sdspage操作方法资料.docx
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sdspage操作方法资料
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SDS-PAGE教程
1SDS-PAGE原理
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基硫酸钠),
SDS会与变性的多肽,并使蛋白带负电荷,由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关,因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关,在达到饱和的状态下,每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KDa到200KDa之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式:
logMW=K–
bX,式中:
MW为分子量,X为迁移率,k、b均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
SDS-PAGE[Laemmli法]
这种方法帖出来,大家是不是感觉非常的陌生呢?
其实这种发方法很普遍,现在大部分的实验室都是用Laemmli法跑电泳的。
如今实验室中用的最多的蛋白电泳是源于Laemmli于1970年发表在nature上的一篇文章中的方法,这篇文章很特别,不仅被引用的次数较多,而且该篇并不是专门阐述蛋白电泳方法上的提出和改进问题,而是对噬菌体头部包装过程中的蛋白进行分析过程中用到电泳分析方法而已,所以阐述如何操作的文字只有那么一小段(但相当经典),这是SDS-PAGE(不连续系统)的首次成功应用。
现在我们在实验室进行的SDS-PAGE试剂的配方仍然是沿用了它的数据,许多论文在描述其SDS-PAGE时引用Laemmli方法,目前常用的具有浓缩胶和分离胶的不连续SDS-PAGE的基础的确来自Laemmli方法,但也略有差别例如一些缓冲液的具体组成。
你也许会恍然大悟:
原来我们用的就是Laemmli!
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各试剂配制方法SDS-PAGE
Acrylamidew/v)30%聚丙烯酰胺溶液-----30%(【组分浓度】
各种组分名称
(g)体积(mL)或质量
备注
30?
r-Bis(29:
1)
100mL
(100mL)实验室配制时用量
29%Acrylamide(丙烯酰胺)
29g
29.2g
)
1%BIS(N,N'-亚甲丙烯酰胺10%(w/v)SDS
【组分浓度】
1g
0.8g
【配制方法】)的去离子水中,充37℃左右亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热(-将29克丙烯酰胺和1克N,N'℃避光(用铝4m微孔滤膜过滤除菌和杂质,储于棕色瓶,100ml分搅拌溶解,补加水至终体积为。
0.45μ,因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不7.0pH不得超过箔纸包扎起来)保存。
严格核实得超过两个月,隔几个月须重新配制。
如有沉淀,可以过滤。
【保存条件】4℃避光(用铝箔纸包扎起来)保存【注意事项】
亚甲丙烯-称量丙烯酰胺和丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收,其作用具有累积性。
N,N'酰胺时应戴手套和面具。
可认为聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为它还可能含有少量未聚合材料。
buffer)(浓缩胶(1MTris-HClpH6.8)1MTris-HCl
【组分浓度】
备注用量名称
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12.1gTris
80ml去离子水
)预实验已确定(36%的浓盐酸9ml浓盐酸
100ml后,室温保存加入去离子水定容至去离子水
【配制方法】
pHHCl调节至所需要的12.1gTris碱溶于80mL的去离子水,充分搅拌溶解,加约9mL的浓称量TrispH值,因为值,将溶液定容至100mL,高温高压灭菌后,室温保存。
应使溶液冷却至室温后再调定0.03个单位。
值随温度的变化差异很大,温度每升高1℃,溶液的pH值大约降低溶液的pH【保存条件】室温保存。
【注意事项】对人体有刺激性,请注意适当防护。
buffer)分离胶1.5MTris-HCl(pH8.8)(1.5MTris-HCl
【组分浓度】
备注名称用量
18.17gTris
80mL去离子水
预实验已确定(36%的浓盐酸)3mL浓盐酸
后,室温保存加入去离子水定容至100mL去离子水100mL【配制方法】
pH调节至所需要的3mL浓HCl称量18.17gTris碱溶于80mL的去离子水中,充分搅拌溶解,加约100mL值,将溶液定容至,高温高压灭菌后,室温保存。
【保存条件】室温保存【注意事项】
℃,温度每升高1pH值,因为Tris溶液的值随温度的变化差异很大,应使溶液冷却至室温后再调定pH0.03个单位。
溶液的pH值大约降低
溶液-----10%(w/v)SDS10%十二烷基硫酸钠SDS
备注名称用量1gSDS
后,室温保存加入去离子水定容至10ml8mL
去离子水
【配制方法】℃加热溶解,的去离子水,于6816100~200mL烧杯中,加入约mL置于2称取g高纯度的SDS后,室温保存。
7.2,定容至20mL至滴加浓盐酸调节pH【保存条件】室温保存【注意事项】
对人体有害,请注意防护。
-----10%(w/v)APS过硫酸铵溶液10%
(APS)
过硫酸铵【组分浓度】10%(w/v)
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用量备注名称
0.1g过硫酸铵现配现用1mL
去离子水【配制方法】
过硫1g离心管,加1mL去离子水吹打溶解,亦可以加倍,即称取称取0.1g过硫酸铵置于1.5mL℃保存。
10mL的去离子水后搅拌溶解。
4酸铵,加入【保存条件】4℃保存【注意事项】
℃保存时,可使用2周左右,超过期限会失去催化作用。
10%过硫酸铵溶液在4
(SDS-PAGE电泳缓冲液)5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液-----5×Tris-Glycinebuffer
【组分浓度】
各种组分名称
(g)(mL)或质量配制不同体积所需各成分的体积
1000ml
500ml
0.125MTris
15.1g
1.25Mglycine(甘氨酸)
94.0g
0.5%(W/V)SDS
5.0g
【配制方法】蒸馏水或去离子水溶解,充分搅拌,用800mL甘氨酸(glycine),5.0gSDS称取15.1gTris,94.0g5倍。
0.125mol/LTris-1.25mol/L甘氨酸电极缓冲液。
临用前稀释1000mL溶解,定容至,室温保存。
得【保存条件】室温保存,两年有效。
【注意事项】
配制好的电泳液使用时间不宜超过两周。
次,但为了取得最佳的电泳效果,应使用新电泳液。
电泳缓冲液可以回收,回收后可再使用1-2
SDS-PAGELoadingBufferSDS-PAGE加样缓冲液-----5×5×【组分浓度】;0.25MTris-HCl(pH6.8);10%(W/V)SDS;溴酚蓝)0.5%(W/V)BPB(甘油;50%(V/V)
)
0.5MDTT(二硫苏糖醇-β巯基乙醇(2-ME)或5%(W/V)
各种组分名称
配制用量
备注
总体积
10mL
1MTris-HCl(pH6.8)
2.5mL
SDS
1g
BPB(溴酚蓝)
50mg
甘油
5mL
2-ME/小份,保存一个月左右。
0.5mL/份)分装,室温保存,使用前加25μL(
巯基乙醇(2-ME)β-
0.5mL
【配制方法】
塑料离10mL2.5mL25mgBPB0.5gSDSpH6.81.25mL1MTris-HCl量取(),,,甘油,置于精品文档.
精品文档2-ME25μL的使用前将,小份(0.5mL/份)分装,于室温保存。
心管中,加去离子水溶解后,定容至5mL的LoadingBuffer可在室温下保存一个月左右。
加入到每小份中。
加入2-ME【保存条件】-20℃保存,至少一年有效。
【注意事项】
巯基乙醇,有轻微刺激性气味,必须完全溶解后再使或β-SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)中含少量DTTDTT-巯基乙醇。
的刺激性和毒性都低于β-巯基乙醇,且粉末的稳定性也高于β但用。
二者作用相似,DTT
1-10mM。
DTT价格略高一些。
蛋白巯基还原实验DTT的常用工作浓度是但的最佳工作pH范围为7.1-8.0,
实验室常规试剂配制方法摘自Takara商品目录--
TEMED原液直接使用
R-250染色液考马斯亮蓝【组分浓度】冰醋酸异丙醇,10%(v/v)考马斯亮蓝R-250,25%(v/v)0.1%(w/v)
各种组分名称【组分浓度】0.4%(w/v)AgNO名称
(g)
(mL)或质量配制不同体积所需各成分的体积0.04%(w/v)NaOH,·HO,1%(v/v)浓NH233用量备注
20%AgNO3HONH浓·
1000ml2mL1mL
备注
考马斯亮蓝R-250234%NaOH
1.0g1mL
可以多加点,最好在摇床上摇摇,多溶解些。
异丙醇
250mL
搅拌溶解,可用甲醇或乙醇替代。
甲醇固定效果好,但甲醇难闻且对身体有害。
乙醇浓度太大会使胶皱缩。
冰醋酸
100mL
搅拌均匀
去离子水
650mL
搅拌均匀,滤纸快速过滤除去颗粒物,室温保存
考马斯亮蓝R250染色,染色时间控制在0.5-1h。
(注意:
(1)保存考马斯亮蓝R250可回收使用,可保存很长时间,但一般不超过6个月;
(2)染色时间过长难以脱色,过短染色效果不佳;)
考马斯亮蓝染色脱色液
【组分浓度】乙醇5%(v/v)10%(v/v)醋酸,
名称用量备注
100mL冰醋酸
一般加的量与染色液相同,只是不加R-250250mL乙醇
充分混匀后使用650mL
去离子水脱色(三个小时后应换次脱色液,再重新加入脱色液且约需脱色24小时,直到背景清晰为止)
(1)蒸馏水中冲洗2-3次
(2)7%冰乙酸固定
(3)7%冰乙酸10%乙醇83ml蒸馏水脱色
(4)7%冰乙酸保存(要检测脱色后的胶,则需保存于7%冰乙酸中)
蒸馏水冲洗→7%冰乙酸(关键步骤),10%乙醇脱色
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蒸馏水%冰乙酸,10%乙醇,83ml脱色液:
7%冰乙酸保存且约二~四天后再照胶,条带更为清晰)。
7%冰乙酸保存(蒸馏水冲洗后用7银氨染色用凝胶固定液(质谱用)【组分浓度】甲醇,10%(V/V)醋酸50%(V/V)
备注用量名称
500mL甲醇
100mL醋酸
充分混匀后室温保存400mL
去离子水
银氨染色用凝胶处理液【组分浓度】戊二醛甲醇,10%(v/v)50%(v/v)
备注用量名称
50mL甲醇
10mL戊二醛
充分混匀后室温保存40mL
去离子水
银氨染色用凝胶染色液
充分混匀后室温保存96mL
去离子水
【配制方法】
取上述试剂加入100~200mL的试剂瓶中,均匀混合。
该溶液应为无色透明状。
如果氨水浓度过低时溶液会呈混浊状,此时应补加浓氨水直至透明。
本染色液应现用现配,不宜保存。
银氨染色用显影液
【组分浓度】甲醛柠檬酸,0.02%(v/v)0.005%(w/v)
名称用量备注
50mg柠檬酸
0.2mL甲醛
定容至1L后充分混匀,室温保存去离子水
SDS-PAGE凝胶配方
1)根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度,再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶(即下层胶):
丙烯酰胺在凝胶中的百分比分离胶最佳分离范围
5%60-212kDa
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30-120kDa7.5%
18-75kDa10%
12-60kDa12%
15-45kDa
15%
来源于《蛋白质技术手册》汪家政
每种浓度的变性胶的分离范围不是指能跑出哪个范围分子量的蛋白质,而是指在这个区间也就是线性关系,为了数据的可靠性,大家尽量根内,蛋白质迁移率基本和分子量成正比,据这个来选择自己配胶的浓度。
成分
分离胶所需各成分的体积(毫升)配制不同体积SDS-PAGE
胶6%
5
10
15
20
25
30
40
50
蒸馏水
2.6
5.3
7.9
10.6
13.2
15.9
21.2
26.5
30?
r-Bis(29:
1)
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
8.0
10.0
1.5MTris,pH8.8
1.3
2.5
3.8
5.0
6.3
7.5
10.0
12.5
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
10%过硫酸铵
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
TEMED
0.004
0.008
0.012
0.016
0.02
0.024
0.032
0.04
成分
SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升)配制不同体积
8%胶
5
10
15
20
25
30
40
50
蒸馏水
2.3
4.6
6.9
9.3
11.5
13.9
16.5
23.2
30?
r-Bis(29:
1)
1.3
2.7
4.0
5.3
6.7
8.0
10.7
13.3
1.5MTris,pH8.8
1.3
2.5
3.8
5.0
6.3
7.5
10
12.5
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
过硫酸铵10%
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
TEMED
0.003
0.006
0.009
0.012
0.015
0.018
0.024
0.03
成分
分离胶所需各成分的体积(毫升)配制不同体积SDS-PAGE
10%胶
5
10
15
20
25
30
40
50
蒸馏水
1.9
4.0
5.9
7.9
9.9
11.9
15.9
19.8
30?
r-Bis(29:
1)
1.7
3.3
5.0
6.7
8.3
10.0
13.3
16.7
1.5MTris,pH8.8
1.3
2.5
3.8
5.0
6.3
7.5
10.0
12.5
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
过硫酸铵10%
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
TEMED
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.016
0.02
成分
SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升)配制不同体积
胶12%
5
10
15
20
25
30
40
50
蒸馏水
1.6
3.3
4.9
6.6
8.2
9.9
13.2
16.5
30?
r-Bis(29:
1)
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
16.0
20.0
1.5MTris,pH8.8
1.3
2.5
3.8
5.0
6.3
7.5
10.0
12.5
10%SDS
0.05
0.01
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
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过硫酸铵10%
0.05
0.01
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
TEMED
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.016
0.02
成分
分离胶所需各成分的体积(毫升)配制不同体积SDS-PAGE
胶15%
5
10
15
20
25
30
40
50
蒸馏水
1.1
2.3
3.4
4.6
5.7
6.9
9.2
11.5
30?
r-Bis(29:
1)
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
20.0
25.0
1.5MTris,pH8.8
1.3
2.5
3.8
5.0
6.3
7.5
10.0
12.5
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
10%过硫酸铵
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
TEMED
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.016
0.02
胶。
即可配制成非变性PAGE注:
如果配制非变性胶,参考上述配方,不加10%SDS):
的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶1)按照如下表格配制SDS-PAGE
成分
浓缩胶所需各成分的体积(毫升)配制不同体积SDS-PAGE
浓缩胶5%
1
2
3
4
5
6
8
10
蒸馏水
0.68
1.4
2.1
2.7
3.4
4.1
5.5
6.8
30?
r-Bis(29:
1)
0.17
0.33
0.5
0.67
0.83
1.0
1.3
1.7
1MTris,pH8.8
0.13
0.25
0.38
0.5
0.63
0.75
1.0
1.25
10%SDS
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.08
0.1
10%过硫酸铵
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.08
0.1
TEMED
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
0.008
0.01
TBST缓冲液体积中含:
2L每
100mL1MTrisHCL(pH7.5)
16gNacl
0.4gKCL
1ml吐温用的缓冲溶液。
Westernblot抗体去除液1)
50mL抗体去除液中含:
每
6.25mL)pH6.80.5MTrisHCL(10mL
10%SDS
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0.175mLBeta-ME
33.75mL
水
操作方法SDS-PAGE
5min。
按照上面配方制,在80℃水浴锅中煮收集液,加入1、20uL5×样品缓冲液5ulSDS-PAGE凝胶,安装好电泳仪,在槽中加入电极缓冲液。
电泳玻璃板间隙厚度不同,选择加SDS-PAGE3、按一定顺序在加样孔中加入样品,根据<20ul/孔的上样量间隙孔,1mm10入样品量,一般0.75mm间隙15孔的上样量<10uL/孔。
上样量根据实际经验自己掌握。
至120v左右),待样品跑过压缩胶后将电压调到4、打开电源将电压调到80v(一般15min
样品电泳到胶底部为止。
3h-、将凝胶小心取下放入容器中,加入染色液,用摇床摇25、待条带清晰后倒出染色液,加入脱色液过夜6QualityOne,或者相应的成像系统拍照、分析、估算蛋白浓度。
7、将脱色液倒掉,可以用
温度降低胶的凝结速度受温度影响很大,随着温度的升高,凝结速度越来越快,SDS-PAGE则反之。
所以,夏天时胶凝结的比较快,而冬天胶的凝结速度则变慢,甚至不能凝结,解决可很冬天在原配方的基础上加倍过硫酸铵和TEMED的使用量,此类问题较可行的方法是:
好的解决胶凝结速度过慢的问题。
SDS-PAGE中添加甘油或者尿素来提高分辨率的成功经验,在普通的借鉴Tricine-SDS-PAGE的甘油,同样可以提高分辨率,有效防止小分子量蛋白的弥散。
只要把原来中加入约13%60%的甘油,就可以了。
配方中的水换成
特别是对分离糖蛋白的时加上尿素和甘油改变胶的孔径!
在分离胶中加尿素和甘油都可以,另一方面对分离小分子量的蛋候很有用处!
一方面可以把条带压窄,减少拖尾现象的产生,分子9KD/12ml3g尿素分离胶!
自己可以跑来实验一下你跑白有好处!
一般加的量在0.5-电泳来跑!
也可以在分离胶中加尿素!
以我经验来看,加tricine-sds-page量的蛋白,建议用尿素会好于甘油!
10电泳在二液槽中安放铂金丝电极;正极在下,负极在上。
接通电源进行电泳,电场强度厘米左右,视室温高低而定。
室温较高时宜用较低的电压以免发热过度影响分离。
蛋白/伏1-2质向正极移动。
待染料前沿移动至管底近处,停止电流。
电泳时间为小时。
秒,使染色液微热即可(千万不要加热太久,否加入染色液后,先放入微波炉里加热5-10分钟,最多半小时就染好了。
脱色也很简单,20。
然后放水平摇床上摇则冰醋酸就挥发了)然后将水倒掉,再换上新的去分钟左右,不用脱色液,直接用去离子水,放微波炉里煮沸5离子水煮,这样反复几次,就可以了。
效果可能比正常的脱色稍差一点点,不如那样清楚,(用不着含甲醇和冰醋的样品就可以了,关键是这样省时省材料只要电泳时比平时多上1/5。
方便快捷!
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