细胞培养对无血清培养基的适应.doc
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细胞培养对无血清培养基的适应
有两种方法可以使细胞适应无血清培养基(SFM):
1.直接适应法式—将细胞直接从添加血清的培养基转换到无血
清培养基中。
2.连续适应或循序隔绝法—分几步将细胞从添加血清的培养基
转换到无血清培养基中。
与直接适应法相比较,连续适应法对于
细胞更温和些。
为了使细胞适应无血清培养基,关键是细胞培养应满足以下条
件:
1.处于对数生长中期
2.存活率大于90%
3.在适应期间,以较高的初始细胞接种量进行接种
下面列出了常规适应步骤。
初始细胞接种量、细胞产量和培养
周期是连续优化的良好开端。
直接适应
有些类型的细胞可以直接从含有血清培养基适应无血清培养基。
对于直接适应,细胞接种量应在2.5x105-3.5x105细胞/ml范围
内,当细胞密度达到1x106-3x106细胞/ml时,传代培养细胞。
培养4至7天后,当细胞密度达到2x106-4x106细胞/ml时,细
胞已完全适应了无血清培养基。
当细胞密度达到1x106-3x106
细胞/ml且存活率为90%时,应当每隔3到5天再次将适应了无血
清培养基的贮存细胞在无血清培养基中进行传代培养。
连续适应
我们推荐采用连续适应法使细胞适应无血清培养基(SFM),典型的
转换步骤如下:
第一代
75%含血清培养基和
25%无血清培养基
第二代
50%含血清培养基和
50%无血清培养基
第三代
25%含血清培养基和
75%无血清培养基
第四代
100%无血清培养基
由于从75%无血清培养基到100%无血清培养基的变化对细胞的
压力过大,因此可能需要将细胞在含有10%含血清培养基与90%
无血清培养基的混合培养基中传代培养2-3次。
可以认为大多数
细胞系在100%无血清培养基中传代培养3次后即可完全适应。
在
将细胞转换到100%无血清培养基中之前,偶尔也会遇到问题,
无法通过某一特定步骤。
如果出现这种情况,可在上一混合比例
的含血清培养基中将细胞传代培养2-3次。
无血清培养基的使用注意事项
总体而言,无血清基培养中的细胞对于极端pH值、温度、渗透
度、机械压力和酶处理更为敏感。
抗生素
在无血清培养基中最好不要使用抗生素。
如需使用,建议其用量
比使用含血清培养基时减少十分之一到五分之一。
这是因为血清
蛋白倾向于结合一定量的抗生素;如果没有这些血清蛋白,原来
使用的抗生素水平将对某些细胞产生毒性。
更高的细胞密度
在适应前,细胞必须处于对数生长中期,而且存活率大于90%。
可能必须采用连续适应的方法。
在无血清适应期间,每次传代时
接种密度要高于正常传代,这有助于适应过程。
由于部分细胞无
法在新的培养环境中存活,因此接入更多的细胞可以提高以后传
代存活的细胞数量。
细胞聚集
在适应无血清培养基时,细胞经常会聚成团。
建议您在进行细胞
传代时将细胞团轻轻弄碎,使之散开。
细胞形态
在适应无血清培养基的过程中以及适应无血清培养基以后,一般
不会发生细微的细胞形态变化。
只要细胞倍增时间和存活率保持
良好,细微的形态变化是无关紧要的。
条件培养基适应
适应无血清培养的另一种方法是使用“条件培养基”。
这种培养
基是指细胞已经在其中生长了完整一代。
如果采用这种方法,可
以按照以下步骤进行适应
第一代
100%含血清培养基
第二代
50%来自第一代的培养基和
50%无血清培养基
第三代
50%来自第二代的培养基和
50%无血清培养基
第四代
50%来自第三代的培养基和
50%无血清培养基
第五代
100%无血清培养基
无论采用哪种适应方法,都强烈建议您始终采取下列预防措施:
?
适应前用含血清培养基冻存一份细胞。
?
每进行下一步适应之前,都要在上一步的条件中再培养一份
细胞作为备份,以免进行下一步适应时细胞无法存活。
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