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PCR技术的原理
PCR技术的原理
我们知道DNA分子通常是双链的,由互补的核苷酸链组成:
其中碱基A与T配对,C与G配对。
形成的双螺旋结构就像一架微小的螺旋形梯子。
细胞分裂时DNA要复制,在DNA聚合酶的作用下合成了新的DNA分子,最终DNA实现了加倍。
然后在细胞分裂时,等量的DNA就分配到两个不同的细胞中去。
而PCR技术模仿的就是天然DNA在细胞分裂时的复制过程,可用"三步曲"来描述:
(图1)
第一步称为"加热变性"。
即在高温下使DNA的双链解开,彼此分开成为两条单链DNA,作为新的DNA分子合成的模板。
在DNA复制过程中,解开双链这一步是由一种称为"解旋酶"的蛋白质来完成。
第二步称为"退火"。
在对应于模板DNA的特定区段两端的序列部分,合成两条引物(寡核苷酸链),长度通常为几十个核苷酸。
温度降低即"退火"时,引物就附着到模板DNA两侧与引物序列互补配对的地方。
"引物"顾名思义,是在DNA合成时作为"领头羊",下一步的DNA合成就是在"引物"的引导下一个个地将脱氧核糖核苷酸加上去。
第三步称为"延伸"。
引物与模板DNA退火后,DNA聚合酶就在适当的反应温度下促使核苷酸依次按与模板碱基互补配对原则,在引物3'端一个个地连接上去,直至形成一个完整的DNA分子。
经过"三步曲",一个DNA分子解链形成的两个单链同时可以作为模板,分别指导合成了一条新的与之互补的DNA链,一个DNA分子就变成了两个。
这样的一个周期包括一个"三步曲",下一个周期中两个DNA分子就变成了四个。
这个过程可无限地重复下去。
每个周期只需几分钟,恰似一个"链式反应",DNA的数量随着每个周期的完成而成倍地增加,2对变4对,4对变8对,8对变16对,依此类推。
仅仅经过30个周期,最多不过一个下午的时间,模板DNA的数量就能增加10亿倍以上。
图1:
描述了PCR的原理和过程
2PCR反应基本成分
2.1模板DNA
PCR反应的模板可以是单链或双链DNA,可以是基因组DNA或cDNA,mRNA也可作为PCR的模板,只需用逆转录酶把mRNA逆转录为cD—NA即可。
由于PCR反应的特异性由寡聚核苷酸引物决定,模板DNA不需要高度纯化,但应避免任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、能结合DNA的蛋白质及多糖类物质的污染。
选用纯化的DNA做模板,可增加模板分子的浓度,除去可能抑制PCR反应的杂质如SDS会严重抑制TaqDNA聚合酶的活性,可显著提高PCR扩增的有效性。
通常,模板DNA保存于10mm01/LTris—HCl
(pH7.6)、0.1mm01/LEDTA(pH8.0)缓冲液中。
PCR所需模板DNA的量极微(通常在纳克级范围内),通常适宜的模板DNA浓度为30—50ng,不到1纳克的基因组DNA序列就足以用来进行PCR分析,甚至用1个DNA分子就能扩增出特定的DNA序列。
利用PCR技术可以从石蜡包埋40多年的宫颈癌活检组织中检测出人乳头瘤病毒(HPV)DNA,可以用多年前的血斑分析苯丙酮尿症,甚至从几千年的埃及木乃伊中分离出来的DNA也可用作PCR反应的模板。
2.2引物.
PCR引物是一段与待扩增的目标DNA序列侧翼片段互补的寡核苷酸片段,长度大多为10—30个碱基。
通常,一对引物包含5’端与正义链互补的寡核苦菠片段和3’端与反义链互补的寡核苷酸片段,这两个寡核苷酸片段在模板DNA上的结合位置之间的距离决定PCR扩增片段的长度。
根据统计学计算,长约17个碱基的寡核苷酸序列在人类基因组中可能出现的概率为1次。
因此,只要引物不少于16个核苷酸,就能保证PCR扩增序列的特异性。
引物过长往往会降低其与模板的杂交效率,从而减低PCR的反应效率。
PCR反应成功的关键是设计最佳的引物。
引物设计的先决条件是与引物结合的靶DNA序列必须是已知的,与两个引物结合的序列之间的靶DNA序列则未必清楚。
设计引物时应尽可能选择碱基随机分布的序列,尽量避免多嘌呤,、多聚嘧呤或其他异常序列。
两个引物中G十C碱基对的百分比(G十C%)应尽量相似,若待扩增序列中GC含量已知时,引物的GC含量则应与其类似。
一般情况下,设计引物时,G十C碱基对含量以40%—60%为佳,解链温度(meltingtemperature,Tm)高于55℃。
避免引物自身形成发夹结构等二
级结构,尤其是。
两个引物之间不应存在互补序列,尤其是在引物的3’末端,即使无法避免,其3’端的互补碱基也不能多于2个,以减少‘‘引物二聚体”的形成。
否则会影响靶DNA序列的扩增。
在合成新链时,DNA聚合酶将单核苷酸添加到引物的3’末端,因此引物3’端的5—6个碱基与靶DNA片段的配对必须精确、严格。
简并引物是由多种寡核苷酸片段组成的混合物,彼此间有一个或数个核苷酸差异。
简并引物的设计是通过对氨基酸序列或对相关基因的同源序列的推测进行的(陆德如等,2002)。
通常一条引物中的简并碱基不能超过4处,简并碱基数过多,会造成反应体系中有效引物量相对较少,而增加引物的使用量,易引起非特异性扩增。
简并引物与模板错配产生的非特异扩增可通过提高退火温度或“热起动”方法来克服。
由于引物设计涉及的因素较多,因此常场借助PCR引物设计软件如PCGENE、DNAMan进行辅助设计,然后由专业的生物技术公司用DNA合成仪合成。
合成的寡核苷酸引物一般用层析法或聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯化,纯化的引物在25%乙腈溶液中4℃下短暂保存或在—20℃下中长期保存,冻于后则可保存1—2年以上。
在PCR反应中,引物的适宜浓度为0.1—1(mol/L。
引物浓度过高,容易形成非特异性扩增,引物浓度过低,不足以完成30个循环,降低PCR的产量。
通常模板DNA的量较多或高度复杂DNA(Hi8hcomplexityDNA)如人类基因组DNA作模板时,引物浓度应低一些;模板DNA的量较少或低度复杂DNA(1dwcomplexityDNA)如质粒DNA作模板时,引物浓度应高一些。
在分子植物育种实验室中常用的RAPD引物、ISSR引物及SSR引物等一些通用引物均可向专业的生化与分子生物学试剂公司购买,如Promega公司或Invitrogen公司等。
2.3dNTPs
dNTPs(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)是PCR反应中靶DNA序列扩增的原料。
在PCR反
应中每种脱氧核苷三磷酸的浓度以50—200μmol/L为宜,不能低于10—15μmol/L。
浓度过高易引起非特异性PCR产物,当dNTP浓度高于50mmol/L时还会抑制taq酶的活性;浓度过低则影响扩增产量。
4种dNTP的摩尔浓度应相同,不平衡的浓度会导致碱基错配率上升,降低合成速度,导致反应过早终止。
在100μl的标准反应体系中,浓度50μmol/L和200umol/L的dNTP就足以分别合成6.5μg和25μgDNA。
本实验室常用的dNTPs购自Promega公司。
贮存液的浓度为25mmol/ldNTPs混合液,其配制方法是将购自厂商的4种核苷酸等量混合。
2.4DNA聚合酶
最初的DNA聚合酶是从大肠杆菌中提取的DNA聚合酶I的Klenow片段。
该片段具有聚合酶活性和3’一5’外切核酸酶活性,能识别和消除错配的引物末端,以校正复制过程中错配的核苷酸。
但Klenow片段对热敏感,DNA变性温度即可使酶失活,因此在PCR的变性步骤后都必须重新加聚合酶,造成PCR技术操作十分烦琐、耗时费力、反应低效及费用增加。
’
后来,从美国黄石国家公园的温泉中发现的嗜热茵一水生栖热菌(Thermusaquatics,taq)分离出了分子量为60—68kDa,比活性为2,000—8,000U/mg的DNA聚合酶。
以后又分离出分子量约为94kDa,比活性为200,000U/mg的的DNA聚合酶,该酶基因全长2496个碱基,编码832个氨基酸。
由于这些聚合酶具有95℃以上的耐热性,只需在PCR反应开始时加一次聚合酶,就能在整个PCR循环中保持酶活性,大大简化了PCR操作程序,提高了PCR扩增效力、省时省力,从而使PCR技术得到了进一步完善。
目前,商品化的TaqDNA聚合酶均为基因重组技术生产并在PCR反应中广为应用。
由于水生栖热茵在70—75℃下最适生长,因此72℃被认为是TaqDNA聚合酶(94kDa)合成DNA的最适温度,每个酶分子与核昔酸的结合率每秒近150个核昔酸。
在高温条件下,TaqDNA聚合酶仍然具有较高的酶活性,不会发生不可逆变性。
在92.5℃、95℃和97.5℃时,PCR反应中的TaqDNA聚合酶分别经过130min、40min和5—6min后仍可保持50%左右的酶活性。
因此在实际操作时选用的变性温度以92—94℃较为适宜,不宜高于95℃。
在100μ的PCR标准反应体系中,TaqDNA聚合酶的常用浓度为1—2.5U,人类基因组DNA作模板时,TaqDNA聚合酶的适宜浓度范围为1—4U。
酶量过多会导致增加非特异性PCR产物,反之会引起PCR产量不足。
TaqDNA聚合酶作用时需要Mg2+,每次扩增反应必须确定最佳M82’浓度。
由于TaqDNA聚合酶没有3’一5’外切核酸酶活性,缺乏校正错配核苷酸的能力,通常错配率约为2×10—4。
在一般情况下这一错配率并不是一个严重的问题,因为错配产物在PCR总产物中所占比例仍然很小。
但当PCR产物如用于克隆研究时,含有错配核苷酸的产物会导致所有克隆DNA都会带有相同的错配(突变)。
在这种情况下,减低错配率是非常重要的。
通过增加模板分子,减少循环次数和减低DNA合成的总量可减少PCR反应中错配产物的形成,或者使用高保真酶PfuDNA聚合酶。
PfuDNA聚合酶是一种具有高保真性能的高温DNA聚合酶,来源于高温嗜热菌Pyrococcusfuriosis,分子量为90kDa,适用于一般的PCR反应、基因克隆与表达、基因突变分析、全基因合成等。
Pfu酶具有5’一3’的DNA聚合酶活性,还具有3’一5’的外切酶活性,无5’一3’的外切酶活性(保真性),其PCR产物为平末端,扩增速度为600bp/min,最佳延伸温度为65—75℃,dNTP的工作浓度为100—300μmol/l,最佳Mg2’为2—3mmoVl,最佳pH值为8.1—9.1,酶浓度为5U。
与Taq酶相比,Pfu酶扩增效率通常比T明酶略差,这是由的Pfu酶的3’一5’的外切酶活性(高保真)引起的,并非Pfu酶的质量不稳定。
‘用Pfu酶扩增时,引物的纯度要求较高,长度要求大于18bp,Tm在55—58℃之间,引物的浓度在0.1—0.5μmol/l之间,比Taq酶略高。
由于Pfu酶具有
3’一5’的外切酶活性可能会降解引物(特别是溶液中没有dNTP的情况下),因此Pfu酶必须是最后加入到反应中,并立即进行PCR反应。
Pfu酶的热稳定性比Taq酶高。
对于沉含量很高的模板变性温度可提高到98℃,而不会影响Pfu酶的活性。
由于Pfu酶的PCR产物为平末端,不能直接进行T/A克隆,因此可在PCR产物加3’—A后再进行T/A克隆或进行平末端连接。
在100μl标准反应体系中加5UPfu酶。
目前,Pfu酶被公认为取代T叫酶的首选高保真高温DNA聚合酶。
除TaqDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶外,常见的DNA聚合酶还有:
TthDNA聚合酶:
具有5’一3’聚合酶活性和5’一3’外切酶活性,适合于反转录、PCR及RT—PCR;TflDNA聚合酶:
具有5’一3’聚合酶活性和5’一3’外切酶活性,在高温下半衰期较长,适合于PCR、DNA测序和高温下引物延伸;TliDNA聚合酶:
具有5’一3’聚合酶活性和3’一5’校正活性,适合于高保真PCR;P1atiumPfxDNA聚合酶:
具有5’一3’聚合酶活性和3’一5’校正活性,带有耐热的TaqDNA聚合酶抗体,适合于长片段PCR、高保真PCR及热启动PCR5PlatiumDNA聚合酶(高保真):
具有5’一3’聚合酶活性和3’一5’校正活性,带有耐热的TaqDNA聚合酶抗体,适合于长片段PCR、高保真
PCR及热启动PCR。
2.5缓冲液
PCR反应的标准缓冲液通常含有10mmol/LTris—HCl(pH8.3),50mmol/LKCl和1.5mmol/LMgCl2。
这种标准缓冲液在72℃温育时,反应体系的pH值会下降1个多单位,使缓冲液的pH值接近7.2(金冬雁等,1999),基本适用于各种模板、寡核苦酸引物,但对某种模板与引物的特定组合就不一定最佳,用时需再作适当调整(Krawetzetal·,1989)。
——般购买的10×PCR缓冲液分含Mg2’和不含Mg2’两种,不含Mg2’的缓冲液,其25mmol/lMgCl2单独包装或需另行购买,使用时再自行配制。
本实验室常用无Mg2’10×PCR缓冲液贮备液为0.1mol/LTris—HCl(pH8.0),0.5mol/lKCl及1%TritonRx—100。
2.6Mg2’及其它成分
PCR反应体系中Mg2’的浓度十分重要,适宜的Mg2’浓度为高于dNTP总浓度0.5—2.5mmol/L。
当dNTP浓度为0.2mmol/L时,建议Mg2’的浓度为1mmol/L。
Mg2’浓度过高,容易生成非特异性扩增产物;反之,浓度过低会使PCR产量降低。
Mg2’的有效浓度受到高浓度的整合剂如EDTA、高浓度的带负电荷离子基团如磷酸根的影响,它们可与Mg2’结合从而降低Mg2’的有效浓度。
因此,每当首次使用靶序列、引物、dNTP
(含磷酸根)的新组合时,都要将Mg2’浓度调至最佳。
通常的方法是设置一组反应,每一反应的KCL(50mmol/L)和Tris—HCl(10mmol/L)浓度相同,而MgCl2浓度不同(0.05—5mmol/L,每次增加0.5mmol儿),反应结束后,通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳来比较各反应扩增产物的量,从中选出最佳的Mg2’浓度(金冬雁等,1999)。
常用的Mg2’为六水氯化镁(MgCl2·6H20),习向Sigma等公司购买,由于MgCl2极易潮解,应选购小瓶装,启用后勿长期存放。
本实验室通常选用20mmol/lMgCl2,其贮备液的配制为称4.066g六水氯化镁,先加800mlddH20溶解,最
后定容至1L,分装后高压灭菌备用。
在早期用Klenow酶的PCR反应中常要加入10%的二甲亚矾(DMSO),它有利于减少DNA的二级结构,使GC含量较高的模板易于完全变性。
使用TaqDNA聚合酶的PCR反应中,一般都不用DMSO,因为DMSO对TaqDNA聚合酶有轻微的抑制作用,会降低扩增产物的总产量。
也有研究表明,加入DMSO对某些PCR反应有促进作用。
为防止PCR反应过程中反应液体的蒸发,常在反应物上面加一滴矿物油覆盖,以维持反应体系的浓度和热恒定,能保证PC况反应的有效性并增加扩增产量。
3PCR反应程序参数
PCR反应程序参数(即循环参数)是指PCR循环中每一反应步骤的温度、时间和循环次数。
PCR扩增是通过变性(denaturation)、退火(an—nealing)和延伸(extension)三个步骤反复循环来实现的。
因此,确定正确的PCR反应程序参数是PCR成功的保证。
3.1变性温度和时间
变性的目的是要使双链DNA完全解链成单链。
原则上变性步骤要高温、短时,既要保证变性充分,又要保持聚合酶在整个反应中的活性若变性不充分,DNA双链会很快恢复,PCR产物就会明显减少;反之,变性温度过高、时间过长,会加快酶的失活。
典型的变性条件是95℃,时间30秒,对GC含量多的靶DNA序列宜用较高的变性温度。
在解链温度(Tm)下,DNA的变性仅需几秒钟。
Tm值可根据靶DNA中G十C含量,按公式Tm=81.5—16.618[Na+]十0.41(G十C)%—600/N来计算,其中N为链长(金冬雁等,1999)。
模板DNA或PCR产物的变性不完全,是PCR反应失败最常见的一个原因。
3.2引物退火温度和时间
迟火的作用是使模板DNA单链或上一轮的反应产物与引物相结合。
退火温度是指引物与模板特异结合的最佳温度,是任何PCR反应最重要的参数。
引物退火的温度和时间取决于引物的长度、碱基组成及其在反应成分中的浓度。
通常退火温度比引物的解链温度(Tm)低5℃,一般用37—55℃或高一点,时间1min。
通常退火温度越高,PCR扩增特异性越好(陆德如等,2002)。
估算Tm的方法是:
引物为20个碱基以下时,Tm=2℃×(A十T)十4℃×(G十C);引物为20个碱基以上时,Tm=81.5十0.41(G十C)%—600/L,其中L为引物长度。
如GC含量约50%、长20个碱基的典型寡核苦酸引物的最佳退火温度为
55℃。
3.3引物延伸温度和时间
引物延伸是DNA聚合酶将脱氧单核苦酸逐一地加到引物3’—OH末端,依据模板序列合成一条互补新链的过程。
引物延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度。
如用TaqDNA聚合酶,一般用70—75℃。
在72℃时,1min延伸时间足以合成2kb的序列。
延伸时间取决于靶序列的长度、浓度和延伸温度,一般为1—3min。
靶序列越长、浓度越低、延伸温度越低,·则所需的延伸时间越长;反之,所需的延伸时间越短。
在相同的延伸温度下,循环早期因靶序列即酶的底物浓度低,延伸时间要长些。
在循环后期,当PCR产物的浓度超过酶的浓度(1nmol/L)时,酶被底物饱和,为了增加酶的周转利用,延伸时间也要长些。
一般每
1kb碱基的序列,延伸1min即可。
对于扩增100—300个碱基的短序列片段,省去延伸温度这一步骤而采用快速简便的变性、退火双温循环也是实验中常见的。
因为TaqDNA聚合酶即使在变性温度下仍保持很强的酶活性,而延伸过程可在退火温度转变为变性温度的过程中完成。
。
在设定上述参数时,还应考虑所用PCR仪从一种温度转变到另一种温度所需的过渡时间,反应离心管管壁的厚薄而造成的管内温度滞后情况。
3.4循环次数
DNA双链高温变性、引物退火和新链延伸这三个步骤反复循环的次数通常需要25—40个。
若PCR反应中各项参数适宜,其适宜的循环次数主要取决于靶DNA的起始浓度。
表1显示了一个标准反应中不同靶分子数所需的适宜循环次数。
循环次数过多,产物相应增多,但会增加非特异性产物的量及其复杂度;循环次数过少,会降低PCR产量。
4分子植物育种实验室PCR实用方法
PCR反应体积通常在10—100μl,视研究需要而定。
一般按操作管数和反应体系计算出总ddll20、PCR缓冲液、Mg2’、dNTPs、引物和TaqDNA聚合酶等反应组分的量,然后将其混合、摇匀,可用涡旋振荡器充分混匀,再按反应体积分装到各Eppendorf管中,分装完后各管加入模板DNA。
用手指轻弹Eppendorf管底部使溶液混匀,也可用点式离心机快速离心数秒使溶液集中于管底。
视PCR仪器和Eppendorf管的质量考虑是否加矿物油覆盖,然后放入PCR仪中进行PCR反应。
基于PCR的实验方法很多,其所用的反应体系和反应程序各有异同,要视具体情况而定。
以下主要介绍本实验室常用的基于PCR的实验方法,本实验室所用的dNTPs、TaqDNA聚合酶购自Promega公司,、Mg2’、Buffer等试剂自行配
置;RAPD、ISSR随机引物购自加拿大BritishColumbia大学,大豆、棉花的SSR引物全部由In·vitrgen公司合成,自行设计的引物由上海生物工程公司、上海博亚生物工程公司或上海基康生物有限公司合成。
4.1RAPD反应体系及程序
4.1.1基本原理
RAPD(randomamplifiedpolymorphismicDNA,RAPD)即随机扩增片段长度多态性标记,其所用的引物长度通常为9—10个碱基,大约只有常规的PCR引物长度的一半。
使用这么短的引物是为了提高提示DNA多态性的能力。
因引物较短,在PCR发应中必须用较低的退火温度,以保证引物能与模板DNA结合。
瓦AE)D引物已经商品化,可以向有关供应商(如加拿大BritishNumbia大学)直接购买。
商品化的RAPD引物基本能覆盖整个基因组,检测的多态性远远高于RFLP。
RAPD优点是:
DNA需要量少,对DNA质量要求不高;操作简易,不需要接触放射性物质;一套引物可用于不同生物的基因组分析,可检测整个基因组。
其不足之处是:
一般表现为显性遗传,不能区分显性纯合和杂合基因型,因而提供的信息量不完整,重复性较差(方宣钧等,2001)。
4.2ISSR反应体系及程序
4.2.1基本原理
ISSR(inter-simplesequencerepeats,ISSR)即为简单序列重复区间DNA标记技术。
ISSR标记检测的是两个SSR之间的一段短DNA序列上的多态性。
利用真核生物基因组中广泛存在的SSR序列,设计出各种能与SSR序列结合的PCR引物,对两个相距较近、方向相反的SSR序列之间的DNA区段进行扩增。
一般在引物的3’或5’端接上2—4个嘌呤或嘧呤碱,以相同碱基,以对具有相同重复形式的许多SSR座位进行筛选,使得最终扩增出的ISSR片段不致太多。
ISSR技术所用的PCR引物长度在20个核苷酸左右,因此可以采用与常规PCR相同的反应条件,稳定性比RAPD好。
ISSR标记呈孟德尔式遗传,具显性或
共显性特点(方宣钩等,2001)。
4.3SSR反应体系及程序
4.3.1基本原理
SSR(simplesequencerepeats,SSR)即简单重复序列或微卫星标记。
SSR的基本重复单元是由几个核苦酸组成的,重复次数一般为10—50。
同一类微卫星DNA可分布在基因组的不同位置上。
由于基本单元重复次数的不同而形成SSR座位的多态性。
每个SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列,因此可根据两侧序列设计一对特异引物来扩增SSR序列。
经聚丙烯酰胺凝胶电泳,比较扩增带的迁移距离,就可知不同个体在某个SSR座位上的多态性。
SSR标记检测的关键在于必须设计出一对特异的PCR引物。
其优点是共显性,操作简便,稳定可靠,重复性好。
缺点是必须依赖设计引物,开发成本较高。
目前SSR标记已广泛应用于遗传作图、种质鉴定、QTL定位及分子标记辅助育种等(方宣钧等,2001)。
少数SSR引物中两个单引物的退火温度相差
较大,可用Touchdown反应程序:
4.4RT—PCR反应体系和反应程序
4.4.1基本原理
RT—PCR即反转录PCR,其模板为RNA,包括mRNA、tRNA、rRNA及RNA病毒。
一般分两步进行,第一步用反转录酶将RNA反转录成cRNA;第二步以cRNA为模板进行PCR扩增。
据报道已发现一种rTth酶,此酶既有反转录酶活性,又有DNA聚合酶活性。
因此RT—PCR反应可简单到用一种酶和一种缓冲体系在一个反应管内直接扩增贝RNA。
做RT—PCR时要注意扩增产物既可能来源于mRNA,也可能来源于基因组DNA。
解决的办法有两种:
一是设计引物时两引物跨过一个内含子,这样从mRNA和DNA来的PCR产物大小不同,可以在琼脂糖电泳中区别;二是将得到的RNA样品用不含RNA酶的DNA酶预消化,彻底降解其中的DNA。
RNA样品纯化要求高、易降解,因此RT—PCR与以DNA为模板的PCR相比相对要复杂和困难一些(陆德如等,2002)。
4.4.2实验方法
4.5DDRT—PCR反应体系及程序
4.5.1基本原理
mRNA差异显示RT—PCR技术(mRNADifferentialDisplayReverseTranscrition-PolymeraseChainReaction,DDRT-PCR)的原理是所有都有3’端的poly(A)尾,而在poly前面的2个碱基除了倒二位碱基为A外,有12种组合,即5’…NMAAA…AA3’(M=A,C,G;N=A,C,G,T)。
根据此特点设计的3’端锚
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- PCR 技术 原理