致病菌检验.docx
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致病菌检验
致病菌检验
9.2检测方法
9.2.1有害物质的检测方法
9.2.1.1产品中砷含量的检测
方法:
按照GB/T5009.76—2003中的第一法:
二乙氨基二硫代甲酸银比色法
原理:
在碘化钾和氯化亚锡存在下,将样液中的高价砷还原为三价砷,三价砷与锌粒和酸产生的新生态氢作用,生成砷化氢气体,经乙酸铅棉花除去硫化氢干扰后,被溶于三乙醇胺一三氯甲烷中或吡啶中的二乙氨基二硫代甲酸银溶液吸收并作用,生成紫红色络和物,与标准比较定量。
试剂
硝酸
硫酸【(1+1)、(1mol/L)、65%浓硫酸】
盐酸
20%氢氧化钠溶液
15%碘化钾溶液,贮于棕色瓶内(临用前配制)
40%氯化亚锡溶液:
称取20g氯化亚锡(Sncl2·2H20),溶于50ml盐酸
乙酸铅棉花:
将脱脂棉浸于10%乙酸铅溶液中,2h后取出晾干
无砷金属锌
9.2.1.2产品中铅含量的测定
方法:
按照GB/T5009.75—2003食品添加剂中铅的测定
原理:
试样经处理加人柠檬酸铵、氰化钾和盐酸轻胺等,消除铁、铜、锌等离子干扰,在pH8.5~9.0时,铅离子与双硫腙生成红色络合物,用三氯甲烷提取,与标准系列比较做限量试验或定量试验。
试剂
硝酸
硫酸
氨水(1+1):
如含铅,应用全玻璃蒸馏器重蒸馏。
盐酸
三氯甲烷:
不应含氧化物。
酚红指示液:
1g/L乙醇溶液。
柠檬酸氢二铵;500g/L溶液
称取100g柠檬酸氢二铵,溶于100mL水中,加2滴酚红指示液,加氨水(1+1)调节pH至8.5~9.0(由黄变红,再多加2滴),用双硫腙三氯甲烷溶液提取数次,每次10mL~20mL,至三氯甲烷层绿色不变为止,弃去三氯甲烷层,再用三氯甲烷洗涤两次,每次5mL,弃去三氯甲烷层,加水稀释至200mL
盐酸羟胺:
200g/L溶液。
称取20g盐酸羟胺,加40mL水溶解,加2滴酚红指示液,加氨水(1+1)调节pH至8.5~9.0(由
黄变红,再多加2滴),用双硫腙三氯甲烷溶液提取数次,每次10mL~20mL,至三抓甲烷层绿色不变为止,再用三氯甲烷洗两次,每次5mL,弃去三氯甲烷层,水层加盐酸(1+1)呈酸性,加水至100mL.
氰化钾:
100g/L溶液(配置过程应在通风柜中进行)。
二苯基硫巴腙(双硫腙):
0.05%三氯甲烷溶液,保存于冰箱中,必要时按下述方法纯化。
称取0.5g研细的双硫腙,溶于50mL三氯甲烷中,如有残渣,可用滤纸过滤于250mL分液漏斗中,用氨水(1+99)提取三次,每次100mL,将提取液用棉花过滤至500mL分液漏斗中,用盐酸(1+1)调至酸性,将沉淀出的双硫腙用200,200,100mL三氯甲烷提取三次,合并三氛甲烷层为双硫腙储备溶液。
双硫腙使用液:
吸取1.0mL双硫储备溶液,加9mL三抓甲烷,混匀。
用1cm比色杯,以三氯甲烷调节零点,于波长510nm处测吸光度(A),用式
(1)算出配制100mL双硫腺使用液(70%透光率)所需双硫腙储备溶液的毫升数(V)。
仪器
分光光度计
125mL分液漏斗
250mL三角烧瓶。
试样处理
干法消解:
本法适用于适合含有有机物的试样。
称取5.0g试样于瓷坩埚中,加人适量硫酸湿润试样,小心炭化后,加2mL硝酸和5滴硫酸,小心加热,直到白色烟雾挥尽,移人高温炉中,于550℃灰化完全。
冷后取出。
加1mL硝酸(1+1)溶液,加热使灰分溶解,将试样液转移到50mL容量瓶中(必要时过滤),并用少量水洗涤坩埚,洗液一并移人容量瓶中,加水至刻度,混匀备用。
每10mL溶液相当于1.0g试样。
取一坩埚,按上述方法做试剂空白试验。
测定
定量测定
吸取10.0mL(或适量)试样液和同量的试剂空白液,分别置于125mL分液漏斗中,各加1%硝酸至20mL,
向试样液、试剂空白液及铅标准溶液中各加人1mL柠檬酸铵溶液,1mL盐酸羟胺溶液和2滴酚红指示液,用氨水(1+1)调至红色,再各加人2mL氰化钾溶液,混匀,各加5.0mL双硫腙使用液,剧烈振摇1min,静置分层后,三氯甲烷经脱脂棉滤入1cm比色杯中,于波长510nm处,以零管调节零点,测定其吸光度。
铅的标准曲线
根据上述标准曲线所得公式y=0.0315x+0.002和样品液、空白液的吸光度值可得样品液中铅的含量。
9.2.2致病菌微生物的检测方法
9.2.2.1沙门氏菌的检验
方法:
GB4789.4-2010
设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
冰箱:
2℃~5℃。
恒温培养箱:
36℃±1℃,42℃±1℃。
振荡器。
电子天平:
感量0.1g。
无菌锥形瓶:
容量250mL。
微量移液枪及吸头。
全自动微生物生化鉴定系统。
培养基和试剂
缓冲蛋白胨水(BPW)
沙门氏菌属显色培养基。
生化鉴定试剂盒。
检验程序
检样
样品:
BPW=1:
9
↓36℃±1℃18h-24h
沙门氏菌属显色培养基
无可疑菌落
←↓36℃±1℃18h-24h
挑取可疑菌落
↓
配置菌悬液
↓
生化试剂盒
↓18h-24h36℃±1℃
全自动微生物生化鉴定系统
↓
报告
操作步骤
增菌
称取5g样品放入盛有45mLBPW的无菌广口瓶中,振荡混匀,于36℃±1℃培养18h~24h。
分离和生化试验
在生物柜中用接种环取增菌液1环,划线接种沙门氏菌属显色培养基平板上,然后于36℃±1℃培养18h~24h,观察平板上菌落的生长特征。
选择全自动微生物生化鉴定系统,可根据上面的初步判断结果,在生物柜中用接种环从显色平板上挑取可疑菌落,用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液,再分别移取150uL的菌悬液到生化试剂盒的每个小孔中,于36℃±1℃培养24h,最后进入全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。
9.2.2.2志贺氏菌的检验
方法:
GB/T4789.5-2003
设备和材料
冰箱:
0℃~4℃.
恒温培养箱:
36℃±1℃,42℃.
灭菌广口瓶:
500mL、250mL
全自动微生物生化鉴定系统
培养基和试剂
GN增菌液:
按GB/T4789.28-2003中4.17规定
志贺氏菌显色培养基
生化鉴定试剂盒
检验程序
检样
样品:
GN=1:
9
↓36℃±1℃18h-24h
志贺氏菌显色培养基
无可疑菌落
←↓36℃±1℃18h-24h
挑取可疑菌落
↓
配置菌悬液
↓
生化试剂盒
↓18h-24h36℃±1℃
全自动微生物生化鉴定系统
↓
报告
操作步骤:
增菌
以无菌操作取检样5g,加入装有45mLGN增菌液的广口瓶内,于36℃培养18h-24h。
分离和生化试验
在生物柜中用接种环取增菌液1环,划线接种于志贺氏菌显色平板上,然后于36℃±1℃的培养箱中培养18h-24h。
在生物柜中用接种环挑取平板上的可疑菌落于生理盐水中,制作菌悬液,再分别移取150uL的菌悬液到生化试剂盒的每个小孔中,于36℃±1℃培养24h,最后进入全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。
9.2.2.3金黄色葡萄球菌的检验
方法:
GB4789.10-2010
设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
恒温培养箱:
36℃±1℃。
冰箱:
2℃~5℃。
天平:
感量0.1g。
振荡器。
微量移液枪及吸头。
灭菌广口瓶:
500mL、250mL.
培养基和试剂
7.5%氯化钠肉汤
金黄色葡萄球菌显色培养基
生化鉴定试剂盒
检验程序
检样
样品:
7.5%氯化钠肉汤=1:
9
↓36℃±1℃18h-24h
金黄色葡萄球菌显色培养基
无可疑菌落
←↓36℃±1℃18h-24h
挑取可疑菌落
↓
配置菌悬液
↓
生化试剂盒
↓18h-24h36℃±1℃
全自动微生物生化鉴定系统
↓
报告
操作步骤
增菌
称取5g样品至盛有45mL7.5%氯化钠肉汤的广口瓶中,振荡混匀。
分离和生化试验
将上述样品匀液于36℃±1℃培养18h~24h。
金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长,污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。
在生物柜中用接种环将上述培养物划线接种于金黄色葡萄球菌显色培养基上,然后于36℃±1℃培养18h~24h。
在生物柜中用接种环挑取平板上的可疑菌落于生理盐水中,制作菌悬液,再分别移取150uL的菌悬液到生化试剂盒的每个小孔中,于36℃±1℃培养24h,最后进入全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。
9.2.2.4溶血性链球菌的检验
方法:
GB/T4789.11-2003
设备和材料
冰箱:
0℃~4℃.
恒温培养箱:
36℃±1℃
灭菌广口瓶:
500mL、250mL.
振荡器
培养基和试剂
0.85%灭菌生理盐水
血平板
检验程序
检样
样品:
0.85%灭菌生理盐水=1:
9
↓36℃±1℃18h-24h
血平板
无可疑菌落
←↓36℃±1℃18h-24h
挑取可疑菌落
↓
配置菌悬液
↓
生化试剂盒
↓18h-24h36℃±1℃
全自动微生物生化鉴定系统
↓
报告
操作步骤
增菌
按无菌操作称取食品检样25g(mL)加入225mL灭菌生理盐水,研成匀浆职称混悬液。
分离和生化试验
在生物柜中用接种环将上述混悬液直接划线接种于血平板上,置36℃±1℃培养24h,在生物柜中用接种环挑取平板上的可疑菌落于生理盐水中,制作菌悬液,再分别移取150uL的菌悬液到生化试剂盒的每个小孔中,于36℃±1℃培养24h,最后进入全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。
9.2.3感官的检测方法
按照GB26687-2011中,取适量被测样品于无色透明的容器或白瓷盘中,置于明亮处,观察形态、色泽,并在室温下嗅其气味。
要求不应有异味、异臭,不应有腐败及霉变现象,不应有视力可见的外来杂质。
9.2.4水份的检验方法
方法:
GB/T5009.3-2003中的第一法直接干燥法
仪器:
水分快速测定仪
操作步骤:
取2.000g-3.000g样品于洁净玻璃制的扁平称量瓶中,至于水分快速测定仪中,加热0.5h-1.0h,取出盖好,置干燥器内冷却0.5h,称量,并重复干燥至恒量,至前后两次质量差不超过5mg即为恒量。
结果计算:
式中:
X—试样中水份的含量;
m1—称量瓶和试样的质量,单位为克(g);
m2—称量瓶和试样干燥后的质量,单位为克(g);
m3—称量瓶的质量,单位为克(g);
9.2.5净含量的检验方法
于整批次产品中随即抽取一定数量的成品,在包装袋中随机抽取相同数量的包装袋,分别求其平均值,两个平均值的差值即为本批产品的净含量。
其中每件产品的净含量允许误差为±5g
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- 致病菌 检验