麻黄内生真菌及发酵产物活性研究.docx
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麻黄内生真菌及发酵产物活性研究
毕业设计(论文)
(理工类)
论文题目:
麻黄内生真菌发酵产物抑菌活性研究
学院:
生命科学与工程学院
专业:
制药工程
姓名:
马军红
学号:
10580116
指导老师:
薛鸿燕杨中铎
职称:
助教教授
日期:
2014年6月
目录
摘要2
Abstract3
一.前言4
(一)麻黄及其化学成分研究现状4
1.麻黄研究现状4
2.麻黄化学成分研究概况4
(二)内生菌4
二.材料与方法6
(一)实验材料6
(二)实验试剂6
(三)实验仪器6
(四)实验方法6
1.内生真菌的分离纯化及保存6
2.菌株活化7
3菌株发酵及样品制备7
4抑菌活性测定7
5最小抑菌浓度的测定7
三.结果与分析7
(一)抑菌活性筛选结果7
1.XF﹑LZ﹑ZL产麻黄内生真菌发酵产物乙酸乙酯提取物抑菌结果8
2.XF﹑LZ﹑ZL产麻黄内生真菌发酵产物正丁醇提取物抑菌结果如表2所示9
3.XF﹑LZ﹑ZL产麻黄菌体抑菌结果如表3所示10
(二)最小抑菌浓度(MIC)的测定11
1.XF﹑LZ根部和茎部发酵产物提取物MIC测定结果如表4所示11
四.讨论与结论11
参考文献13
致谢14
麻黄内生真菌发酵产物抑菌活性研究
专业名称:
制药工程学号:
10580116姓名:
马军红
指导老师:
薛鸿燕杨中铎职称:
助教教授
摘要
目的:
分离并纯化麻黄内生真菌,测定麻黄内生真菌发酵产物抑菌活性,筛选具有良好抑菌活性的菌株。
方法:
从甘肃西峰(XF),兰州(LZ),庄浪(ZL)产麻黄中分离得到的34株内生真菌在PDA液体培养基中发酵。
菌液分离后,发酵液分别用乙酸乙酯和正丁醇萃取,得到浸膏;菌体干燥后用甲醇回流提取,得到菌体甲醇提取物。
然后用滤纸片法测定各样品对六种供试细菌(金黄色葡萄球菌,地衣芽孢杆菌,乳链球菌,大肠杆菌,绿脓杆菌,肺炎克雷伯菌)的抑菌活性,抑菌活性较好的样品用二倍稀释法测定其最小抑菌浓度。
结果:
发酵液乙酸乙酯萃取部位抑菌活性较好的菌株最多:
对六株供试菌均有较强抑制活性(抑菌圈直径大于15mm)的菌株共有6株(XFG105,XFJ108,XFJ109,XFJ110;LZJ101,LZG201);其中抑菌圈直径大于20mm的有4株(XFG105、XFJ109、XFJ110;LZJ101)。
正丁醇提取部位活性次之,对六株供试菌均有较强抑制活性(抑菌圈直径大于15mm)的菌株有2株(LZJ101﹑LZG201);其中抑菌圈直径大于20mm的有1株(LZG201);XFJ102对肺炎克雷伯菌抑菌圈为12.7mm,对其他五种供试菌抑菌圈皆大于15mm。
菌体部位活性最差,对六株供试菌有较强抑菌活性(抑菌圈直径大于15mm)的有只有LZJ101﹑LZJ102,其他样品抑菌圈都小于15mm。
结论:
从XF﹑LZ﹑ZL分离得到的34株内生真菌,其中有8株对6种供试菌有强的抑菌活性。
关键词:
麻黄;内生真菌;代谢产物;抑菌活性;最低抑菌浓度
Abstract
Objective:
TodeterminetheEphedraactivityoffermentationproductsofendophyticfungi,screeninghasgoodantibacterialactivitystrains.Methods:
FromGansutoXifeng(XF),Lanzhou(LZ),Zhuanglang(ZL)productioninEphedraisolated34strainsofendophyticfungifermentationinPDAliquidmedium.Bacterialiquidseparation,fermentationliquidbyethylacetateandn-butanolextract,obtainedafterdrying;cellwithmethanolrefluxextraction,methanolextract.Thenusethefilterpapermethodforthedeterminationofthesamplesofsixkindsoftestedbacteria(Staphylococcusaureus,bacillus,Streptococcus,Escherichiacoli,Pseudomonasaeruginosa,Klebsiellapneumoniae)antibacterialactivity,samplebetterantibacterialactivitydeterminationoftheminimuminhibitoryconcentrationoftwotimesdilutionmethod.Results:
Thefermentationliquidofethylacetateextractbetterantibacterialactivitystrainsmost:
sixteststrainshadstronginhibitoryactivity(inhibitionzonediametergreaterthan15mm)strainswere6strains(XFG105,XFJ108,XFJ109,XFJ110;LZJ101,LZG201);theinhibitionzonediametergreaterthan20mm(4strainsXFG105,XFJ109,XFJ110;LZJ101).N-butylalcoholextractswerethesecond,onsixteststrainshadstronginhibitoryactivity(inhibitionzonediametergreaterthan15mm)strains2strains(LZJ101,LZG201);theinhibitionzonediametergreaterthan1strainswere20mm(LZG201);XFJ102ofKlebsiellapneumoniaebacteriostaticringis12.7mm,thetheotherfivestrainsofbacteriostaticringaregreaterthan15mm.Theworstpartofcellactivity,sixstrainsoftestedbacteriahadastronginhibitoryactivity(inhibitionzonediametergreaterthan15mm)withonlyLZJ101,LZJ102,othersamplesofbacteriostaticringislessthan15mm.Conclusion:
34strainsofendophyticfungiwereobtainedfromXF,LZ,ZLseparation,including8strainsofendophyticbacteriaon6testedbacteriahadstrongantimicrobialactivities.
Keywords﹕Ephedra;Endophyticfungi;Metabolites;Antibacterialactivity;Minimuminhibitoryconcentration
一.前言
(一)麻黄及其化学成分研究现状
1.麻黄研究现状
麻黄(Ephedra),属于种子植物门、裸子植物亚门、麻黄科、麻黄属,源于麻黄科植物草麻黄(EphedrasinicaStapf.)、木贼麻黄(E.equisetinaBge.)与中麻黄(E.intermediaSchrentexCAMey.)的干燥草质茎,别名龙沙,因其植株色黄而味麻,所以称其为麻黄[1]。
始载于《神农本草经》,列为中品。
《中药学》认为麻黄性温。
味辛、微苦。
归肺、膀胱二经,功效为发汗解表、宣肺平喘、利水消肿。
麻黄具有多种类型的化学成分,包括生物碱、黄酮类、挥发油类、糖类、鞣质及有机酸类、氨基酸及矿质元素类等。
麻黄类生物碱中麻黄碱的含量较高,为丙胺类生物碱,该类成分一直以来被认为是麻黄的有效成分。
现代医学研究发现,麻黄具有平喘、抗病毒及免疫调节作用。
近年来又发现,麻黄具有止痛、止遗、止泻、止痒以及对抗急性血瘀证形成的作用[2]。
麻黄主要的化学成分为多种结构相似的苯丙胺类生物碱,该类成分一直以来被认为是麻黄的主要有效成分,至今已经分离出10多种麻黄碱,但在不同种的麻黄中麻黄总碱的含量从1%到3%不等。
2.麻黄化学成分研究概况
黄酮是麻黄属中的一类重要成分,李姿娇等研究发现麻黄总黄酮含量约为0.29%。
麻黄黄酮类主要有:
芦丁、芹菜素、小麦黄素、山奈酚、草棉黄素、槲皮素、无色矢车菊素等。
麻黄挥发油也是麻黄的有效成分之一,主要有1-α-萜品烯醇和2,3,5,6-四甲基吡嗪等,但含量很低。
草麻黄含油量为0.25%,木贼麻黄为0.124%。
张知侠利用气相色谱-质谱联用技术对草麻黄中提取的精油进行化学成分分析,结果鉴定出其成分有49种,其中含量最高的是1-α-萜品烯醇,其次是2,3,5,6-四甲基吡嗪和1,2-二甲基苯[3]。
多糖在不同种的麻黄中含量各不相同,在麻黄草质茎及其果实中,还原性多糖的含量分别为1.05%和7.21%,水溶性糖含量分别为1.93%和1.158%,果实中还原性糖含量比草质茎中的高。
草质茎中水溶性糖的含量比果实中高。
何翔在研究中发现,麻黄多糖具有降血脂、清除自由基、抗氧化及保护肝脏的作用,并且对肝脏的副作用要小于其他药物。
鞣质又称单宁,也是麻黄属植物中一类重要的化学成分,一般认为其主要以缩合型鞣质的形式存在。
现已分离出儿茶酚鞣质等26种缩合鞣质,已发现的有机酸有草酸,香草酸,苯甲酸,肉桂酸,香豆酸,苹果酸,柠檬酸和原儿茶酸等。
麻黄果实有一定的营养及食用价值,研究结果表明麻黄果富含18种氨基酸及较高的半必需氨基酸和非必需氨基酸。
麻黄是驰名中外的传统中药材,也是工业上提取麻黄素的主要原料,具有复杂的化学成分,其主要成分为麻黄碱和伪麻黄碱。
两者作为拟肾上腺素药物已被广泛应用于多种制剂中。
另外,麻黄碱的结构与肾上腺素相似,可直接兴奋α,β受体而发挥肾上腺素作用。
麻黄碱能使心肌收缩力增强,心输出量增加。
还能使胃肠道平滑肌松弛,抑制蠕动,延缓胃肠道内容物的推进及排空。
麻黄的挥发油乳剂对人工发热的兔有解热作用,麻黄碱及麻黄总生物碱对人不能诱发出汗。
(二)内生菌
植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部或细胞间隙的真菌或细菌。
早在十九世纪中期,人们就已经发现并研究健康植物组织内部的微生物。
1866年德国科学家DeBary最早提出了“Endophyte”一词,将其定义为生活在植物组织内部的微生物,用以区分那些生活在健康植物表面的微生物,此定义也包括植物的致病菌和菌根菌[4]。
之后几十年里,人们从牧草中发现了几株内生菌,但由于它们生活在没有外在感染症状的健康植物组织内部,所以其存在和作用长期以来一直被人们忽视。
直到1977年,Bacon等发现了高羊茅内生菌与牛的中毒症状相关,这才引起了人们的关注。
1986年,Carroll把内生菌定义为生活在地上部分,活的植物组织内并不引起明显病害症状的真菌,也进一步说明了内生菌与植物间存在的互惠互利关系,这个内生菌的概念不包括植物致病菌和菌根菌,特指禾本科牧草中属于麦角菌科的不引起症状、系统发生、种子携带的内生菌。
1990年以后,在植物内生菌方面的研究范围更加广泛,不仅研究牧草植物内生菌,而且也从其他植物中分离内生菌,研究其生物多样性、生物学作用、侵染途径及与宿主之间的关系等。
1991年,Petrini将内生菌的定义进行进一步的拓展。
将其定义为对植物组织本身没有产生明显的病害症状的真菌,生长于植物表面的腐生菌、对植物没有伤害的潜伏性病原菌及菌根菌也包括在内。
1996年,Bills认为内生菌还包括内外生菌根菌、假菌根菌和杜鹃菌根菌[5]。
目前比较常用的内生菌概念于2000年由Stone提出:
指那些在生活史的一定阶段或全部阶段生活在健康植物组织的各组织和器官内部的真菌或细菌,被感染的植物(暂时)不表现出外在病症,可以通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内部直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生[6]。
说明,植物内生菌是生活在健康植物内部正常菌群,不仅包括互利共生的共生微生物,也包括潜伏在宿主体内的病原菌。
它泛指一切生活在植物体内的腐生、寄生和共生真菌及细菌等微生物。
可见,植物内生菌是一个生态学概念而不是分类学单位。
植物内生菌的涵义已经延伸到植物微生态学、植物病理学和生物防治等领域。
而相对其他学科来说,植物内生菌的研究缺乏一定的系统性,近年来,随着研究领域的不断拓宽和研究方法的不断深入,植物内生菌所发挥的重要的生态和生理作用及其作为潜在生防资源和外源基因载体,在农业和医药领域中的巨大应用潜力,已经逐渐成为国内外研究的热点[7]。
近几年来,随着对药用植物内生菌的研究的重视,麻黄属植物内生菌也得到了一定的研究。
黄丹红等从内蒙古赤峰等地的麻黄中分离出141株内生真菌,并对其进行体外抗氧化和抗肿瘤等活性研究,结果表明,,有11株内生真菌对H2O2有较好的清除活性,有27株内生真菌对Raji和HepG-2有抗肿瘤活性,除此之外,有74株菌株对一种或两种以上的指示菌有抑菌活性。
古力山·买买提等采用研磨法和琼脂扩散法从新疆有毒植物蓝麻黄(E.glauca)中分离并筛选出一株对多种植物致病菌具有较强抗性的内生细菌XJEG-GB-13[8]。
对其形态和生理生化特征进行检测、16SrDNA测序,将其鉴定为枯草芽孢杆菌的一个亚种。
对该菌进行拮抗作用测定,结果表明,该细菌发酵液对8种植物病原菌具有较强定的抑制作用。
彭辉等采用常规的分离纯化方法从麻黄的草质茎中分离得到5种内生真菌,初步筛选得到可能产生生物碱的菌株MH3和MH5。
进一步研究证明,MH5能产生麻黄生物碱[9]。
由以上事例可以说明,麻黄中含有丰富的内生真菌、细菌、放线菌,是抗氧化、抗肿瘤、抑菌等活性物质的重要来源,为进一步从药用植物中分离筛选出活性成分提供了科学依据。
二.材料与方法
(一)实验材料
从XF、LZ、ZL产麻黄中分离出的内生真菌,保存于兰州理工大学生命科学与工程学院杨林老师实验室。
(二)实验试剂
75%乙醇(山东利尔康消毒科技有限公司);升汞(分析纯,北京化工厂);葡萄糖(分析纯,上海化学试剂厂);琼脂粉(上海山浦化工);注射用硫酸链霉素(100万U,华北制药集团);注射用青霉素(80万U,华北制药集团);二甲基亚砜(DMSO)分析纯(北京博大泰恒公司);注射用丝裂霉素(MMC)(浙江海正药业有限公司);二甲基亚砜(天津富宇精细化工有限公司);磷酸盐缓冲液(天津市大茂化学试剂厂)。
(三)实验仪器
电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司AB104-N),振荡培养箱(国华电器BS-IE),高速离心机(常州国华电器有限公司XYJ-2),循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司),DZF-602型真空干燥箱(上海博迅实业有限公司白银化学试剂厂),超净工作台、培养瓶、手提式高压灭菌锅、镊子、培养皿等、生化培养箱、数显恒温水浴锅﹑烧杯﹑移液枪等。
(四)实验方法
1.内生真菌的分离纯化及保存
(1)培养基配制
马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基:
马铃薯去皮,称重并切成小块,加适量水煮沸30min,纱布过滤,加2%葡萄糖,1.5%-2%琼脂,定容至一定体积。
121℃灭菌30min待培养基温度降到50℃左右时,加入100U/mL的青霉素和硫酸链霉素,用以阻止内生细菌的生长。
斜面培养基:
将煮好的马铃薯培养基装入试管,每支试管装入3.5mL,塞紧棉塞,121℃灭菌30min,将试管倾斜放置,备用。
(2)植物组织的表面灭菌
将所采集到的完整且无破损的植物组织用自来水冲洗干净。
在室内,置于灭菌的滤纸上晾干,麻黄根和茎的样本剪成5mm小段,进行表面消毒。
消毒顺序:
75%乙醇,浸泡3-5min,无菌水冲洗3次;0.1%升汞30s,无菌水冲洗3次。
(3)植物内生真菌的分离及纯化
麻黄根和茎:
表面消毒后,将麻黄的根和茎切去边缘部分,然后切成0.5mm的小段,切割面接种于PDA培养基上,每皿接种4段,做3组平行。
接种好组织块的培养皿置于28℃的恒温箱中避光培养,记录并观察每天的生长状况。
待组织块边缘长出菌丝时,用接种环挑取前端的菌丝接种于新的培养基上,继续在28℃的恒温箱中培养。
最后将纯化后的菌株接种到PDA斜面试管中,4℃保存,备用[10]。
2.菌株活化
按牛肉膏0.3g,蛋白胨1.0g,NaCl0.5g,琼脂1.5g,蒸馏水100mL的比例配制牛肉膏蛋白胨培养基。
取6个锥形瓶各加5mL蒸馏水,包两幅镊子,打好的小滤纸片和培养基一起在121Kpa﹑灭菌30min,待培养基冷却至55℃左右后,在超净台上﹙灭菌30min后﹚倒培养基,每皿约15mL,倒好后放置待用。
将保存的麻黄内生真菌分别接到制备好的培养基上(每株接2皿)。
将接好的菌株放在培养箱中在28℃中培养至长出菌落[11]。
3菌株发酵及样品制备
菌落长好后,选择没被杂菌污染的,挑至PDA液体培养基中培养5-8天[12]。
然后,通过离心对菌液进行分离,分离得到的发酵液分别用乙酸乙酯和正丁醇萃取,回收萃取液中的有机溶剂,得乙酸乙酯和正丁醇浸膏,保存到样品瓶中,备用;菌丝体在50℃烘箱中烘干后用甲醇回流提取3次,每次2h,所得样品烘干,保存,备用[13]。
称取上述所得各样品5mg分别置于样品瓶中,做好标签,用二甲基亚砜(DMSO)配制成5mg∕mL的样液,待用。
同时,配制100µL/mL青霉素与链霉素阳性对照药液,DMSO阴性对照[14]。
在6个分别装5mL灭菌水的锥形瓶中分别接上适量供试菌株-金黄色葡萄球菌,地衣芽孢杆菌,乳链球菌,大肠杆菌,绿脓杆菌,肺炎克雷伯菌,做好标记后振荡均匀配制成菌悬液。
调节菌体浓度至106CFU∕mL[15]。
4抑菌活性测定
用打孔器将滤纸制成直径为6mm的圆片,121℃灭菌30min,用灭过菌的镊子将其放入2.4.2项下制备的待测样品中,充分浸泡后取出,自然晾干。
在倒好的培养基平板中加入制备好的菌悬液各100µL,用涂布棒将菌液涂布均匀,制成含菌平板。
将含样品的滤纸片贴在平板上,每皿贴4个浸有样品滤纸片,每个样品做三个平行。
此外,金黄色葡萄球菌、地衣芽孢杆菌、乳链球菌用的青霉素浸泡过滤纸片做阳性对照,而大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯球菌则用的链霉素做阳性对照[16]。
所有样品都用DMSO浸泡过滤纸片做阴性对照。
完成以后,所有平板置于37℃恒温培养箱中培养24h,采用十字交叉法测定滤纸片的抑菌圈直径大小,比较抑菌效果。
5最小抑菌浓度的测定
用二倍稀释法将乙酸乙酯萃取物﹑正丁醇萃取物和菌体提取物稀释成浓度为2.5mg∕mL﹑1.25mg∕mL﹑0.61mg∕mL﹑0.31mg∕mL﹑0.15mg∕mL的溶液。
按照2.4.4项下的方法进行操作,观察结果,记录数据。
三.结果与分析
(一)抑菌活性筛选结果
对麻黄的34株内生真菌进行发酵,发酵液用乙酸乙酯、正丁醇萃取,菌丝体用甲醇提取,共得到99个样品,并对这些样品进行抑菌活性测定。
测定结果如表1表、2表、3表所示,其中有40个样品对6种指示菌都有抑制效果,占总测试样品的40.4%;10mm<抑菌圈<20mm的样品有25个,占总样品的25.25%,15mm<抑菌圈<30mm的有11个样品,分别是乙酸乙酯部位的XF-G105,XF-J108,XF-J109,XF-J110,LZ-J101,LZ-G201和正丁醇部位的XF-J102,LZ-G201,LZ-J101,菌体部位LZ-J101,LZ-J102占样品总数的11.11%;对6种指示菌抑菌效果最强的为LZ-G201的正丁醇部位,抑菌圈分别是30mm、33mm、24.7mm、32.7mm、31.7mm、28mm。
1.XF﹑LZ﹑ZL产麻黄内生真菌发酵产物乙酸乙酯提取物抑菌结果
XF-G105发酵液的乙酸乙酯萃取部位对金葡菌与大肠杆菌的抑菌圈直径分别为21.3mm与21.7mm,活性较好;XF-J109发酵液的乙酸乙酯萃取部位对肺炎克雷伯菌抑菌圈直径为19.3mm,对其他五种供试菌的抑菌圈直径均大于20mm;XF-J108发酵液的乙酸乙酯萃取部位对供试菌抑菌圈直径在15mm-20mm之间;XF-J110发酵液的乙酸乙酯萃取部位对金葡菌、地衣芽孢杆菌和绿脓杆菌抑菌圈直径在20mm以上,对其他3种供试菌抑菌圈直径在17mm-20mm之间,活性较好;LZ-J101发酵液的乙酸乙酯萃取部位对6种供试菌活性都很好,抑菌圈直径皆在20mm-28mm之间;LZ-G201发酵液的乙酸乙酯萃取部位对6种供试菌活性较好,乳链球菌与大肠杆菌的抑菌圈直径分别为24mm与21.3mm,对另外4种供试菌抑菌圈直径也在15mm-19mm之间。
表1XF﹑LZ﹑ZL产麻黄内生真菌发酵产物乙酸乙酯提取物抑菌结果
供试菌种
抑菌圈直径(mm)
金黄色葡萄球菌
地衣芽孢杆菌
乳链球菌
大肠杆菌
绿脓杆菌
肺炎克雷伯球菌
XF-G101
7.3
-
-
-
-
7
XF-G102
9
7.7
-
-
-
7.3
XF-G103
11.3
8.3
7.3
-
-
8
XF-G104
16.7
14.7
14.3
15
13.7
12
XF-G105
21.7
18.7
19
21.3
20
16.3
XF-G106
-
-
-
7.3
-
7.3
XF-G107
10.0
7.3
8
8.3
-
-
XF-G108
7.3
-
-
-
-
7
XF-J101
9
7
7.3
8.3
7.7
8
XF-J102
9
7.3
7.7
8
-
8
XF-J103
18.3
14.7
14.7
14.3
14.7
13.7
XF-J104
14
11.7
13
13.3
12.3
11.3
XF-J105
11
8.3
10
9.7
9.3
9
XF-J107
14.3
10.3
12
12.3
12
10.7
XF-J108
19
18
18.3
18.7
19.7
15.7
XF-J109
24.7
23.7
21
24
25
19.3
XF-J110
22.3
20.7
19.3
19.7
20.7
17.7
XF-J111
10.3
12.7
8.7
8.3
11.7
10.3
XF-J112
13
12.7
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