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生物制品学实验
实验四玉米超氧化物歧化酶(SOD)的提取
及活性测定
一、本实验的教学目标及基本要求
1.通过玉米超氧化物歧化酶(SOD)的提取及活性测定,掌握硫酸铵盐析沉淀蛋白质及超滤浓缩蛋白质的方法和原理,比较二者的特点。
2.掌握测定超氧化物歧化酶(SOD)的活力和比活力的方法。
二、本实验的教学内容
(一)实验原理
超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,简称SOD),它广泛存在于各类生物体内,按其所含金属离子的不同,可分为3种:
Cu,Zn-SOD,Mn-SOD,Fe-SOD。
SOD催化如下反应:
在生物体内,它是一种重要的自由基清除剂,能治疗人类多种病症、放射病、自身免疫性疾病和抗衰老,对生物体有保护作用。
在玉米中,SOD主要存在胚芽中,当将萌发的玉米籽粒打浆破碎后,以中性盐沉降其蛋白质部分,SOD就存在于沉淀中,但其中有许多杂蛋白,因此在盐析时先用40%(NH4)2SO4去除杂蛋白部分,再用90%(NH4)2SO4饱和上清液,则其中SOD成分即被浓缩分离。
超滤也是一种蛋白质浓缩方法。
超滤的工作原理是运用液压迫使溶质透过膜并按溶质分子量、形状、大小的差异,把大溶质分子阻留在膜的一侧,而小分子溶质则随溶剂透过膜到另一侧,使大小溶质分子得到分离。
利用此原理只要选择适当的超滤膜即可将玉米浆中SOD与其它小分子杂蛋白、可溶性糖等分离,并去除水份,得到SOD浓缩液。
SOD活性测定采用NBT光还原法。
其原理为核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2-,当加入NBT后,在光照条件下,与超氧自由基反应生成单甲月替(黄色),既而还原成二甲月替(呈兰色)。
该产物在560nm下有最大吸收峰。
当加入SOD时,可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2+O2,从而抑制了NBT光还原的进行,使兰色二甲月替生成速度减慢。
通过加入不同量的SOD,一定时间后测定560nm光密度的变化,求出抑制NBT光还原的50%的酶液量作为一个酶活力单位。
(二) 主要实验材料、试剂和仪器
1.实验材料:
玉米籽粒。
2.试剂:
注意配好每一试剂时,应立即转入试剂瓶当中,不要将试剂放在容量瓶当中存放,一定要及时将试剂瓶贴好相应的标签,标明溶液的浓度、pH值、体积、试剂名称、配制时间、配制人。
配制时一定要标清,使用时注意不要将其弄掉,这一点将给您带来无比的快捷和方便。
(1)1%次氯酸钠:
10mL次氯酸钠于1000mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度。
(2)提取缓冲液:
0.05mol/L磷酸氢二钾—磷酸二氢钾缓冲液,pH7.8。
具体配制方法如下:
首先是1mol/LpH7.8的磷酸钾缓冲液母液的配制。
a.1mol/LKH2PO4溶液:
称取13.6gKH2PO4,置于50mL小烧杯中,用少量蒸馏水溶解后,移入100mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度。
b.1mol/LK2HPO4溶液:
称取22.8gK2HPO4,置于50mL小烧杯中,用少量蒸馏水溶解后,可稍加热,移入100mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度。
c.取5mLa液与55mLb液混合后,调节pH为7.8,该液即为1mol/L的磷酸钾缓冲液。
d.0.05mol/LpH7.8磷酸钾缓冲液的配制(内含1mmol/LEDTA及0.1%β-巯基乙醇):
称取EDTA·2Na·2H2O0.372g置于50mL小烧杯中,用少量蒸馏水溶解后,移入1000mL容量瓶中,用移液管吸取1mLβ-巯基乙醇置入该1000mL容量瓶中,用50mL量筒量取50mLc液至该1000mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度。
(3)测试缓冲液:
0.026mol/LMet—磷酸钠缓冲液
具体配制方法:
首先是0.1mol/LpH7.8Na2HPO4—NaH2PO4缓冲液的配制。
a.称取Na2HPO4·12H2O(MW=358.14)3.5814g于100mL小烧杯中,加少量蒸馏水溶解后,移入100mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度。
b.称取NaH2PO4·2H2O(MW=156.01)0.780g于50mL小烧杯中,加少量蒸馏水溶解后,移入50mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度。
量取91.5mLa液与8.5mLb液混合后,该液即为0.1mol/LpH7.8的磷酸钠缓冲液。
称取L-Met(MW=149.2)0.1941g于50mL小烧杯中,用少量0.1mol/LpH7.8磷酸钠缓冲液溶解后,移入50mL容量瓶中,用0.1mol/LpH7.8磷酸钠缓冲液定容至刻度。
(4)7.5×10-4mol/L氯化硝基四氮唑蓝(NBT)
称取NBT(MW=817.7)0.0613g于50mL小烧杯中,用少量蒸馏水溶解后,移至100mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度(最好现用现配,也可贮于冰箱中用2~3d)。
(5)2×10-5mol/L核黄素溶液
a.称取EDTA(MW=292)0.00292g于50mL小烧杯中,用少量蒸馏水溶解。
b.称取核黄素(MW=376.36)0.0735g于50mL小烧杯中,用少量蒸馏水溶解。
合并a液和b液,移入100mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度(EDTA0.1mmol,核黄素2mmol)。
贮于冰箱中,避光保存,用时稀释100倍。
(6)苯甲酸钠:
1瓶。
(7)BaCl2:
1瓶。
(8)(NH4)2SO4:
500g/瓶,1瓶/大组。
3.仪器
天平3台,胶体磨1台,超滤器(0.5m2)1台,恒温培养箱1台,高速冷冻离心机1台,可见分光光度计5台,光照箱3台,移液管架5个,移液管(2mL,1mL,0.5mL各10支),微烧杯(10-15mL)130个,量筒(100mL,50mL,1000mL各3个),容量瓶(100mL,50mL各10个),烧杯(100mL,250mL各5个),125mL棕色试剂瓶12个,125mL白色试剂瓶10个,1000mL白色试剂瓶6个,1000mL棕色试剂瓶5个,纱布等。
(三)操作方法
1.SOD粗提液的制备
取500g玉米籽粒用自来水洗净后,用1%次氯酸钠1000mL漂洗10min消毒后,然后用自来水彻底洗净,置于器皿中,于28℃恒温培养箱中浸泡24h后,用自来水洗净,去掉多余的水分,用四层纱布蒙好,置于28℃恒温培养箱中发芽24h后,用自来水洗净,再用蒸馏水润洗一次后,用0.05mol磷酸氢二钾—磷酸二氢钾提取缓冲液1000mL,另外加入5g苯甲酸钠,在胶体磨中充分研磨,匀浆在室温下轻轻搅拌4次/h,浸提1h,八层纱布过滤,6500r/min离心20min,所得上清液用四层纱布过滤以除去漂浮物,即为酶的粗提液。
将上述粗酶液称量总体积后,再留取50mL粗酶液,用于测定盐析前的酶活力及比活力和实验九的电泳。
2.SOD浓缩
(1)盐析:
取酶粗提液先以40%(NH4)2SO4饱和1h,8500r/min离心20min去除沉淀,留取上清液,再用90%(NH4)2SO4盐析24h,8500r/min离心40min,弃去上清液,沉淀用0.05mol/LpH7.8磷酸氢二钾—磷酸二氢钾提取缓冲液20mL重溶,以蒸馏水透析过夜。
将透析液8500r/mim离心20min后,留取上清液,即为酶浓缩液。
用于测定透析后的酶活力及比活力与浓缩倍数及回收率,以及用于实验九的电泳。
(2)超滤浓缩:
取酶粗提液经0.5m2超滤器(膜的截留分子量为1万)浓缩后,量取体积,计算酶活力、比活力、浓缩倍数及回收率。
3.SOD活性测定
取8个微烧杯,编号,以反应系统总体积为3.0mL计算,按下表加入各试剂及酶液。
试剂加入后充分混匀,取1号微烧杯放入暗处作为空白(调零时用)。
其它7个微烧杯放入4500Lux日光灯照射下启动反应,15min后遮光终止反应。
在560nm波长下测定光密度,以2,3号杯的OD值计算出不同酶液量在其反应系统中抑制NBT光还原的相关百分率。
然后以所加酶液量为横坐标,以抑制百分率为纵坐标作图,画出两者的相关曲线,找出50%抑制率的酶液量,此酶液量即为一个酶活力单位。
表反应体系中各试剂及酶液的取量
杯号(单位均为mL)
试剂3(Met)
蒸馏水
试剂4(NBT)
酶液
(玉米SOD)
试剂5
(核黄素)
1
1.5
0.9
0.3
0
0.3
2
1.5
0.9
0.3
0
0.3
3
1.5
0.9
0.3
0
0.3
4
1.5
0.85
0.3
0.05
0.3
5
1.5
0.80
0.3
0.10
0.3
6
1.5
0.75
0.3
0.15
0.3
7
1.5
0.70
0.3
0.20
0.3
8
1.5
0.65
0.3
0.25
0.3
(四) 结果计算
总酶活力(U/g)=
酶液总体积(mL)×稀释倍数
抑制50%的酶液量(mL)×样品重(g)
抑制率=
D1-D2
×100%
D1
比活力(U/mg)=
酶活力(U)
总蛋白mg数
其中:
D1为2、3号杯的平均OD值;
D2为加入不同酶液量的OD值。
回收率=
浓缩后酶活力(U)
×100%
总酶活力(U)
提纯倍数=
浓缩后比活力(U/mg)
浓缩前比活力(U/mg)
三、本实验教学内容的重点和难点
重点:
玉米SOD的提取。
难点:
提取条件的控制。
四、本实验教学内的深化和拓宽
通过本实验的学习,使学生明确实验的意义,联系实际,使学生了解本实验的应用。
明确植物SOD与动物SOD的区别,了解植物SOD的优势。
五、本实验的教学方式及注意问题
教学方式:
先讲授实验内容,再演示,然后两人一组进行实验。
注意问题:
玉米超氧化物歧化酶(SOD)的提取缓冲液的配制。
六、本实验的思考题
1. 什么是分段盐析,为什么要进行分段盐析?
2. 超氧化物歧化酶(SOD)有哪些用途?
实验五 超氧化物歧化酶(SOD)活性染色
一、本实验的教学目标及基本要求
1.学习聚丙烯酰胺凝胶电泳法的超氧化物歧化酶活性染色原理和蛋白质染色原理。
2.进一步熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳,掌握超氧化物歧化酶活性染色技术。
二、本实验的教学内容
(一)实验原理
超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,简称SOD)是一种新型的抗炎酶制剂,在防辐射、防衰老和抗肿瘤等方面起着重要作用。
超氧化物阴离子自由基能对氯化硝基四氮唑蓝(简称NBT)进行光化还原,生成蓝紫色
的二甲月替(formazan)。
由于SOD能催化下列反应:
所以当反应系统中存在SOD时,便促使超氧化物阴离子自由基O2.-形成过氧化氢,从而抑制NBT的光化还原,也就是抑制了蓝紫色二甲月替的生成。
当用PAGE分离SOD后,将凝胶板浸泡在NBT溶液中,先进行暗反应,再经光照,经此步处理后,除含SOD的部位之外,其余凝胶板背景则变成蓝紫色,也就是在一片蓝紫色背景的凝胶中出现缺色的含SOD的明亮区带,此过程称为SOD的活性染色。
(二) 主要试剂和仪器
1.试剂:
注意配好每一试剂时,应立即转入试剂瓶当中,不要将试剂放在容量瓶当中存放,一定要及时将试剂瓶贴好相应的标签,标明溶液的浓度、pH值、体积、试剂名称、配制时间、配制人。
配制时一定要标清,使用时注意不要将其弄掉,这一点将给您带来无比的快捷和方便。
(1)玉米Cu,Zn-SOD(由本实验室制备,即实验八所制备的盐析前的和透析后的酶液。
)
(2)2.45×10-3mol/LNBT溶液100mL
用天平准确称取NBT200mg,置于50mL小烧杯中,用少量蒸榴水溶解,移入100mL容量瓶中,用蒸馏水定容至100mL,转入125mL棕色试剂瓶中,放于4℃冰箱中贮存。
由于NBT溶液用量较多,且NBT价格昂贵,每次用后应回收,及时妥善保存,此液可反复使用多次。
当黄色NBT溶液变浅或变绿,并出现沉淀时,则不能继续使用,应重新配制。
(3)3.60×10-2mol/LpH7.8磷酸钠缓冲液100mL,内含2.8×10-2mol/LTEMED和
2.8×10-5mol/L核黄素
即在100mL3.60×10-2MpH7.8磷酸钠缓冲液(配制方法见实验八的0.1MpH7.8磷酸钠缓冲液的配制,用相应的比例换算一下,将0.1mol/L的pH7.8磷酸钠缓冲液多少mL,稀释多少倍,即可得3.60×10-2MpH7.8的磷酸钠缓冲液)中含0.42mLTEMED和1.32mg核黄素。
置于125mL棕色试剂瓶中,放于4℃冰箱中贮存。
此液用后应回收,妥善保存,可多次使用。
当溶液变色,并出现沉淀时,则不能继续使用,应重新配制。
(4)0.05mol/LpH7.8磷酸钠缓冲液100mL
配制方法见实验八的0.1mol/LpH7.8磷酸钠缓冲液的配制,用相应的比例换算一下,将0.1mol/L的pH7.8磷酸钠缓冲液50mL,稀释2倍,即向其中再加入50mL蒸馏水,即可得0.05mol/LpH7.8的磷酸钠缓冲液。
此液不必回收。
(5)聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,简称PAGE)有关试剂的配制
①凝胶缓冲液:
量取1mol/LHCl48mL,置于100mL小烧杯中(注意从试剂商店买来的HCl为浓盐酸,浓度为12mol/L,需取4mL浓盐酸,再加44mL重蒸馏水,即为48mL1mol/LHCl);再用天平准确称取Tris(三羟甲基氨基甲烷)36.6g,置入该100mL小烧杯中,使其充分溶解;再用移液管准确吸取TEMED(N,N,N’,N’—四甲基乙二胺)0.23mL,也置入该100mL小烧杯中,再加重蒸馏水至80mL,千万不能加入过量的水,使其混匀,调pH8.9,然后移入100mL容量瓶中,用重蒸馏水定容至100mL,转入125mL棕色试剂瓶中,放于4℃冰箱中贮存,备用,一般可放置3个月左右。
②分离胶贮液,一般有两种配制方法:
●28%Acr—0.735%Bis贮液:
用天平准确称取丙烯酰胺(Acr)28.0g,甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.735g,同时置入100mL小烧杯中,加少量重蒸馏水溶解后,移入100mL容量瓶中,用重蒸馏水定容至100mL。
●30%Acr—0.8%Bis贮液:
用天平准确称取Acr30.0g,Bis0.8g,同时置入100mL小烧杯中,加少量重蒸馏水溶解后,移入100mL容量瓶中,用重蒸馏水定容至100mL。
以上两种浓度溶液定容至100mL,过滤后,分别置于125mL棕色试剂瓶中,放于
4℃冰箱中贮存,备用,一般可放置3个月左右。
③分析纯过硫酸胺(AP)0.14g加重蒸馏水至100mL,置于125mL白色试剂瓶中,放于4℃冰箱中贮存,备用。
仅能用一周,最好当天配制。
上述①—③3种试剂用于制备分离胶。
④浓缩胶缓冲液:
用天平准确称取1MHCl48mL,置于100mL小烧杯中(注意从试剂商店买来的HCl为浓盐酸,浓度为12mol/L,需取4mL浓盐酸,再加44mL重蒸馏水,即为48mL1mol/LHCl);再用天平准确称取Tris5.98g,置入该100mL小烧杯中,使其充分溶解;再用移液管准确吸取TEMED0.46mL,也置入该100mL小烧杯中,再加重蒸馏水至80mL,千万不能加入过量的水,使其混匀,调pH6.7,然后移入100mL容量瓶中,用重蒸馏水定容至100mL,转入125mL棕色试剂瓶中,放于4℃冰箱中贮存,备用,一般可放置3个月左右。
⑤浓缩胶贮液:
用天平准确称取Acr10g,Bis2.5g,同时置入100mL小烧杯中,加少量重蒸馏水溶解后,移入100mL容量瓶中,用重蒸馏水定容至100mL,过滤后,置于125mL棕色试剂瓶中,放于4℃冰箱中贮存,备用,一般可放置3个月左右。
⑥40%蔗糖溶液(W/V):
用天平准确称取蔗糖40g,置入100mL小烧杯中,用量筒准确量取100mL重蒸馏水,将其充分溶解,转入125mL白色试剂瓶中,放于4℃冰箱中贮存,备用,一般可放置2个月左右。
⑦0.004%核黄素溶液:
用天平准确称取核黄素4.0mg,置入100mL小烧杯中,加少量重蒸馏水溶解后,移入100mL容量瓶中,用重蒸馏水定容至100mL,置于125mL棕色试剂瓶中,放于4℃冰箱中贮存,备用,一般可放置1个月左右。
以上④—⑦4种溶液用于配制浓缩胶。
(6)pH8.3Tris—甘氨酸电极缓冲液
用天平准确称取Tris6.0g,甘氨酸28.8g,置入500mL大烧杯中,加约400mL蒸馏水使其溶解后,移入1000mL容量瓶中,加重蒸馏水至900mL左右,调pH8.3后,用重蒸馏水定容至1000mL,置于大试剂瓶中,放于4℃冰箱中贮存,备用。
临用前稀释10倍。
(7)0.1%溴酚蓝指示剂
用天平准确称取溴酚蓝0.1g,置入100mL小烧杯中,用少量蒸馏水溶解后,移入100mL容量瓶中,用重蒸馏水定容至100mL,置于125mL棕色试剂瓶中,放于4℃冰箱中贮存,备用。
(8)染色液
采用0.05%考马斯亮蓝R-250染色液,其中含20%磺基水杨酸,其优点是染色、固定同时进行,背景易脱色。
0.05%考马斯亮蓝R-250的20%磺基水杨酸染色液的配制:
用天平准确称取考马斯亮蓝R-2500.05g,磺基水杨酸20g,同时置入100mL小烧杯中,加少量重蒸馏水溶解后,移入100mL容量瓶中,用重蒸馏水定容至100mL,过滤后,置于125mL棕色试剂瓶中,放于4℃冰箱中贮存,备用。
(9)脱色液
用7%乙酸溶液进行脱色:
用量筒或移液管准确量取冰乙酸母液7mL,移入100mL容量瓶中,用蒸馏水定容至100mL。
(10)保存液
分别用量筒或移液管准确量取甘油10mL和冰乙酸7mL,均移入100mL容量瓶中,用蒸馏水定容至100mL。
(11)1%琼脂(糖)溶液
用天平准确称取琼脂(糖)1g,置入50mL小烧杯中,用30mL已稀释10倍的电极缓冲液简单溶解,再移入150mL的三角瓶中,再加70mL已稀释10倍的电极缓冲液,将此三角瓶放入一个已盛有约200mL自来水的500mL的大烧杯中,放于电炉上加热煮沸进一步溶解,待完全溶解后,用硫酸纸将三角瓶的瓶口盖严,待冷却后,置于4℃冰箱中贮存,备用。
每次用前,根据操用进程,提前将其熔化,用后及时收好。
(12)95%乙醇。
2.仪器
(1)夹心式垂直板电泳槽或其它型号的垂直电泳槽:
凝胶模为135×100×1.5mm;
(2)电泳仪:
电压为300-600V,电流为50-100mA.;
(3)移液管:
2,5,10mL各15支;
(4)烧杯:
25,50,100,500,1000mL各5个;
(5)微量注射器:
10μL或50μL2~3支;
(6)培养皿:
φ12cm3个;
(7)细长头的滴管:
6个;
(8)1mL注射器及6号长针头各一个;
(9)5mL或10mL的注射器:
1个;
(10)4×8W日光灯,玻璃板(13×13cm),玻璃纸等。
(三) 操作方法
首先安装好垂直板电泳槽,将各玻璃板洗净,用凡士林油和1%的琼脂糖溶液封好四边。
这一步是很关键的,一定要认真、负责,否则,将影响整组实验的进程。
1.配胶及灌胶
配制7.5%聚丙烯酰胺(polyacrylamid,简称PAA)分离胶及3.75%PAA浓缩胶,配制方法见下表。
待浓缩胶完全聚合后,老化30min,小心取出样品槽模板,用窄滤纸条吸去多余溶液,加入pH8.3Tris--HCl电极缓冲液。
注:
若分离胶聚合较慢,可适当再加一定量的TEMED,可加速聚合;我们这个浓度(7.5%)的分离胶可再加TEMED50μL;此配方的浓缩胶必须在白炽灯泡灯光下或太阳光光下光照后,才能聚合。
表不同浓度分离胶及浓缩胶的配制
试剂名称
用量(mL)
20mLPAA终浓度
20mLPAA终浓度
5.5%
7.0%
10.0%
5.0%
7.5%
10.0%
分
离
胶
(1)分离胶缓冲液pH8.9Tris-HCl(TEMED)
2.50
2.50
2.50
2.50
2.50
2.50
(2)凝胶贮液
A.28%Acr-0.735%Bis
3.93
5.00
7.14
—
—
—
B.30%Acr-0.8%Bis
—
—
—
3.33
5.00
7.14
重蒸馏水
3.57
2.50
0.36
4.17
2.50
0.83
充分混匀后,置于真空干燥器中,抽气10min
(3)0.14%AP
10
10
10
10
10
10
浓
缩
胶
(4)浓缩胶缓冲液pH6.7Tris-HCl(TEMED)
2.5%PAA
3.75%PAA
1
1
(5)浓缩胶贮液
10%Acr-2.5%Bis
2
3
(6)40%蔗糖
4
3
充分混匀后,置于真空干燥器中,抽气10min
(7)0.004%核黄素
1
1
2.加样
分别取实验八所做的盐析前的和透析后的玉米铜-锌SOD溶液各2mL,再各加入40%蔗糖溶液2mL,再各加入3滴0.1%溴酚蓝溶液,此液即为上样液。
每孔加入上样液4μL,8μL,10μL等不同体积梯度,以对称的方式加样,以便一分为二,分别进行蛋白及酶活性染色。
盐析前的和透析后的酶液都要加样,每组由负责人安排好加样的顺序和体积,并在草纸上加以记录,以便观察结果。
3.电泳
连接电源,上槽接负极,下槽接正极(铜-锌SOD的pI约为5.0,在pH8.3的电极缓冲液中带负电),接通冷却水及电源开关,调节电流至30mA,待样品由浓缩胶进入分离胶时,再将电流调至50~60mA,当染料前沿距离胶底1-2cm时,关闭电源及冷却水,电泳结束,取出胶片,一分为二,两胶片均做好左右标记,以便观察结果。
4.染色、脱色与制干板
(1)蛋白质染色、脱色与保存
●染色采用0.05%考马斯亮蓝R250(内含20%磺基水杨酸)染色液,染色与固定同时进行,使染色液浸过胶板,染色30min左右。
●脱色采用7%乙酸脱色液,用7%乙酸浸泡漂洗数次,直至背景蓝色褪去。
如用50℃水浴或脱色摇床,则可缩短脱色时间。
●保存:
可以制备凝胶干板保存,1mm以上的胶板常用凝胶真空器制备干板。
如无此仪器可将脱色后的胶板浸泡在保存液中3~4hr。
制干板时在大培养皿上,平放一块干净玻璃板(13×13cm),倒少许保存液在玻璃板上,使其均匀涂开,取一张预先用蒸馏水浸透的玻璃纸平铺在玻璃板上,赶走气泡,小心取出凝胶板平铺在玻璃纸上,赶走两者间的气泡。
再取另一张蒸馏水浸透的玻璃纸覆盖在凝胶板上,赶走气泡,将四边多余的玻璃纸紧紧贴于玻璃板的背面。
平放于桌上自然干燥1~2天,完全干后除去玻璃板,即可得到平整、透明的干胶板,此干板可长期保存,便于定量扫描和照相。
(2)SOD活性染色
取另一半凝胶板,按下列顺序浸泡于培养皿中染色。
●2.45×10-3mol/L
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