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专题六第2讲docx
第2讲 基因工程和细胞工程
[考纲要求] 1.基因工程的诞生(A)。
2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(B)。
3.基因工程的应用(B)。
4.蛋白质工程(A)。
5.植物的组织培养(B)。
6.动物的细胞培养与体细胞克隆(A)。
7.细胞融合与单克隆抗体(B)。
1.基因工程
(1)基因工程的3种基本工具
①限制性核酸内切酶:
识别特定核苷酸序列,并在特定位点上切割DNA分子。
②DNA连接酶:
a.E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端;b.T4DNA连接酶能连接黏性末端和平末端。
③载体:
需具备的条件包括:
a.能在宿主细胞内稳定存在并大量复制;b.有一个至多个限制酶切割位点;c.具有特殊的标记基因,以便对含目的基因的受体细胞进行筛选。
(2)获取目的基因的途径:
①从基因文库中获取;②利用PCR技术扩增;③化学方法直接人工合成。
(3)基因表达载体的组成:
启动子、目的基因、终止子及标记基因等。
(4)将目的基因导入受体细胞
①植物:
体细胞或受精卵——常用农杆菌转化法(双子叶植物和裸子植物)、花粉管通道法、基因枪法(单子叶植物)。
②动物:
受精卵——显微注射技术。
③微生物:
细菌(常用大肠杆菌)——感受态细胞法(钙离子处理法)。
(5)目的基因的检测与鉴定方法
①检测目的基因是否插入转基因生物的DNA上:
DNA分子杂交技术。
②检测目的基因是否转录出mRNA:
分子杂交技术。
③检测目的基因是否翻译成蛋白质:
抗原—抗体杂交技术。
④个体生物学水平鉴定:
根据表达性状判断。
易错辨析
(1)限制酶≠DNA酶≠解旋酶
限制酶的作用是识别双链DNA分子上某种特定的核苷酸序列,并使两条链在特定的位置断开;DNA酶的作用是将DNA水解为基本组成单位;解旋酶的作用是将DNA两条链间的氢键打开形成两条单链。
(2)DNA连接酶≠DNA聚合酶
DNA连接酶能连接两个DNA片段,而DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上。
(3)启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA上);
终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA上)。
2.细胞工程
(1)植物组织培养
①培养基的组成:
大量元素、微量元素、有机物、蔗糖及植物激素、琼脂等。
添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。
②若生产人工种子,则培养到胚状体阶段;若提取细胞产物,则一般培养到愈伤组织阶段;若培育新个体,则应培养到试管苗阶段。
(2)植物体细胞杂交的关键
①酶解法——用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁。
②促融剂——常用聚乙二醇。
③杂种细胞的形成标志——新细胞壁的形成。
④培养杂种植株的技术——植物组织培养。
⑤杂种植株培育成功的原理——离体的植物细胞具有全能性。
(3)动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用不同
第一次:
处理剪碎的组织,使其分散成单个细胞;
第二次:
使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来。
(4)原代培养与传代培养的区别
区分原代培养和传代培养的关键是是否分瓶培养。
细胞贴壁生长到一定程度需要用胰蛋白酶处理,然后再分瓶培养,让细胞继续增殖,这样的培养过程通常称为传代培养。
(5)克隆动物时选择受体细胞为去核卵母细胞的原因
①营养丰富;②体积大,易操作;③含有激发细胞核全能性表达的物质。
1.借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来( )
2.启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用( )
3.转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测( )
4.重组质粒与探针能进行分子杂交是因为DNA分子脱氧核糖和磷酸交替连接( )
5.细胞核移植主要在同种动物、同种组织的细胞之间进行( )
6.乳腺细胞比乳腺癌细胞更容易进行离体培养( )
7.PEG是促细胞融合剂,可直接诱导植物细胞融合( )
8.用原生质体制备人工种子,要防止细胞破裂( )
答案 1.√ 2.× 3.× 4.× 5.× 6.× 7.× 8.×
1.基因表达载体的构建过程中,使用两种识别序列不同的限制酶切割目的基因和质粒的目的是避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接。
2.核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个原因:
卵母细胞的细胞质中含有少量的遗传物质;发育过程中可能发生基因突变或染色体变异;外界环境可能引起不遗传的变异。
考点一 基因工程
1.真核生物的cDNA文库与基因组文库
文库类型
cDNA文库
基因组文库
基因中启动子和内含子
无
有
文库大小
小
大
基因多少
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
物种间的基因交流
可以
部分基因可以
2.PCR技术扩增
(1)原理:
DNA双链复制。
(2)条件:
模板DNA、引物、游离的dNTP(dCTP、dATP、dGTP、dTTP)、热稳定DNA聚合酶。
(3)过程
3.限制酶的选择方法
(1)选择的限制酶的切点不能位于目的基因内部,也不能位于标记基因内部,否则会破坏目的基因或标记基因,上图中不能选择SmaⅠ。
(2)应选择切点位于目的基因两端的限制酶,同时质粒上也有其切点,如上图中可选择PstⅠ。
(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如上图也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
4.蛋白质工程
考向一 基因工程的基本流程分析
1.(2019·江苏,33)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图,载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。
请回答下列问题:
(1)EcoRⅤ酶切位点为,EcoRⅤ酶切出来的线性载体P1为________末端。
(2)用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段,其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。
载体P1用酶处理,在两端各添加了一个碱基为____________的脱氧核苷酸,形成P2;P2和目的基因片段在________酶作用下,形成重组质粒P3。
(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落,采用含有不同抗生素的平板进行筛选,得到A、B、C三类菌落,其生长情况如表(“+”代表生长,“-”代表不生长)。
根据表中结果判断,应选择的菌落是______(填表中字母)类,另外两类菌落质粒导入情况分别是________________、________________。
菌落类型
平板类型
A
B
C
无抗生素
+
+
+
氨苄青霉素
+
+
-
四环素
+
-
-
氨苄青霉素+四环素
+
-
-
(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR鉴定。
图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,PCR鉴定时应选择的一对引物是________。
某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段,原因是____________________。
答案
(1)平
(2)胸腺嘧啶(T) DNA连接 (3)B A类菌落含有P0 C类菌落未转入质粒 (4)乙、丙 目的基因反向连接
解析
(1)EcoRⅤ酶切位点在酶所识别序列的中心轴线处,产生的是平末端。
(2)DNA连接酶对平末端的连接效率较低,因此通常要将平末端改造成黏性末端后再进行连接。
由于目的基因片段的两端各自带一个腺嘌呤脱氧核苷酸,根据碱基互补配对原则,处理后的质粒两端需要各添加一个碱基为胸腺嘧啶的脱氧核苷酸;要将处理后的质粒与目的基因连接起来,需要用DNA连接酶。
(3)由于四环素抗性基因中含有EcoRⅤ酶识别的序列及切割位点,所以形成的重组质粒中四环素抗性基因已经被破坏,而氨苄青霉素抗性基因正常。
根据表中结果可知,A菌落抗氨苄青霉素和四环素,说明A菌落中导入的是P0质粒;B菌落抗氨苄青霉素而不抗四环素,说明B菌落中导入的是重组质粒;C菌落既不抗氨苄青霉素,也不抗四环素,说明C菌落中没有导入质粒。
(4)由于处理后的P0质粒的两个末端都含一个胸腺嘧啶的脱氧核苷酸,而目的基因片段的两端各自带一个腺嘌呤脱氧核苷酸,所以目的基因在和P0质粒连接时可能会出现两种情况:
正向连接和反向连接。
分析图2可知,理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。
如果选择甲和丙这对引物,则无论目的基因是否正确插入,扩增的片段都是50bp+300bp+100bp=450bp,不符合要求;如果选择乙和丙这对引物,正向连接和反向连接后所得结果不同,所以应选择乙和丙这对引物进行PCR鉴定。
如果目的基因和P0质粒反向连接,则引物乙会出现在重组质粒的外侧,此时若加入引物甲和乙,则可以扩增出300bp+100bp=400bp的片段。
2.(2019·全国Ⅰ,38)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。
回答下列问题:
(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成,也可以从基因文库中获得。
基因文库包括____________________和______________。
(2)生物体细胞内的DNA复制开始时,解开DNA双链的酶是____________。
在体外利用PCR技术扩增目的基因时,使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________________。
上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是___________
_______________________________________________________________________________。
答案
(1)基因组文库 cDNA文库
(2)解旋酶 加热至90~95℃ 氢键
(3)Taq酶热稳定性高,而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
解析
(1)基因文库包括基因组文库和cDNA文库。
(2)生物体细胞内DNA复制开始时是利用解旋酶进行解旋的,而在体外利用PCR技术扩增目的基因时,则是通过加热至90~95℃进行解旋的,二者都破坏了碱基对之间的氢键。
(3)在PCR过程中,要加热至90~95℃,所以使用热稳定性高的Taq酶,而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。
3.(2019·甘肃张掖质检)请回答下列有关基因工程及其应用的问题:
(1)多种限制酶、__________________及逆转录酶的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
(2)基因工程的核心步骤是__________________________________________________;重组Ti质粒载体结构中T-DNA的作用是_________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
(3)科学家设法使烟草细胞形成微创伤,受伤部位细胞产生的乙酰丁香酮可吸引农杆菌向受伤部位集中,这时农杆菌可携带某种目的基因进入烟草细胞。
获得的转基因烟草细胞通过__________________________技术最终获得转基因烟草,检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因的方法是__________________________。
(4)利用_______________________处理植物体细胞可得到原生质体,将目的基因导入原生质体的方法中,除题(3)所述方法外,还可采用______________________。
答案
(1)DNA连接酶
(2)构建基因表达载体 携带目的基因进入植物细胞并整合到植物细胞中染色体的DNA上 (3)植物组织培养 DNA分子杂交技术 (4)纤维素酶和果胶酶 基因枪法
解析
(1)切割目的基因需要用限制酶,利用反转录法获得目的基因需要用到逆转录酶,而将目的基因与载体相连需要用到DNA连接酶。
(2)基因工程的核心步骤是构建基因表达载体;重组Ti质粒载体结构中T-DNA为可转移DNA,可以携带目的基因进入植物细胞并整合到植物细胞中染色体的DNA上。
(3)将获得的转基因烟草细胞最终培养成转基因烟草需要用到植物组织培养技术;检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因,可以采用DNA分子杂交技术。
(4)植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶,因此利用纤维素酶和果胶酶处理植物体细胞可得到原生质体;将目的基因导入原生质体的方法中,除了农杆菌转化法,还有基因枪法。
考向二 基因工程的实践应用
4.(2019·江苏,16)下列生物技术操作对遗传物质的改造,不会遗传给子代的是( )
A.将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌,筛选获得基因工程菌
B.将花青素代谢基因导入植物体细胞,经组培获得花色变异植株
C.将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵,培育出产低乳糖牛乳的奶牛
D.将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者,进行基因治疗
答案 D
解析 A、B、C项均采用了基因工程技术,基因工程依据的原理是基因重组,且参与繁殖的细胞中均含有目的基因,故可遗传给子代,A、B、C项不符合题意;D项也采用了基因工程技术,但只有患者的淋巴细胞中含有目的基因,患者的生殖细胞中不含目的基因,故不能遗传给子代,D项符合题意。
5.(2019·广东珠海一模)α-抗胰蛋白酶可以治疗肺气肿等疾病。
下图是科学家培育含人α-抗胰蛋白酶基因(mAAT)的转基因山羊的流程图,请据图回答下列相关问题:
获取mAAT基因→构建基因表达载体→显微注射导入山羊受精卵→形成胚胎→将胚胎移入受体母羊→发育成转基因山羊
(1)利用PCR技术对mAAT基因进行扩增,前提是要有一段以mAAT基因的核苷酸序列为模板合成的________。
扩增过程中,该物质与DNA模板链的3′端结合,理由是______________
__________________________________。
(2)目的基因可以直接从生物体分离得到,也可以通过人工合成获取。
请推测由mRNA反转录合成mAAT基因的大致过程:
____________________________________________________
_____________________________________________________________(用文字和箭头表述)。
(3)构建基因表达载体的目的是_____________________________________________________
________________________。
为了使mAAT基因只在山羊乳腺细胞中表达,需要在构建表达载体时在mAAT基因前端加上在乳腺细胞中特异性表达的__________,同时还需要有标记基因,其作用是___________________________________________________________________。
(4)胚胎移植中,应选择有________________________的个体作为受体母羊,并对受体母羊进行同期发情处理。
答案
(1)引物 DNA合成只能从3′端延伸
(2)mRNA
DNA、RNA杂交双链→单链DNA
mAAT基因
(3)使目的基因在受体细胞中稳定存在并可遗传给下一代,同时使目的基因能够表达和发挥作用 启动子 为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来 (4)健康体质和正常繁殖能力
解析
(1)利用PCR技术对mAAT基因进行扩增,前提是要有一段以mAAT基因的核苷酸序列为模板合成的引物。
由于DNA合成时只能从3′端延伸,因此扩增过程中,该物质应与DNA模板链的3′端结合。
(2)由mRNA反转录合成mAAT基因的大致过程:
mRNA
DNA、RNA杂交双链→单链DNA
mAAT基因。
(3)构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在并可遗传给下一代,同时使目的基因能够表达和发挥作用。
启动子是转录过程中RNA聚合酶的识别位点,为了使mAAT基因只在山羊乳腺细胞中表达,需要在构建表达载体时在mAAT基因前端加上在乳腺细胞中特异性表达的启动子;标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
(4)胚胎移植中,应选择有健康体质和正常繁殖能力的个体作为受体母羊,并对受体母羊进行同期发情处理。
6.(2019·山东烟台模拟)用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如下图所示。
据图回答下列问题:
(1)①过程所需的酶是________________。
在构建基因表达载体过程中,构建的重组质粒上启动子的本质和作用分别是_________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
(2)实现②过程常用PCR技术,该技术的前提是要有________________________________,以便合成引物。
(3)过程③将基因表达载体导入大肠杆菌时,首先用Ca2+处理大肠杆菌,目的是_____________
_______________________________________________________________________________。
然后将________________________溶于缓冲液中与该大肠杆菌混合,在一定温度下完成转化。
答案
(1)逆转录酶 启动子的本质是一段有特殊结构的DNA片段;作用是供RNA聚合酶的识别、结合以驱动目的基因的转录
(2)一段已知目的基因的核苷酸序列
(3)使大肠杆菌处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 重组表达载体DNA分子(或重组质粒)
解析
(1)题图中过程①表示利用mRNA通过反转录法合成相应的DNA的过程,需要逆转录酶的催化;基因表达载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子等,其中启动子的本质是一段有特殊结构的DNA片段,其作用是供RNA聚合酶的识别、结合以驱动目的基因的转录。
(2)利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便合成引物。
(3)在将目的基因导入大肠杆菌时,需要先用Ca2+处理大肠杆菌,使得大肠杆菌处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,然后将重组质粒溶于缓冲液中与该大肠杆菌混合,在一定温度下完成转化。
考点二 细胞工程
1.细胞工程技术的原理
(1)植物组织培养:
细胞的全能性。
(2)植物体细胞杂交:
细胞的全能性、细胞膜的流动性。
(3)动物细胞培养:
细胞的增殖。
(4)动物体细胞核移植及克隆:
动物细胞核的全能性。
(5)动物细胞融合:
细胞膜的流动性。
(6)单克隆抗体的制备:
细胞膜的流动性、细胞的增殖。
2.植物细胞工程两大技术
(1)植物组织培养中植物激素的使用
生长素与细胞分裂素的比值
作用效果
高
促进根分化、抑制芽形成
低
促进芽分化、抑制根形成
适中
促进愈伤组织形成
(2)植物体细胞杂交
①植物细胞A和植物细胞B杂交获得的杂种细胞的类型有三种(只考虑细胞的两两融合):
AA型、BB型、AB型,符合要求的只有AB型,需要进行筛选。
②杂种植株遗传物质的变化:
杂种植株的染色体数通常是两亲本细胞染色体数目之和,属于异源多倍体。
杂种植株的变异类型属于染色体变异。
3.克隆动物的培育
(1)所需技术手段:
动物细胞培养、动物细胞融合、早期胚胎培养和胚胎移植等。
(2)克隆动物遗传物质的来源:
绝大部分来自供体细胞核,少部分来自卵母细胞的细胞质。
4.单克隆抗体的制备
(1)3种细胞的特点
①经免疫处理的B淋巴细胞:
能分泌抗体,不能大量增殖。
②骨髓瘤细胞:
能大量增殖,不能分泌抗体。
③杂交瘤细胞:
既能分泌抗体,又能大量增殖。
(2)2次筛选的目的
①第1次筛选:
利用特定选择培养基筛选,获得杂交瘤细胞,即AB型细胞(A为经免疫处理的B淋巴细胞,B为骨髓瘤细胞)。
②第2次筛选:
利用多孔板法和抗原—抗体杂交法筛选,获得产生特定抗体的杂交瘤细胞。
考向一 植物细胞工程
7.(2019·江苏,20)为探究矮牵牛原生质体的培养条件和植株再生能力,某研究小组的实验过程如图。
下列叙述正确的是( )
A.过程①获得的原生质体需悬浮在30%蔗糖溶液中
B.过程②需提高生长素的比例以促进芽的分化
C.过程③需用秋水仙素处理诱导细胞壁再生
D.原生质体虽无细胞壁但仍保持细胞的全能性
答案 D
解析 过程①是制备原生质体,获得的原生质体若悬浮在30%的蔗糖溶液中会导致原生质体失水皱缩甚至死亡,A项错误;过程②为再分化过程,需提高细胞分裂素的比例以促进芽的分化,B项错误;过程③不需要用秋水仙素处理,愈伤组织细胞已经具备细胞壁,C项错误;原生质体虽无细胞壁,但含有细胞核等结构,即含有个体发育所需的全部遗传信息,故原生质体仍保持细胞的全能性,D项正确。
8.(2019·全国Ⅱ,38)植物组织培养技术在科学研究和生产实践中得到了广泛的应用。
回答下列问题:
(1)植物微型繁殖是植物繁殖的一种途径。
与常规的种子繁殖方法相比,这种微型繁殖技术的特点有________________________________________________________________________
__________________________________________________________________(答出2点即可)。
(2)通过组织培养技术,可把植物组织细胞培养成胚状体,再通过人工种皮(人工薄膜)包装得到人工种子(如图所示),这种人工种子在适宜条件下可萌发生长。
人工种皮具备透气性的作用是____________________________。
人工胚乳能够为胚状体生长提供所需的物质,因此应含有植物激素、____________和________等几类物质。
(3)用脱毒苗进行繁殖,可以减少作物感染病毒。
为了获得脱毒苗,可以选取植物的________进行组织培养。
(4)植物组织培养技术可与基因工程技术相结合获得转基因植株。
将含有目的基因的细胞培养成一个完整植株的基本程序是___________________________________________________(用流程图表示)。
答案
(1)能保持植物原有的遗传特性,繁殖速度快
(2)有利于胚状体进行呼吸作用 矿质元素 糖 (3)茎尖 (4)含目的基因的细胞
愈伤组织
小植株
解析
(1)与常规的种子繁殖方法相比,植物微型繁殖技术具有能保持植物原有的遗传特性、繁殖速度快等特点。
(2)人工种皮具有透气性,有利于胚状体进行呼吸作用;人工胚乳能够为胚状体生长提供植物激素、矿质元素和糖等物质。
(3)植物分生区附近的病毒极少,甚至无病毒。
为获得脱毒苗,可以选取植物的茎尖进行组织培养。
(4)将含有目的基因的细胞培养成一个完整植株的基本程序是含目的基因的细胞
愈伤组织
小植株。
9.(2019·全国Ⅲ,38)培养胡萝卜根组织可获得试管苗,获得试管苗的过程如图所示。
→
→
―→
① ② ③
→
→
④ ⑤ ⑥
回答下列问题:
(1)利用胡萝卜根段进行组织培养可以形成试管苗。
用分化的植物细胞可以培养成完整的植株,这是因为植物细胞具有______________________。
(2)步
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