Gibbs吸附方程,溶质是负吸附,水是优先吸附。
因此,在膜与溶液界面附近,溶液浓度剧烈下降,在膜的表面形成一层极薄的纯水层,纯水层的厚度与膜的表面性质密切相关。
在反渗透膜表面存在着毛细小孔。
当毛细孔的直径为纯水层厚度t的2倍时(称临界孔径),可以得到最大的透水率和脱盐率。
不同材料的膜有不同的临界孔径。
研制最佳的膜是在膜的表面形成尽可能多的孔径为2t的毛细孔。
孔径小于2t,膜的透水率降低;孔径大于2t时,由于部分含盐溶液也会通过膜孔而使脱盐率下降。
2)溶解-扩散模型:
H.K.Lonsdale(1965年)和R.L.Riley(1967年)等提出溶解-扩散理论解释反渗透膜的脱盐作用。
其要点如下。
膜表面无孔,是“完整的膜”。
水和溶质通过膜分两步进行:
第一步,水和溶质溶解于膜表面。
第二步,在化学势差的推动下和溶质扩散通过膜。
(浓度和压力)
在溶解扩散过程中,扩散是控制步骤。
8、膜污染:
膜污染是指处理物料中的微粒、胶体粒子或溶质大分子、由于与膜存在物理化学相互作用或机械作用而引起的在膜表面或膜孔内吸附、沉积造成膜孔径变小或堵塞,使膜产生透过流量与分离特性的不可逆变化的现象。
解决方法:
①预处理法:
②开发抗污染的膜:
③加大供给液的流速
第五章萃取
1、双水相萃取:
双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时,由于聚合物之间或聚合物与盐之间的不相容性,当聚合物或无机盐浓度达到一定值时,就会分成不互溶的两相。
因使用的溶剂是水,因此称为双水相,在这两相中水分都占很大比例(85%一95%),活性蛋白或细胞在这种环境中不会失活,但可以不同比例分配于两相,这就克服了有机溶剂萃取中蛋白容易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂的缺点。
是利用物质在不相溶的,两水相间分配系数的差异进行萃取的方法。
是否分层或混合成一相,取决于:
熵增——与分子数目有关;分子间作用力——与分子大小有关
可以构成双水相的体系有:
离子型高聚物-非离子型高聚物(分子间斥力)
高聚物-相对低分子量化合物(盐析作用)
双水相萃取的特点:
操作条件温和,在常温常压下进行;
两相的界面张力小,一般在10-4N/cm量级,两相易分散,
两相的相比随操作条件而变化;
易于连续操作,处理量大,适合工业应用。
上下两相密度差小,一般在10g/L。
因此两相分离较困难,目前这方面研究较多
2、反胶束萃取:
表面活性剂的极性头朝内,疏水的尾部向外,中间形成极性的“核”,
利用表面活性剂在有机相中形成的反胶团,从而在有机相内形成分散的亲水微环境,使生物分子在有机相(萃取相)内存在于反胶团的亲水微环境中,消除了生物分子,特别是蛋白质类生物活性物质难于溶解在有机相中或在有机相中发生不可逆变性的现象。
反胶团萃取技术的特点:
①有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性;
②分离、浓缩可同时进行,过程简便;
③能解决蛋白质(如胞内酶)在非细胞环境中迅速失活的问题;
④表面活性剂往往具有细胞破壁功效,可直接从完整细胞中提取具有活性的蛋白质和酶;
⑤成本低,溶剂可反复使用等。
3、超临界:
超临界流体萃取,是利用超临界流体,即其温度和压力略超过或靠近临界温度(Tc)和临界压力(pc),介于气体和液体之间的流体作为萃取剂,从固体或液体中萃取出某种高沸点或热敏性成分,以达到分离和提纯的目的。
特点:
密度接近液体--萃取能力;粘度接近气体--传质性能好。
4、萃取的影响因素:
(1)pH值:
pH除影响K外,还可能对选择性有影响。
(2)温度:
温度会影响生化物质的稳定性。
影响分配系数K。
(3)盐析:
无机盐类如硫酸铵、氯化钠等一般可降低产物在水中的溶解度而使其更易于转入有机溶剂相中,另一方面还能减小有机溶剂在水相中的溶解度。
(4)带溶剂:
为提高分配系数K,常添加带溶剂。
带溶剂是指能和产物形成复合物,促使产物更易溶于有机溶剂相中,在一定条件下又要容易分离的物质。
第六章吸附分离技术和理论
1、吸附:
吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附的能力,使其富集在吸附剂表面的过程。
吸附过程通常包括:
待分离料液与吸附剂混合、吸附质被吸附到吸附剂表面、料液流出、吸附质解吸回收等四个过程。
吸附法特点:
(1)不用或少用有机溶剂
(2)操作简便,安全
(3)生产过程pH变化小
(4)吸附剂对溶质的作用小
(5)吸附平衡为非线性
(6)选择性差
2、离子交换:
利用离子交换树脂作为吸附剂,将溶液中的待分离组分,依据其电荷差异,依靠库仑力吸附在树脂上,然后利用合适的洗脱剂将吸附质从树脂上洗脱下来,达到分离的目的。
影响交换速度的因素:
颗粒大小:
愈小越快
交联度:
交联度小,交换速度快
温度:
越高越快
离子化合价:
化合价越高,交换越快
离子大小:
越小越快
搅拌速度:
在一定程度上,越大越快
溶液浓度:
当交换速度为外扩散控制时,浓度越大,交换速度越快
影响离子交换选择性的因素:
水合离子半径:
半径越小,亲和力越大;
离子化合价:
高价离子易于被吸附;
溶液pH:
影响交换基团和交换离子的解离程度,但不影响交换容量;
有机溶剂:
不利于吸附;
树脂与粒子间的辅助力:
除静电力以外,还有氢键和范德华力等辅助力
特点:
分辨率高、工作容量大且易于操作
操作方式:
离子交换法按操作方法可分为间歇式分批操作和柱式分批操作。
2歇操作又叫静态处理,将离子交换剂浸泡于工作液中达到平衡后滤出介质进行洗脱。
②柱式操作又称动态法。
交换、洗脱、再生等步骤均在柱内进行,亦称为离子交换层析法(ionexchangechromatography)。
第七章液相色谱
1、色谱分离法:
就是根据混合物中溶质在两相之间分配行为的差别引起的溶质随流动相移动速度的不同进行分离的方法,是一组相关分离技术的总称。
它的机理是多种多样的,但不管哪种方法都必须包括两个相。
一相是固定相,通常为表面积很大的或多孔性固体;另一相是流动相,是液体或气体。
当流动相流过固定相时,由于物质在两相间的分配情况不同,经过多次差别分配而达到分离,或者说,易分配于固定相的物质移动速度慢,易分配于流动相中的物质移动速度快,因而得到逐步分离。
2、根据分离机理的分类、各自分类的原理和操作:
色谱法的分离原理是:
溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定相时,由于与固定相(stationaryphase)发生作用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小、强弱不同,在固定相中滞留时间不同,从而先后从固定相中流出。
按机理分类:
疏水相互作用色谱;反相色谱;离子交换色谱;凝胶色谱;亲和色谱
(1)疏水相互作用色谱:
原理:
利用表面偶联弱疏水性基团的疏水性吸附剂为固定相,是根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱色谱法。
操作:
HIC蛋白质的吸附需要在高浓度的盐液中进行,洗脱主要采用降低流动相离子强度的线性梯度洗脱法或逐次洗脱法。
(2)反相色谱:
原理:
利用表面非极性的反向介质为固定相,极性有机溶剂的水溶液为流动相,是根据溶质极性(疏水性)的差别进行分离纯化的洗脱色谱法。
操作:
RPC固定相表面完全被非极性基团所覆盖,表现处强烈的疏水性。
因此必须采用极性有机溶剂或其的水溶液进行溶质的洗脱分离。
(3)离子交换色谱:
原理:
利用离子交换剂为固定相,是根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱色谱法。
操作:
IEC操作很少采用恒定洗脱法,而多采用流动相离子强度线性增大的线性梯度洗脱法或离子强度阶跃增大的节约梯度洗脱法。
(4)凝胶色谱:
原理:
利用凝胶粒子为固定相,是根据料液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相色谱法。
操作:
GFC操作一般采用组成一定的洗脱液进行洗脱展开,这种洗脱法称为恒洗脱液洗脱法,简称恒定洗脱法。
(5)亲和色谱:
原理:
是利用亲和吸附作用分离纯化生物物质的液相色谱法。
亲和色谱的固定相是键合亲和配基的亲和吸附介质(亲和吸附剂)。
操作:
3、凝胶色谱的分级范围:
即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围,SephadexG-50的分级范围为1500~30000
4、塔板理论:
塔板理论:
Martin和Syngery首先提出的色谱热力学平衡理论。
它把色谱柱看作分馏塔,把组分在色谱柱内的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程,即组分在塔板间隔内的分配平衡过程。
塔板理论的基本假设为:
1)柱内各段塔板高度H不变,柱子塔板数N=L/H
2)在塔板高度H内,组分在两相间达到快速平衡
3)流动相以脉冲方式进入一个体积
4)分配系数K在每个塔板上均不变,是常数
5)组分加在0号塔板上,轴向扩散可忽略
5、色谱系统的组成:
色谱系统主要由流动相输送系统、进样系统、分离系统(色谱柱)、检测系统和数据处理系统组成。
5、线性梯度洗脱:
优点:
流动相离子强度连续增大,不出现干扰峰,操作范围广
缺点:
需要特殊的调配浓度梯度的设备
6、影响四种吸附色谱的因素:
7、蛋白质分子量的测定:
第八章亲和色谱
1、亲和作用的本质:
钥匙和锁孔的关系。
相互作用:
静电作用;氢键;疏水性相互作用;配位键;弱共价键。
影响亲和作用的因素:
离子强度;pH值;抑制氢键形成的物质;温度;离液离子;螯合剂。
2、吸附色谱基本操作过程:
吸附:
吸附操作要保证吸附介质对目标产物有较高的吸附容量,杂质的非特异性吸附要控制在尽可能低的水平。
清洗:
清洗操作目的是洗去介质颗粒内部和颗粒间空隙中的杂质,一般使用与吸附时相同的缓冲液。
必要时可加入表面活性剂,以保证目标物质的吸附和杂质的清除。
洗脱:
目标产物的洗脱方法有特异性洗脱和非特异性洗脱。
特异性洗脱剂含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物,通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合,洗脱目标产物。
非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH、离子强度、离子种类或温度等降低目标产物的亲和吸附作用。
当亲和作用很大,用通常的方法不能洗脱目标产物时,可用尿素或盐酸胍等变性剂溶液使目标产物变性,失去与配基的结合能力。
但应注意目标产物变性后能否复性。
再生:
洗脱结束后,亲和柱仍需继续用洗脱剂洗涤,直到无亲和物存在为止,再用平衡缓冲液充分平衡亲和柱进行介质的再生,以备下次
九章电泳和电色谱
1、电泳的原理:
带电颗粒在电场的作用下,向着与其电性相反的电极方向移动,这种现象称之为电泳。
电泳基本原理:
(1)带电颗粒:
溶液中任何物质由于其本身的解离或表面吸附其它带电质点而带电,在电场中就会发生迁移,移动方向取决于它们的带电符号。
生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中,它们的净电荷取决于溶液中的H+浓度。
(2)电泳迁移率:
荷电溶质在电场中所受的静电引力f与溶质的荷电荷数Z和电场强度E成正比:
f=EZe;带电颗粒在迁移中同时受到来自于介质的摩擦力,对于球形颗粒来说,在自由溶液中此阻力服从Stock定律:
f,=6πrηve;ve是在介质粘度为η的溶液中,半径为r的带电颗粒的移动速度。
但在凝胶中,这种阻力并不完全符合Stocks定律。
还取决于介质中的其它因素如凝胶厚度、颗粒大小和介质的内渗等。
当f=f,时,荷电溶质恒速泳动,ve=(Ze/6πrη)E=u0E;
其中u0=Ze/6πrη;为电解质溶质的迁移率。
2、电泳按机理分类,分类的原理和特点:
电泳按原理分类可分为;区带电泳、移界电泳和稳态电泳(等速电泳、等电聚焦电泳)
(1)区带电泳(zoneelectrophoresis,ZEP):
是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液,然后在介质上加电场,带电颗粒在支持介质上或支持介质内迁移,在电泳过程中,不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带,这是当前应用最广泛的电泳技术。
(2)移界电泳(movingboundaryelectrophoresis,MBEP):
是把电场加在生物大分子溶液和缓冲溶液之间的界面上,带电颗粒的移动速度通过光学方法观察界面的移动来测定。
(3)稳态电泳(steadystateelectrophoresis):
带电颗粒在电场作用下电迁移一定时间后达到一个稳定状态,此后,电泳条带的宽度不随时间的变化而变化,如等速电泳(isotachophoresis,ITP)、等电聚焦电泳(isoelectricfocusing,IEF)。
十章蛋白质复性
1、包含体的概念:
是外源基因在原核细胞中表达时,尤其在大肠杆菌细胞中高效表达时,形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒,在显微镜下观察时为高折射区,与细胞质中的其他成分有明显的区别。
2、形成机理:
包含体的形成比较复杂,有些机理还不清楚;一般认为包含体的形成是部分折叠的中间态之间疏水相互作用的结果,主要原因是蛋白质本身具有易于聚集沉淀的性质,或在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适,无法形成正确的次级键等。
包含体的形成与细胞内蛋白质的生成速率有关,新生成的多肽浓度较高,无充足时间进行折叠,而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体;
(1)包含体的形成还被认为与宿主菌的培养条件,如培养基成分、温度、pH值、离子强度、氧化还原电势及蛋白质转运系统的功能等因素有关。
(2)大肠杆菌的生长过程在受到某些因素的影响时,其本身蛋白质的表达也可出现异常,造成蛋白质的聚集从而形成包含体。
(3)重组蛋白的氨基酸组成.一般说含硫氨基酸越多越易形成包含体,而脯氨酸的含量明显与包含体的形成呈正相关。
3、用什么试剂处理:
一般可用5~8mol/L尿素或5~8mol/L的盐酸胍溶解包含体,使非共价聚集的蛋白质分子间分离。
为使蛋白质充分溶解,也可用低pH值(pH7.2~7.05)加含巯基的试剂(0.1%~1%)巯基乙醇或二硫苏糖醇和适量的SDS(1%SDS),使蛋白质完全还原呈溶解状态,为蛋白质的复性作好准备。
4、蛋白质的主要复性方法:
(1)稀释复性:
直接稀释复性:
将变性的蛋白质溶液直接稀释到适宜的复性缓冲液中,进行复性。
a.在复性过程中,聚集体生产速率随蛋白浓度的提高而增大,蛋白复性率随蛋白浓度的提高而降低。
B.含二硫键的蛋白,氧化还原剂浓度对复性收率影响显著。
C.聚集体的生产与蛋白质浓度的高次方成正比。
流加复性:
向复性液中脉冲加入变性蛋白质溶液的稀释复性方法,即边流加、边复性。
故变性蛋白质浓度始终保持在较低水平,有利于提高复性收率,且终浓度较高。
(2)添加剂辅助复性:
在复性液中添加小分子溶质,抑制聚集体的生成,这种利用辅助因子的稀释复性方法称为稀释添加复性。
常用的小分子:
低浓度变性剂(盐酸胍、尿素)、精氨酸、甘油、聚乙二醇、表面活性剂、有机小分子溶质(丙酮、乙酰胺)。
辅助因子作用:
a.稳定天然态蛋白质结构,降低错误折叠蛋白质的稳定性;b.提高折叠中间体或伸展肽链的溶解度。
(3)分子伴侣和人工分子伴侣复性:
典型人工伴侣系统为表面活性剂,利用表面活性剂分子捕获变性蛋白质,完全抑制蛋白质的折叠和分子间疏水作用,然后添加环糊精。
环糊精内腔疏水,对表面活性剂具有吸附作用,从而将伸展肽链的表面活性剂分子快速剥离,引发蛋白质的折叠。
(4)色谱复性:
利用色谱柱过程辅助蛋白质复性的方法,称为色谱复性。
其优点是:
v色谱固定相对变性蛋白质吸附能力低,甚至完全
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