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孙月月最终论文
编号:
毕业论文
题目转基因食品检测技术研究进展
指导教师李天骄
学生姓名孙月月
学号201201104047
专业食品质量与安全
教学单位生命科学学院(盖章)
二O一六年六月十二日
目录
摘要及关键词1
1前言1
1.1转基因技术的基本原理1
1.2转基因食品1
1.2.1转基因食品的优势2
1.2.2转基因食品存在的风险2
2转基因食品的检测技术2
2.1蛋白质水平检测2
2.1.1蛋白质印迹法2
2.1.2酶联免疫吸附试验..........................................................................................3
2.1.3侧向流动型免疫检测4
2.2核酸水平的检测5
2.2.1SouthernBlot方法5
2.2.2PCR检测方法5
3其他检测方法7
3.1基因芯片检测方法8
3.2近红外光谱检测技术(NIRspectroscopy)8
4结论与展望9
参考文献10
英文摘要及关键词12
致谢13
Contents
AbstractandKeywords..................................................................................................1
1Introduction.................................................................................................................1
1.1Basicprinciplesofgeneticallymodifiedfoods.......................................................1
1.2GeneticallyModifiedFood.....................................................................................11.2.1Advantagesofgeneticallymodifiedfoods............................................................2
1.2.2Riskofgeneticallymodifiedfood.....................................................................2
2Detectiontechnologyofgeneticallymodifiedfood....................................................2
2.1Proteinleveldetection..............................................................................................2
2.1.1Westernblotting...............................................................................................2
2.1.2Enzymelinkedimmunosorbentassay...............................................................3
2.1.3Lateralflowimmunoassay................................................................................4
2.2Nucleicacidlevelsof...............................................................................................5
2.2.1SouthernBlotmethod........................................................................................5
2.2.2PCRdetectionmethod.......................................................................................5
3Otherdetectionmethods..............................................................................................7
3.1Genechipdetectionmethod.....................................................................................8
3.2Nearinfraredspectroscopydetectiontechnology(spectroscopyNIR).....................8
4ConclusionandOutlook..............................................................................................9
References....................................................................................................................10
EnglishabstractandKeywords....................................................................................12
Ackonwledge................................................................................................................13
转基因食品检测技术的研究进展
孙月月
(德州学院生命科学学院,山东德州253023)
摘要:
随着转基因农作物产业的迅速发展,转基因食品很快走进人们的日常生活。
虽然迄今为止,转基因食品进入市场前都经过安全评估,但人们长期食用是否安全仍然存疑,转基因食品是否有副作用这个关键问题也未达成共识。
本课题论述了转基因食品检测方法和特点,以及新型检测技术,以此为转基因食品检测技术的发展提供参考。
关键词:
转基因食品;检测技术;食品安全
1前言
民以食为天,不同种类的食品进入人们的生活,一些食品的特性已经不能满足人们的需求,随之转基因食品出现而且迅速的发展起来,由于生活水平的提高,对食品的安全自然而然成了人们所关注的问题,这时各种转基因食品的检测方法也就应运而生。
目前,世界各国转基因食品的检测方法多种多样,但主要从外源DNA和蛋白质两种生物大分子入手,通过一些现有的检测方法进行对比和分析,结果发现每一种方法都有各自的优点和不足之处。
因此需要适宜的检测方法保证对食品的检测的高效进行。
1.1转基因技术的基本原理
转基因技术的基本原理是利用现代遗传工程技术,将人们所期望的目的基因,经过人工分离和遗传修饰重新导入生物体的基因组中从而可以按照人们的意愿创造出自然界中原本不存在的新的生物功能及性状,改善生物体的原有性状或赋予其新的优良性状。
通俗的说就是导入外来基因使遗传物质发生改变,对基因进行修饰改造。
1.2转基因食品
通过转基因技术所创造的生物为原料加工生产出的食品称为转基因食品[1],包括转基因植物、动物、微生物食品三类。
在欧盟新型食品条例中将转基因食品定义为:
一种由转基因修饰的生物体生产的或该物质本身的食品[2]。
因为转基因技术使转基因生物具有了不同的遗传特性,由该生物生产出的食品的安全性自然要通过了解转基因食品的优势与风险,以便我们更好的评估转基因食品对于我们身体健康方面的安全性。
1.2.1转基因食品的优势
转基因食品之所以能够被大众所逐渐接受是因为它与传统食品相比具有自身的优势。
在农业基因工程方面,强调提高农作物产量和改善农作物的抗虫性、抗病性、抗除草剂和抗旱能力;在食品基因工程方面,强调改善食品的营养价值和食用风味,如营养素的含量、风味品质、延长食品储藏和保存时间,以及食品工程菌生产食品添加剂和功能因子等。
1.2.2转基因食品存在的风险
转基因技术是一把双刃剑,带给我们一些利益的同时也给我们带来了不安全因素。
转基因违反自然发展规律,因而有很多的没有定性的因素;植物里引入了抗除草剂或毒杀害虫的基因,导致环境安全方面的不良影响;插入基因后的产物的致癌性、过敏性、毒性使它所提供的食物对于我们的食用健康有不良影响。
转基因技术很可能导致生物污染,这种问题是非常严重的。
因此,转基因检测技术的发展对于人类和社会的发展显得尤为重要。
通过了解到转基因食品的优势与风险,那么,尤其对于人类健康方面有关的转基因食品检测技术的发展应当摆在首位。
2转基因食品的检测技术
转基因过程的每一个操作环节都非常可能对食品的安全性产生一些重要影响[3]。
转基因技术又分为不同的类型:
一是蛋白质水平的检测,二是核酸水平的检测,三是一些其他的检测技术。
这些检测技术的发展对于不断探索转基因技术的发展起到了尤为重要的作用。
2.1蛋白质水平检测
目前,蛋白质水平的检测方法主要基于免疫学和物理学,常用的检测方法有Western杂交、ELISA和免疫试纸条法等方法,其中ELISA应用最为广泛,可特异性地检测由转化导入的基因所产生的新蛋白。
2.1.1蛋白质印迹法
蛋白质印迹法是表达相应蛋白的权威检测方法。
将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体,具有较高的检测灵敏度,如图1所示。
该方法在种子、烘烤食物中的检出限分别为0.25%、1.00%[4],但该方法只适合定性分析,并且操作繁琐、成本高,不适用于快速、大量样品的分析检测。
图1蛋白质印记迹法的基本操作
Fig.1ThebasicoperationofWesternblotting
2.1.2酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附测定是抗原与抗体之间的特异反应使待测的目标物与酶的高效催化反应有机结合,然后酶和底物能够发生颜色反应,适用于定量的测定。
目前主要分为双抗体夹心法、直接法、间接法、竞争法[5]四种。
现在已有一些外源蛋白检测试剂盒研制成功,主要有:
美国Prime公司的NPTIIELISA试剂盒、检测大豆RoundupReady表达的CP4-EPSPS蛋白的SoyaRUR试剂盒、检测YieldGard玉米中的Bt蛋白的MON810试剂盒。
此法比免疫PCR更加迅速,而且灵敏度高,操作简单,用时较少,适合于现场检测。
但因为没有合适的用于定量的内标蛋白,不能对转基因含量进行精确定量分析。
2.1.3侧向流动型免疫检测
该方法与ELISA方法相似,是基于三明治夹心式技术原理[6],如图2所示,在一种膜支持物上,标记的抗原-抗体复合物侧向迁移,直至遇到在一种固定表面上的抗体。
该方法处理简单、分析迅速、易于避免由于样品的制备而产生错误的结果。
试纸条系统通常采用多孔膜(纳米膜)作为固相载体,该膜具有较强的蛋白吸附功能,抗体吸附于纳米膜经干燥后可作为固相,可与液相中的相应抗原抗体免疫金快速结合。
该系统主要有硝酸纤维素膜、样品吸收垫、胶体金垫、PVC底板组成。
在湿润状态下,液相中的抗原抗体免疫金可作快速定向泳动并与固相另一抗体决定簇单抗结合,形成特异的金标记抗体-抗原-抗体红色沉积线,表现出特异的抗原抗体反应。
如果表现出阴性:
质控区C出现红色条带,测试区T未出现红色条带;阳性:
质控区C出现红色条带,测试区T出现红色条带;无效的结果:
质量控制区C未出现红带,表明该条已变质或操作过程不正确,需要重新检验。
试纸条法是一种快速、简单的定性检测方法,将放在待测样品中的试纸条进行检测,5至10分钟出检测结果,不需要特殊的设备和熟练的操作技能。
但每一种试纸条只可检测一种蛋白质,且只能检测外源蛋白是不是存在,而不能区分特定的转基因种类。
当前,已有很多公司开发出蛋白检测的试纸条,主要是针对大豆、油菜、棉花和甜菜中CP4EPSPS。
图2试纸显色原理图
Fig.2Reactionschemeoflateralflowstrip
2.2核酸水平的检测
转基因作物是指利用基因工程的原理将原有作物的优良基因加入,使所想作物具有该种基因的物种中,并将不利于作物的基因剔除出去,从而使该作物具有更好的品质。
入新的基因片段以改变基因组使作物拥有高产量、抗虫性等性状。
新引入的外源DNA片段主要包括启动子序列、目的基因序列和终止子序列3种类型DNA片段序列。
因此,在核酸水平的检测主要是针对以上3种DNA序列。
如今,核酸检测的主要方法主要分为2种,一种是分子杂交技术如SouthernBlot方法,另一种方法是基于PCR的检测方法。
2.2.1SouthernBlot方法
Southern印迹是将含有经凝胶电泳分离的酶切DNA片段的琼脂糖凝胶,置于一装有缓冲溶液的玻璃皿中,通过其中的虹吸作用而造成自上而下的液体流动,将凝胶中的单链DNA条带经冲洗、转移到位于凝胶上面的硝酸纤维薄膜上,经80摄氏度烘干后可在硝酸纤维薄膜上与探针分子进行杂交。
由于核酸印迹杂交方法是将目的DNA进行原位杂交,没有扩增放大的过程,PCR[7]检测方法比该检测方法要高。
2.2.2PCR检测方法
通过一些方法对目标序列进行扩增之后利用不同方法对扩增的产物进行检测。
方法不同效果也不一样。
按照是否能进行定量分析,常见的PCR检测方法又可分为定性PCR、复合定性PCR、PCR-ELISA、竞争性定量PCR以及定时定量PCR等。
(1)定性PCR(QualitativePCR)
首先对特异性的DNA片段进行PCR扩增,然后将扩增后的产物通过琼脂糖凝胶电泳进行凝胶分离,最后采用凝胶成像系统进行观察。
定性PCR最常用的目标序列是CaMV35S启动子、NOS终止子或pat等标记基因。
定性PCR检测灵敏度通常比较高,在20pg~10ng目标DNA或在转基因产品中的质量分数为0.0001%~1.0000%能够被检[8]出。
Vollenhofer等针对35SCaMV启动子、NOS终止子和抗生素标记基因npt3个位点设计引物,采用定性聚合酶链反应筛选玉米和抗草甘膦转基因大豆,并通过限制性内切酶与分子[9]杂交试验验证结果。
(2)复合定性PCR(MutiplexPCR)
在PCR反应体系中加入2对或2对以上引物,一次性扩增多个序列的反应过程,来判断是否为转基因产品。
陈贞[10]等采用七重PCR体系,检测出转基因油菜内源基因PEP、抗除草剂基因(BAR、PAT)、筛选基因NPT、常见启动子(CaMV35S、FMV35S)和终止子NOS基因,具有准确、高效、适用推广的特点。
与传统定性方法相比,该方法具有快速、高效的特点,在定性检测方面具有良好的应用前景。
(3)PCR-ELISA
PCR-ELISA是一种PCR高效与ELISA高特异性结合在一起的转基因检测方法[11]。
本法是通过亲和素包被微孔板然后再用生物素标记捕获探针3′端,通过其交联作用将捕获探针放在微孔上后制成固相捕捉系统。
其次,在扩增时使用抗原标识,这样扩增产物中就会带有抗原。
用扩增产物与微孔上的捕获探针杂交,靶序列被捕获。
再在微孔中加入辣根过氧化物酶标记的抗体,抗体与靶序列上的抗原结合,再加入底物使之显色,颜色反应通过酶标仪读数。
陈茹等利用地高辛标记的PCR-ELISA进行比较检测转基因大豆与玉米的常用外源基因。
结果表明PCR-ELISA检测比常规电泳检测的灵敏度高1000倍,检出限达0.1%。
(4)竞争定量PCR(QuantitativecompetitivePCR,QC-PCR)
竞争定量PCR是在同一之反应管中,加入未知含量的待测模版和已知含量的内标模版-竞争性模版,两者可以用同一对引物同时扩增且具有相同的扩增效率,最后通过扩增产物的差异将PCR产物分开,分析对比PCR产物的拷贝数而对未知模版定量。
这种方法对实验设备要求不高,但需要利用核酸重组技术构建内部标准竞争脱氧核糖核酸,对于一般实验室很难。
1998年欧盟的12个实验室使用该法对含有0.5%和2%的抗草甘膦转基因大豆(RRS)进行检测,与定性PCR法相比,大大降低了实验室间的试验误差,可以对转基因食品中的GMOs含量进行测定。
(5)实时定量PCR(Real-timequantitativePCR)
实时荧光定量PCR经过加入荧光基团,通过荧光信号累积实时检测整个PCR历程,最后通过标准曲线完成对未知模版定量的分析[11],如图3所示。
实时荧光定量聚合酶链反应过程中,随着反应周期数的增加,拷贝数呈指数增加,并逐渐转移到平台期,利用荧光信号累积实时监测整个聚合酶链反应进程,由于PCR每进行一次循环,PCR产物的量与荧光信号的强度呈对应关系,因此可以推测模版的最初含量。
由于每一个模版循环参数(Ct值)与该模版起始拷贝数的对数值之间有严格的线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小[12]。
准确测定初始核糖核酸的数目[13],是根据正梯度标准的Ct值。
图3RQ-PCR扩增图
Fig.3RQ-PCRamplificationplot
实时荧光定量PCR中反应信号的检测贯穿于整个反应过程,适于高通量和常规分析,是当前应用最广的转基因生物定量检测方法。
我国已经初步建立了以TaqMan为探针的荧光定量PCR法,用在转基因农作物或初加工制品玉米、大豆、豆粉)进行定量检测,检测灵敏度均达到了0.1%[14]。
通常,荧光染料成本较低廉,实验设计简便;而探针杂交技术具备更高的特异性和精确度。
目前,TapMan荧光定量PCR方法由于其探针的简单和高度特异性应用最广泛。
但主要缺点是荧光标记探针会在一些食物基质中水解,另外操作的仪器相对来说比较贵。
3其他检测方法
伴随着国内外对转基因产品检测研究的深入展开,以及各国对转基因产品检测要求越来越高,更加急切的需要更加准确、快速、高效、安全且成本低廉的检测技术的应用与发展。
于是一些新的检测技术应运而生。
目前基因芯片、近红外光谱、表面等离子共振技术等在转基因实际检测中都有所应用。
3.1基因芯片检测方法
基因芯片又称DNA芯片,是将大量特定的寡核苷酸片段或基因片段有序的、高密度的排列,固定于固相支持物如硅片、尼龙等,然后将测试样品的核酸分子经过同位素或荧光物质标记,与固定在固相支持物上的DNA阵列中的点按碱基配对原理同时进行杂交,利用激光共聚焦荧光检测系统扫描芯片,样品分子的数量和序列信息通过使用计算机软件分析杂交信号获得。
可以一次性检测和分析样品中的大量序列,从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足[15]。
目前,转基因生物及其产品中常用的ELISA和PCR技术最大的缺点是检测范围窄、效率低。
而当前研究基因在转基因产品中所涉及的数量上万,目前正在研究的转基因产品所涉及的基因数量有上万种,将来都有可能进入商品化的生产,DNA芯片检测由于一次能够定性挑选大量不同种类的基因修饰物而得到了高度重视。
基因芯片技术短短的十几年内在食品领域取得了丰硕成果。
我国利用基因芯片技术开发了多种转基因植物检测芯片:
判断待检样品是否为转基因产品的普通筛选型芯片;通过检测大豆、玉米、棉花、油菜等样品中可能含有的外源基因和内源基因判断是否含有转基因成分的综合检测芯片;可检测转基因产品品系的检测鉴定芯片,我国开发的转基因抗虫棉花、华番一号番茄等。
3.2近红外光谱检测技术(NIRspectroscopy)
近红外光谱是20世纪70年代兴起的一项化学成分快速定量测定技术。
波长范围在780~2526nm的电磁辐射波,是人们在吸收光谱中发现的第一个非可见光区。
该波长的吸收主要是分子中C-H、N-H、O-H基团基频振动的倍频吸收与合频吸收产生的,不同基团产生的光谱在吸收峰位置和强度上有所不同,在进行定性、定量分析时,通过建立样品中某一物化性质与近红外光谱之间的关系,就能从未知样品NIR光谱求出性质或组成数据。
根据各个含氢基团的近红外吸收特点来测定样品中糖、淀粉、氨基酸、水分、脂肪、酸等成分[16]。
利用近红外光谱技术分析样品具有高效、准确、方便、快速.和成本较低、不消耗化学试剂、不破坏样品、不污染环境等特点。
因此该技术也受到越来越多人的关注与喜爱。
但是该方法也有一些缺陷,其主要缺点是精确度不高,需要分析大量的样品而且建立模型才能得出结果。
祝诗平等利用近红外光谱方法对转基因菜籽油进行快速鉴别研究,结果表明总体判别正确率为96.34%[17]。
4结论与展望
转基因食品是近年来的发展的新兴事物,但发展之迅速是显而义见的。
对于人们心里对转基因食品的疑虑是在所难免的,然而人们应该明白转基因食品给人们带来的好处,现在所要考虑的是能有效地减少或避免对人类健康及其生存环境可能产生的潜在危害。
转基因检测技术的发展无疑对于消除人们的疑虑,使公众拥有对转基因食品的知情权。
本文介绍了转基因食品检测技术的一些发展进程,但主要是两大类,一类是基于外源蛋白质靶标的蛋白质检测方法;另一类是基于核酸靶标的核酸检测方法;蛋白质类的检测方法又分为蛋白质印迹法、酶联免疫吸附法、侧向型流动检测法等,最常用的酶联免疫吸附法因灵敏度高,操作简单,用时较少,适合于现场检测。
但因为没有合适的用于定量的内标蛋白,不能对转基因含量进行精确定量分析。
而核酸类的检测方法分为SouthernBlot、基于PCR类的检测方法,常用的PCR检测方法实时荧光定量PCR,荧光染料成本低廉,实验设计简便;而探针杂交技术具有更高的特异性和精确度,但主要缺点是探针易水解,仪器较贵。
但是最新研究的基因芯片检测方法、近红外光谱检测技术不但克服了这些缺点,基因芯片技术可以对样品大量序列分析,从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作效率低等不足;近红外光谱技术分析样品具有高效、准确,成本较低、不消耗化学试剂、不破坏样品、不污染环境。
由于这些优点广泛被人们所喜爱。
食品检测方法向着不断完善的步伐迈进。
科技瞬息万变,生物在不断的发展与探索中,转基因食品的检测方法也呈现多种多样,但各有也有其优缺点。
我们应该根据食品种类和加工类型的不同,以及含有的转基因片段的不同,选
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