4氧和4羟四甲基哌啶氮氧自由基及衍生物抗脂质过氧化作用研究.docx
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4氧和4羟四甲基哌啶氮氧自由基及衍生物抗脂质过氧化作用研究
4-氧和4-羟四甲基哌啶氮氧自由基及衍生物抗脂质过氧化作用研究
摘要 目的:
对6种四甲基哌啶氮氧自由基及衍生物(4-TEMPO)抗脂质过氧化作用进行了实验研究,为其进一步研究及应用于临床作为抗自由基损伤药物提供依据。
方法:
用Fe2+-VitC引发大鼠肝细胞膜、心肌细胞膜、肝线粒体的脂质过氧化,通过TAB比色法测定丙二醛(MDA)含量观测了4-TEMPO抗脂质过氧化作用。
结果:
OTMPO(4-氧-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧自由基)、HTMPO(4-羟-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧自由基)、HTMPOH(4-羟-2,2,6,6-四甲基羟哌啶)、OTMPOH(4-氧-2,2,6,6-四甲基羟哌啶)有较强的剂量依赖性抑制MDA产生的作用,且OTMPOH,HTMPOH较OTMPO,HTMPO作用强,而OTMP(4-氧-2,2,6,6-四甲基哌啶)、HTMP(4-羟-2,2,6,6-四甲基哌啶)无效。
结论:
4-TEMPO有较明显的对抗脂质过氧化作用,作为一种临床抗自由基引起的脂质过氧化损伤的药物研究及开发利用,可能有广泛的前景。
关键词 四甲基哌啶氮氧自由基及衍生物;丙二醛;脂质过氧化;抗脂质过氧化;自由基
Theanti-peroxidationof4-oxy-and4-hydroxy-nitroxidesanditsderivatives
SuJunhua(SuJH),LiDengsong(LiDS),WuYongjie(WuYJ),etal(InstituteofLanzhouMilitaryMedicine,Lanzhou730020)
ABSTRACT OBJECTIVE:
Theanti-peroxidationof4-TEMPO(4-oxy-and4-hydroxy-nitroxides-and-itsderivatives)werestudied.METHODS:
Theanti-peroxidationeffectof4-TEMPOinmembranesformratliver,heartandmitochondriawerecomparedbythedeterminationofmalondialdehyde(MDA)usingTBAcolorimetry.RESULTS:
OTMPO,HTMPO,OTMPOHandHTMPOHinhibitedMDAgenerationwithIC506.27~22.32μmol.L-1indifferenttissues.TheeffectsofOTMPOHandHTMPOHwerestrongerthanOTMPOandHTMPO.OTMPandHTMPhadnoeffect.CONCLUSION:
Theresultsshowedthat4-TEMPOwereeffective,Thedosageandefficacywereobviouslycorrelated.Thereforeitmaybenecessarytostudyitfurther.
KEY WORDS 4-Oxy-and4-hgdroxy-nitroxides,malondialdehyde,lipidperoxidation,antioxidation,freeradicals
氧自由基,包括超氧阴离子自由基()和羟自由基(OH.)等,它们能与蛋白、脂质、碳水化合物及核酸等进行反应,特别是自由基链与细胞质膜的脂类发生反应,导致细胞质膜的脂质过氧化进而扩散至整个细胞引起严重的损伤[1]。
而这种损伤与人类衰老、肿瘤、心、脑血管疾病、糖尿病等有直接关系。
4-TEMPO曾应用于自旋标记技术[2]及辐射化学[3],化学性质稳定,低毒、无致癌及致突变作用[4],故对其进行了一些药理研究,发现其有抗H2O2诱导的红细胞溶血作用[5],对白血病细胞DNA合成具有明显的抑制作用[4]。
有研究证实其能抗大鼠组织匀浆的脂质过氧化,但国内这方面的研究报道较少。
我们从不同测试系统,不同细胞水平对4-TEMPO抗脂质过氧化清除氧自由基的作用进行了进一步探讨,旨在为其今后的研究方向及开发利用提供参考依据。
1 材 料
由兰州大学化学系国家重点实验室合成并提供:
①OTMP:
4-氧-2,2,6,6-四甲基哌啶(4-oxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine)。
②OTMPO:
4-氧-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧自由基(4-oxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidinooxyl)。
③OTMPOH:
4-氧-2,2,6,6-四甲基羟哌啶(4-oxy-2,2,6,6-tetramethyl-1-hydroxypiperidine)。
④HTMP:
4-羟-2,2,6,6-四甲基哌啶(4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine)。
⑤HTMPO:
4-羟-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧自由基(4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidinooxyl)。
⑥HTMPOH:
4-羟-2,2,6,6-四甲基羟哌啶(4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-1-hydroxypiperidine)
硫代巴比妥酸(TBA)、三氯醋酸(TCA)、维生素C、硫酸亚铁、三羟甲基氨基甲烷(Tris)均为国产分析纯。
Wistar大鼠,♂,体重200~250g,由兰州医学院实验动物中心提供。
2 方 法
2.1 组织匀浆的制备
2.1.1 心肌、肝细胞膜的制备 按Wolf等方法稍加改良。
大鼠断头处死,分别将心、肝置于4℃的SEGT缓冲液(250mmol.L-1蔗糖,Tris-HCl5mmol.L-1,pH7.2)洗净血液成分,滤纸吸水,称重,剪碎,经组织匀浆器制成匀浆,尼龙网过滤,以500r.min-1离心10min。
取上清加入SEGT混匀,再以4000r.min-1离心10min,取沉淀加Tris-KCl混匀,最后再以4000r.min-1离心10min,取沉淀制成10%的匀浆,4℃贮存备用,以Commassia氏亮蓝法[6]测定匀浆蛋白含量。
2.1.2 肝线粒体的制备[6] 先按上法制成肝组织匀浆,然后以2750r.min-1在低温离心机离心10min,取上清,再以10600r.min-1离心10min,取沉淀,加入Tris-KCl混匀,以10600r.min-1离心10min,沉淀制成匀浆,4℃贮存备用,以Commassia氏亮蓝法测定匀浆蛋白含量。
2.2 脂质过氧化实验
实验设空白、对照及4-TEMPO各组,每组平行4管,各组均加入10%心、肝细胞膜、肝线粒体匀浆1ml,体积分数为DMSO0.05ml,37℃孵育10min后,对照管、4TEMPO分别加入Fe2+-VitC,空白加入水0.05ml,37℃孵育30min,各组各加体积分数为20%TCA0.3ml,0.1mol.L-1HCl2ml,10g.L-1TBA1ml,92~95℃煮沸15min。
室温冷却后以3500r.min-1离心10min,以蒸馏水调零,用721分光光度计在532nm比色,按下式求丙二醛(MDA)抑制率。
3 实验结果
大鼠肝细胞膜、心肌细胞膜、肝线粒体在37℃孵育40min有自发性MDA生成。
用Fe2+-VitC诱导后产生MDA明显升高,二者相差显著,均P<0.01。
除OTMP,HTMP对MDA没有抑制作用外,OTMPO,HTMPO,OTMPOH,HTMPOH有明显的抑制MDA产生的作用,与对照组相比相关显著,均P<0.05或P<0.01。
从IC50和相关系数可以看出,除OTMP,HTMP无效外,OTMPO,HTMPO,HTMPOH,OTMPOH均有明显的剂量依赖性抑制MDA的作用,剂量效应相关性良好,OTMPOH,HTMPOH的IC50值小于OTMPO,HTMPO,而心肌细胞膜、肝细胞膜、肝线粒体IC50的值依次减小。
结果见表1。
表1 4-TEMPO对Fe2+-VitC诱发大鼠心肌、肝细胞膜、肝线粒体MDA的影响
药物
MDAnmol.mg-1蛋白
/μmol.L-1
HTMPOH
OTMPOH
HTMPO
OTMPO
HTMP
OTMP
心肌细胞膜
空白
0.597±0.0311)
0.633±0.1211)
1.526±0.0431)
1.763±0.0371)
1.787±0.0861)
1.603±0.3121)
对照
2.763±0.124
2.674±0.214
2.500±0.045
2.534±0.012
2.897±0.127
2.793±0.327
160
0.674±0.3561)
0.603±0.4071)
1.576±0.0921)
1.835±0.1211)
2.864±0.177
2.797±0.423
80
1.001±0.4261)
1.120±0.0481)
1.833±0.0751)
1.923±0.1131)
2.881±0.236
2.799±0.501
40
1.393±0.4171)
1.433±0.2161)
1.987±0.0891)
2.085±0.1061)
2.892±0.241
2.791±0.362
20
1.858±0.1711)
1.628±0.2081)
2.089±0.0721)
2.222±0.1021)
2.884±0.301
2.796±0.422
10
2.248±0.1121)
1.793±0.4332)
2.172±0.0211)
2.293±0.1032)
2.890±0.421
2.793±0.329
5
2.456±0.1302)
2.135±0.0182)
2.250±0.1042)
2.369±0.218
2.886±0.317
2.792±0.321
2.5
2.605±0.362
2.406±0.137
2.354±0.161
2.449±0.216
2.885±0.330
2.791±0.463
1.25
2.681±0.175
2.528±0.412
2.440±0.207
2.495±0.263
2.889±0.174
2.799±0.302
肝细胞膜
空白
0.641±0.3161)
0.772±0.2601)
0.648±0.0281)
1.833±0.1321)
0.643±0.1371)
0.732±0.0211)
对照
2.498±0.201
2.059±0.105
2.871±0.109
2.887±0.127
2.523±0.263
2.431±0.323
160
0.802±0.4271)
0.564±0.0841)
0.667±0.0351)
1.839±0.3131)
2.508±0.189
2.429±0.407
80
1.019±0.4101)
0.982±0.1281)
1.107±0.0291)
2.031±0.3662)
2.512±0.263
2.430±0.312
40
1.315±0.2171)
1.389±0.2172)
1.531±0.0451)
2.249±0.3032)
2.526±0.316
2.421±0.418
20
1.561±0.3262)
1.411±0.1031)
1.875±0.2151)
2.445±0.1892)
2.531±0.321
2.433±0.320
10
1.711±0.1071)
1.425±0.2152)
2.309±0.1041)
2.603±0.0502)
2.523±0.217
2.458±0.121
5
1.922±0.1032)
1.443±0.1101)
2.432±0.1082)
2.649±0.0292)
2.530±0.310
2.416±0.234
2.5
2.129±0.416
1.708±0.216
2.611±0.1142)
2.753±0.134
2.518±0.203
2.435±0.327
1.25
2.337±0.335
1.952±0.158
2.778±0.094
2.834±0.139
2.535±0.102
2.427±0.219
肝线粒体
空白
0.901±0.0361)
0.611±0.1231)
0.878±0.0271)
0.665±0.0341)
0.332±0.0761)
0.526±0.0181)
对照
3.101±0.267
2.910±0.214
2.931±0.017
2.710±0.099
1.868±0.326
1.709±0.123
160
0.832±0.0151)
0.591±0.1121)
0.707±0.2031)
0.885±0.0131)
1.599±0.327
1.403±0.203
80
1.415±0.1011)
0.781±0.1881)
1.221±0.1781)
1.136±0.2001)
1.587±0.416
1.410±0.426
40
1.633±0.3621)
0.904±0.2071)
1.675±0.3291)
1.450±0.4121)
1.593±0.317
1.408±0.327
20
1.839±0.2111)
1.223±0.1071)
2.084±0.2171)
1.616±0.2561)
1.596±0.206
1.405±0.371
10
1.903±0.1031)
1.534±0.2901)
2.164±0.1261)
1.852±0.3632)
1.598±0.402
1.406±0.321
5
2.117±0.1841)
1.801±0.0971)
2.704±0.1022)
1.945±0.1381)
1.594±0.217
1.411±0.267
2.5
2.245±0.3952)
2.234±0.410
2.874±0.197
2.497±0.123
1.590±0.321
1.407±0.326
1.25
2.331±0.427
2.544±0.307
2.892±0.124
2.639±0.382
1.597±0.367
1.412±0.363
注:
与对照组相比,1)P<0.01,2)P<0.05
从4-TEMPO对MDA的抑制率可以看出OTMPO,HTMPO,OTMPOH,HTMPOH有明显抑制MDA的作用,且OTMPOH,HTMPOH的作用强于OTMPO,HTMPO。
见表2。
表2 4-TEMPO对Fe2+-VitC诱发大鼠MDA的抑制率.%
药物
/μmol.L-1
HTMPOH
OTMPOH
HTMPO
OTMPO
心肌细胞膜
160
96.45
101.46
94.86
90.66
80
81.34
76.13
68.48
79.25
40
63.25
60.80
52.66
58.23
20
41.78
51.25
42.19
40.47
10
23.78
43.16
33.67
31.25
5
14.17
26.41
25.66
21.40
2.5
7.29
13.13
14.98
11.02
1.25
3.78
7.15
6.16
5.05
肝细胞膜
160
91.33
116.16
99.14
99.43
80
79.64
83.68
79.35
81.21
40
63.70
52.05
60.28
60.53
20
50.46
50.35
44.80
41.93
10
42.38
49.26
25.28
26.94
5
31.01
47.86
19.74
22.58
2.5
19.87
27.27
11.70
12.71
1.25
8.67
8.31
4.18
5.02
肝线粒体
160
103.14
103.11
108.33
89.24
80
76.63
94.66
83.29
76.97
40
66.73
89.20
61.18
61.61
20
57.36
75.01
41.25
53.49
10
54.45
61.18
37.36
41.96
5
44.72
49.31
11.05
37.40
2.5
38.90
30.06
2.78
10.42
1.25
35.00
16.27
1.89
3.47
从IC50和相关系数可以看出,除OTMP,HTMP无效外,OTMPO,HTMPO,HTMPOH,OTMPOH均有明显的剂量依赖性抑制MDA的作用,剂量效应相关性良好,OTMPOH,HTMPOH的IC50值小于OTMPO,HTMPO,而心肌细胞膜、肝细胞膜、肝线粒体IC50的值依次减小。
结果见表3。
表3 4-TEMPO对Fe2+-VitC诱发大鼠心肌、肝细胞膜、肝线粒体MDA抑制作用的IC50及相关系数
心肌细胞膜
肝细胞膜
肝线粒体
IC50
r
IC50
r
IC50
r
OTMP
无效
无效
无效
HTMP
无效
无效
无效
OTMPO
21.73
0.986
19.46
0.978
16.95
0.990
HTMPO
22.32
0.977
20.11
0.980
18.99
0.976
OTMPOH
16.22
0.988
10.93
0.924
6.27
0.990
HTMPOH
21.49
0.977
15.55
0.977
6.60
0.955
4 讨 论
氧自由基是正常组织中氧的代谢产物,生成和被清除处于动态平衡,但在病理状态下,机体对氧自由基的清除能力下降,过量的氧自由基与组织成分尤其是细胞质膜的脂类发生反应,导致细胞质膜的脂质过氧化,造成一系列损伤,其参与机体多种病理过程,危害巨大。
本实验用Fenton反应产生羟基自由基(OH.),OH.与细胞质膜反应造成细胞质膜脂质过氧化,生成丙二醛,用4-TEMPO抗脂质过氧化,通过MDA的变化观测其的抗脂质过氧化的能力。
实验结果表明,大鼠心肌细胞膜、肝细胞膜、肝线粒体在37℃孵育40min自发产生MDA分别平均为(1.318±0.553)nmol.mg-1蛋白、(0.878±0.470)nmol.mg-1蛋白、(0.6520±0.215)nmol.mg-1蛋白;用Fe2+-VitC诱导后MDA产生量分别平均为(2.693±0.155)nmol.mg-1蛋白、(2.544±0.308)nmol.mg-1蛋白、(2.538±0.595)nmol.mg-1蛋白。
心肌细胞膜自发和诱导产生MDA的量都是最高的,其次为肝细胞膜、肝线粒体。
4-TEMPO对MDA有明显的抑制作用,在5μmol.L-1最小有效剂量及以上各剂量组与对照组相比相差显著,均P<0.05,P<0.01。
且HTMPOH,OTMPOH较HTMPO,OTMPO的抑制作用强。
从IC50值可以看出,心肌细胞膜的IC50值最高,其次是肝细胞膜、肝线粒体,且HTMPOH,OTMPOH较HTMPO,OTMPO为高。
上述结果可以得出以下结论:
①.4-TEMPO对MDA的抑制率有明显的剂量效应依赖关系,二者相关良好。
②.4-TEMPO对MDA的抑制作用与其的结构有关,无论从抑制率或是IC50值来看,HTMPOH,OTMPOH均较HTMPO,OTMPO的作用强。
③.MDA的产生有组织特异性,大鼠心肌细胞膜自发及诱导产生MDA的量最高,其次为肝细胞膜、肝线粒体,而心肌细胞膜的IC50值最高,其次为肝细胞膜、肝线粒体,故4-TEMPO的抗脂质过氧化作用心肌细胞膜不如肝细胞膜、肝线粒体,提示心肌组织易受自由基损伤,是临床治疗防护的重点。
鉴于4-TEMPO低毒、无致突变作用,所以作为临床抗自由基损伤的药物进行深入的研究是有必要的。
作者单位:
苏军华 李等松(兰州730020兰州军区后勤部军事医学研究所)
吴勇杰(兰州730000兰州医学院)
王绪明(兰州730020兰州军区解放军医学高等专科学校)
田暄(兰州730000兰州大学化学系国家重点实验室)
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- 甲基 哌啶 自由基 衍生物 抗脂质 过氧化 作用 研究