第五讲2中药及其制剂定量分析的方法学.docx
- 文档编号:30463660
- 上传时间:2023-08-15
- 格式:DOCX
- 页数:10
- 大小:20.67KB
第五讲2中药及其制剂定量分析的方法学.docx
《第五讲2中药及其制剂定量分析的方法学.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《第五讲2中药及其制剂定量分析的方法学.docx(10页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
第五讲2中药及其制剂定量分析的方法学
第五讲2中药及其制剂定量分析的方法学
第五讲2中药及其制剂定量分析的方法学
一、提取方法的选择
由于在提取过程中参与因素较多,所以一般以正交设计试验筛选提取条件。
(1)提取方式
(2)浸泡时间(3)提取时间
二、分析方法的选择
用于中药含量的测定方法很多,在选用分析方法时,要根据被测成分的性质、干扰成分的性质等因素进行综合考虑。
另外还要考虑方法的灵敏性、准确性和普及性。
中药制剂含量测定大多需用对照品。
(1)国家标准收载的含量测定用对照品
(2)国家标准收载的定性鉴别用对照品
(3)自制对照品,需经过结构确认、纯度检查和含量测定等几个步骤。
三、测定条件的选择
选择的原则要根据仪器性能和测试方法进行选择
如化学分析中指示剂种类、指示剂用量及终点颜色的选择;
可见分光光度法中显色剂种类、最大吸收波长、显色剂用量、最佳pH值、最佳显色温度、最佳显色时间及线性范围的选择;
紫外分光光度法中最佳pH值、最大吸收波长及吸收系数的测定等;
薄层扫描法中展开剂选择、显色剂选样、检测方式选择、最大吸收波长选择、仪器的线性比参数选择、测定方式、狭缝宽度、扫描宽度、灵敏度等;
气相色谱法中固定相选择、检测器选择、内标物选择、柱效的测定、分离度测定等;
高效液相色谱法中固定相选择、流动相选择、检测器选择、最大吸收波长选择(紫外检测器)、内标物选择、柱效的测定、分离度测定等。
四、线性范围试验
线性范围试验的意义
范围试验目的有以下三种。
(1)确定样品浓度或样品量与响应值是否呈线性关系
(2)确定样品浓度或样品量的线性范围
(3)考察标标准曲线是否通过原点,以便确定采用一点法或二点法定量相关系数r
五、稳定性试验
六、精密度试验RSD
(七、重复性试验)
八、耐用性试验
九、灵敏度
分析方法的灵敏度是指单位浓度(或量)与响应值的比值。
检测限:
以信噪比来确定检测限的最低水平。
十、空白试验
空白试验是消除测定过程中系统误差的一个重要手段。
空白试验是在不加试样的情况下,按照试样的分析步骤和条件而进行分析的试验。
在中药制剂分析中,因为常常是测量成药中某一味中药中的某一比学成分,要想得到真正的“空白”比较困难。
所以常用阴性对照法。
十一、回收率
1.加样回收率
即于已知被测成分含量的成药中再精密加入一定量的被测成分纯品
2.以成药空白所做的加样回收率
在成药空白(即除去欲测成分的药材后制成的成药)中加入一定量的被测纯品,依法测定。
示例治伤软膏中苦参碱的含量测定
■苦参为豆科植物苦参SophoraflavescensAit.的干燥根,具有清热燥湿,杀虫,利尿的功效。
苦参中主要含生物碱类成分,有:
苦参碱(Matrine)、氧化苦参碱(Oxymatrine)、槐定碱(Sophoridine)、槐果碱(Sophocarpine)、氧化槐果碱(Oxysophocarpine)等
■本研究建立了HPLC法测定治伤软膏中苦参碱的含量,以控制治伤软膏的质量。
1.试剂和仪器
■ShimadzuLC-2010CHT高效液相色谱仪;CLASS-VPV6.14色谱工作站(日本岛津公司)■苦参碱对照品(供含量测定用),批号110805-200306;氧化苦参碱,批号110780-200306;槐定碱,批号110734-200303;氧化苦参碱,批号111652-200301,均购自中国药品生物制品检定所;
■槐果碱,成都曼思特生物科技有限公司,HPLC纯度≥98%;
2色谱条件的选择
2.1固定相的选择
■曾采用苯基柱、C8、ODS、硅胶柱、DIOL和氰基柱,苦参碱、槐定碱和槐果碱均不能达到良好的分离;
■考虑到用反相色谱柱时,软膏基质影响色谱柱寿命
■最终参考苦参国家标准中苦参碱、氧化苦参碱的含量测定方法,选用氨基键合硅胶为固定相,本试验采用LichrospherNH2(4.6×250mm,5μm,江苏淮阴汉邦科技有限公司)色谱柱。
2.2流动相的选择
■采用氨基柱,试验了如下几种流动相系统,见表1。
最终采用苦参国家标准中苦参碱、氧化苦参碱含量测定用流动相:
乙腈-无水乙醇-3%磷酸,结合本药实际情况,将比例调整为84:
9:
7。
表1流动相系统的选择
流动相组成
结果
乙腈-无水乙醇-3%磷酸(80:
10:
10)
苦参碱出峰太早,有干扰
乙腈-无水乙醇-3%磷酸(84:
9:
7)
苦参碱出峰时间合适,无干扰
乙腈-无水乙醇-0.1%磷酸(TEA调节PH至2.5)(80:
10:
10)
苦参碱出峰太慢
2.3检测波长的选择
■采用苦参国家标准中苦参碱、氧化苦参碱的含量测定用波长220nm。
3前处理方法的选择
■先后采用甲醇水浴提取法,乙醇水浴提取法,氯仿放置过夜提取法,氯仿振摇提取法,氯仿回流法,氯仿超声提取法。
■甲醇、乙醇水浴提取方法简单,但提取出的成分复杂,干扰苦参碱的测定。
■以氯仿作为提取溶剂提取率高且杂质干扰少,我们比较了以下几种提取方法:
氯仿放置过夜提取法、氯仿振摇提取法、氯仿回流法、氯仿超声提取法。
氯仿放置过夜提取和氯仿振摇提取法提取率均不高且操作不便,费时。
通过比较,超声提取和回流提取测得的含量接近,因超声提取操作步骤简单,所以选择此方法处理供试品。
3.1超声时间的考察
表2超声时间的考察
超声时间(min)
20
30
40
50
60
苦参碱含量(%)
0.056
0.060
0.060
0.065
0.065
3.2冰浴时间的考察
■为了防止软膏中脂溶性基质影响色谱柱寿命,采取冰浴的方式使脂溶性基质尽可能析出,再离心除去。
表3冰浴时间的考察
冰浴时间(min)
20
40
50
60
70
测得含量(%)
0.056
0.056
0.056
0.057
0.057
试验结果表明:
冰浴1小时以内不会造成样品含量降低考虑时间长有利于基质析出,最终确定为60min。
3.3复溶溶剂的选择
■曾选用甲醇作为复溶溶剂,图谱显示对苦参碱峰有干扰,采用流动相复溶没有干扰,所以选择流动相为溶剂。
4测定法
■色谱条件及系统适用性以氨基键合硅胶为填充剂;以乙腈-无水乙醇-3%磷酸溶液(84:
9:
7)为流动相;检测波长220nm。
理论板数按苦参碱峰计算应不低于1500。
■对照品溶液的制备精密称取苦参碱对照品适量,加流动相溶解,制成每1ml含苦参碱80μg的溶液,即得。
■供试品溶液的制备取本品内容物约2.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,尽可能平铺于底部,加氨水1ml,充分浸润膏体后,精密加入氯仿50ml,密塞,称定重量,60℃超声处理(功率250W,频率40kHz)1小时,放冷,再称定重量,用氯仿补足减失的重量,摇匀,转移至分液漏斗中,分取氯仿层,滤过,精密量取续滤液25ml置100ml烧杯中,80℃水浴蒸干,残渣精密加入流动相10ml,密闭,超声3分钟,并时时振摇,所得溶液转移至10ml具塞玻璃离心管中,密塞,置冰浴中静置1小时,离心20分钟(4000转/分),取上清液作为供试品溶液。
■测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
■本品每支含苦参碱(C15H24N20)不得少于10mg。
5方法学验证
5.1专属性试验
①空白溶剂的制备
流动相作为空白溶剂:
乙腈-无水乙醇-3%磷酸(84:
9:
7);
②苦参碱对照品溶液的制备
取苦参碱对照品约10mg,精密称定,置50ml容量瓶中,流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取20ml置50ml容量瓶中,流动相稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液,精密量取20μl,注入液相色谱仪,测定,即得;
③苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、槐果碱、氧化槐果碱混合对照溶液的制备
分别取上述对照品适量,流动相溶解,摇匀,即得;
④不含苦参的阴性对照供试品溶液的制备
取不含苦参的阴性对照软膏内容物约2.5g,依“测定法”中供试品溶液的制备方法操作,即得;
⑤软膏供试品溶液的制备
5.2定量限
■苦参碱对照溶液稀释浓度为每1ml含245ng的溶液时,色谱图中苦参碱的信噪比约为10,所以苦参碱的最低定量限为245ng/ml。
5.3线性试验
■精密称取苦参碱对照品12.25mg,置50ml量瓶中,加流动相溶解并稀释制成每1ml含245μg的溶液,作为贮备液;
■分别精密量取贮备液2、5、10、12.5和20ml于25ml量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,得稀释液
(1)、
(2)、(3)、(4)和(5)。
■分别精密量取各稀释液20μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,测定结果见表。
C(μg/ml)19.64998122.5196245
平均峰面积(A)187387481722961907120682919415452428906
回归方程Y=9943.8X-8472.9
5.4精密度试验
(1)重复性
■取20071101批供试品,照“测定法”项下方法操作,一天内共分析6次,计算含量,结果见表。
表5200071101批治伤软膏重复性试验考察
分析次数
1
2
3
4
5
6
含量(mg/支)
18.1
18.5
18.7
18.4
17.7
18.2
平均值(mg/支)
18.3
RSD%
1.80
(2)中间精密度
■依“测定法”项下操作,甲乙两个操作人员在不同时间,用不同的仪器,每次独立测定苦参碱含量,计算中间精密度,结果见表6。
表6中间精密度试验结果
时间
甲人员(mg/支)
乙人员(mg/支)
第一天(仪器1)
18.5
18.4
第二天(仪器1)
18.6
18.9
第三天(仪器2)
19.0
19.1
平均含量(mg/支)
18.8
RSD%
1.82
(3)进样精密度试验
表7进样精密度试验
分析次数
1
2
3
4
5
6
峰面积
913949
915708
913122
914924
911368
912131
平均值
913534
RSD%
0.18
5.5回收率试验
■取苦参碱对照品约21mg,精密称定,置50ml量瓶中,用纯水溶解并稀释到刻度,制成422.9μg/ml的对照品储备液。
■取20071101批供试品的内容物约1.25g,精密称定,置具塞锥形瓶中,制备9份;分别精密加入苦参碱对照品储备液各1、2、3ml,制成75%、100%和125%三个浓度水平的供试品(每个浓度水平3份),按“测定法”项下测定,由重复性试验知道本批供试品苦参碱含量为0.06%,按下式计算回收率:
■回收率%=(测得总量-内容物含苦参碱量)/对照品加入量(mg)×100%
回收率试验表明,三个浓度水平测定的回收率均在95.0%-105.0%之间
表8苦参碱回收率试验
软膏内容物称取量(g)
对照品加入量(mg)
内容物含苦参碱量(mg)
测得总量(mg)
对照品测得量(mg)
回收率(%)
平均回收率(%)
75%
1.2647
0.423
0.776
1.183
0.407
96.3
95.9
1.2657
0.423
0.777
1.182
0.405
95.7
1.2637
0.423
0.776
1.181
0.406
95.9
100%
1.2645
0.846
0.776
1.606
0.830
98.1
98.2
1.2607
0.846
0.774
1.609
0.835
98.7
1.2678
0.846
0.778
1.606
0.828
97.9
125%
1.2646
1.269
0.776
2.060
1.284
101.2
101.1
1.2680
1.269
0.778
2.058
1.280
100.8
1.2510
1.269
0.768
2.053
1.285
101.3
5.6溶液稳定性试验
表9苦参碱含量测定溶液稳定性试验结果
时间(h)
0
2
4
6
8
12
峰面积
895310
910612
922841
918800
922639
932939
平均值
917190
RSD%
1.41
结果表明:
苦参碱供试品品溶液在12小时内稳定。
5.7耐用性试验
表10含量测定方法的耐用性
变动因素
测得含量(mg/支)
流动相比例:
乙腈-无水乙醇-3%磷酸(84.8:
8.55:
6.65)
18.2
流速:
0.8ml/min
18.8
不同色谱柱:
Lichrospher-NH2(4.6×250mm,5μm)
18.8
柱温:
27℃
18.6
6三批供试品的含量测定
表113批供试品苦参碱量的含量测定
批号
20070702
20071101
20071102
含量(mg/支)
18.1
18.0
18.9
结果表明:
每支软膏中含苦参碱约为18mg。
规定本品每支软膏含苦参碱(C15H24N20)不得少于10mg。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 第五讲2 中药及其制剂定量分析的方法学 第五 中药 及其 制剂 定量分析 方法