植物细胞悬浮培养长期保存的简单而有效的方法.docx
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植物细胞悬浮培养长期保存的简单而有效的方法
植物细胞悬浮培养长期保存的简单而有效的方法
Anne-MarieBoisson,ElisabethGout,RichardBligny*andCorinneRivasseau*
摘要背景:
植物细胞悬浮液每周反复的传代培养需要大量的劳力,并且增加子代细胞的变异率。
大多数的细胞保藏规程是基于冷冻和解冻的控制,存储在液氮中。
然而,细胞解冻后的存活率是不确定的。
植物细胞培养的长期存储和再生依然是一个重点。
结果:
美国梧桐(Acerpseudoplatanus)和拟南芥细胞在不含磷酸盐的营养培养基上悬浮培养,5℃下细胞保存时间超过6个月。
通过数小时测量气体交换监测细胞活力的恢复和利用细胞体内外13C、31P代谢的核磁共振分析,表明细胞生长的重启并没有明显的延迟,也没有观察到可测量的细胞死亡。
结论:
我们提供了一个保护生理上同源的植物细胞培养的简单方法,而不需要通过数月的传代培养。
基于细胞生长的阻碍和培养温度低的这个方案对于异养和半自养的细胞是有效的。
并且应该用来改善这项研究外的细胞株。
它不需要专门的设备,适合常规实验室使用。
关键词:
植物细胞悬浮液美国梧桐拟南芥细胞保藏体内和体外的核磁共振光谱低温磷饥饿
背景
孤立的植物细胞悬浮培养是极具价值的方法,为高通量的研究提供素材,如代谢分析、二级植物产品的生产和除草剂的发现。
它使在细胞生理和生化同源性整体上的实验变得容易。
在液体营养培养基(NM)上大量培养植物细胞的各种不同方法已经被描述了的很长时间[1-4]。
这种方法是基于当大部分最初添加到营养培养基的营养物质,特别是碳水化合物,代谢完时细胞悬液的传代培养已经达到稳定状态。
这将导致或多或少的同源细胞群体,并且常诱导一个继传代培养之后的生长延迟(滞后期)[5]。
这显示为获得同源细胞悬浮培养需要一些精密仪器,如用来优化营养培养基和进行细胞培养的恒化器[6]。
另外,每传代培养一天或者两天同样可以获得同源细胞群[7]。
但涉及很多处理和维护,因此很难执行很长一段时间。
为此,理想上无限周期的用于保存最近优化的细胞悬浮培养的交替法被提出。
除了维护导致明显延迟启动同源细胞悬浮培养的在固体培养基上的愈伤组织之外,大多数的做法是基于冷冻和解冻的控制,存储在液氮中[8-12]。
然而,编者常提及的是在细胞培养生长完全恢复之前解冻后的细胞生长能力通常底下并处于较长的停滞阶段。
最高的生活能力(高达90%)由门杰斯和莫里观察到[13],是经过低温贮藏在二甲基亚砜和山梨醇的拟南芥和烟草细胞。
不过,即使在这种情况下,至少需要一个星期解冻后的细胞才能恢复正常生长和完全重建,并且存在保藏的细胞系可能与最初的细胞相异的风险[14]。
这里,我们描述一个方案,旨在经过几个月的悬浮培养之后维持更高的植物细胞总数,保持细胞同源性,并准备好在恢复到标准培养条件后细胞重新生长。
主要问题是在标准培养基上碳源少于两个星期即被消耗完,随后观察到自体吞噬程序和细胞死亡[15,16]。
为了减少细胞的碳源消耗量,第一个一系列分析实验中细胞培养将在低温下进行。
培养将在低温并缺磷情况下进行,目的在于诱导遏制细胞生长[17]。
为使方案有效,通过同时测量细胞生长和气体交换监测细胞的生理和生化状况,并利用细胞体内外13C、31P代谢的核磁共振图谱分析[18,20]。
核磁共振检测可使探侦测与碳丢失[21]所导致自体吞噬相关基因表达的有关新陈代谢瓦解的早期信号[22]。
利用异养的美国梧桐细胞(AcerpseudoplatanusL.)和半自养的拟南芥细胞(ArabidopsisthalianaL,野生型,哥伦比亚生态型)培养所获得的结果与形成形成层的不含叶绿素的细胞和形成叶组织的发光的叶绿素细胞培养的结果进行比较。
据估计,由于光合作用的进行,细胞对外界的糖类物质的需求减少,因此可以减少对营养培养基的更新。
结果与讨论
22℃和5℃下美国梧桐和拟南芥悬浮培养的细胞生长量
在22℃下,美国梧桐每周传代培养的细胞鲜重(FW)随时间以指数增长而没要迟滞期([7]和图1a)。
稳定期在培养2个星期后开始,相应的细胞鲜重为150±15gl-1。
如果细胞在这个阶段进行传代培养,归因于蔗糖供应的消耗和有关的自体吞噬程序的开始的一个2天迟滞期被观察到。
在5℃下,细胞倍增时间非常长为10天,而在22℃下为2.5-2.7天(图1b)。
有趣的是,营养培养基的PH由最初校准的5.7逐渐增大到7.1-7.3。
这可能是由于在Lamport营养培养基上硝酸盐作为唯一碳源存在和在22℃PH尽管低于6.5,酸化的CO2释放的更低。
在22℃下,拟南芥细胞在光能混合营养型条件下培养的生长量显示一个相似的特性(附图1b)。
细胞密度的倍增时间从2.1-2.3天增加到大约8天。
在以铵盐和硝酸盐为氮源的Murashige和Skoog培养基上培养致使营养培养基的PH逐渐的减少到大约5.0。
一旦培养温度重设回22℃,在5℃下培养超过一个月的这两种类型的细胞的增长率将恢复到标准值(图1和附图1的箭头指示)。
不管这个细胞生长非常缓慢的延长时期,在22℃下细胞重新生长之前没有观察到重大的迟滞期,这表明,细胞在低温下保藏并没有在本质上改变他们的生理特性。
为了证实这个结论,将进行细胞吸收的O2的测量和基于核磁共振控制的代谢物图谱绘制。
22℃和5℃下O2的吸收量
美国梧桐和拟南芥细胞培养于22℃,处于对数生长期时收获并在22℃和黑暗条件下进行测量,测得的O2吸收率分别为350±25和480±40nmolO2min-1g-1细胞鲜重(表1)。
相反,同样的细胞在5℃下培养20天并在5℃和黑暗条件下测量,测得的O2吸收率非常的低,分别平均为72±7和105±10nmolO2min-1g-1细胞鲜重。
有趣的是,在2μMFCCP存在下测量O2的解耦合率,显示在低温下具有更高的相对增长。
美国梧桐河拟南芥细胞的这个增长在22℃下将近60%,在5℃达到100%。
这表明在低温下观测到正常(耦合)的细胞呼吸减少并不是由线粒体基质供应的限制或者是固有的线粒体呼吸作用引起的。
这很可能是由于新生代谢活动的普遍减少和细胞对核苷三磷酸(NTP)需求的相关的减少引起的。
在5℃下经过一个20天的休眠期,把温度增加到22℃可导致耦合和解耦合的细胞的呼吸作用在10分钟之内完全恢复。
在22℃下,拟南芥细胞氧气电极室的照明减少了细胞的氧气吸收大约30%,很可能是由于光合作用的进行产生了O2(表1)。
事实上,在光照下,这些含叶绿素细胞吸收13CO2并把它转变成碳的代谢产物(未公布的结果;23)。
在5℃下,有光照的拟南芥细胞也减少对O2吸收(表1)。
此外,这个减少量要比相应在22℃下观察到的更大,这表明在低温下光照的拟南芥细胞的光合作用的影响力要比它的呼吸作用弱。
尽管如此,即使在5℃下,这些半自养型细胞通过光合作用所产生的O2无法抵消通过呼吸作用消耗的O2量。
细胞在22℃和5℃下培养的代谢物图谱
在22℃和5℃下生长的美国梧桐和拟南芥细胞,代谢产物通过高氯酸(PCA)萃取,获得的提取物运用13C-NMR和31P-NMR光谱分析。
13C-NMR光谱分析表明美国梧桐细胞温度的降低导致它们的碳水化合物和有机酸的存储发生重大的变化。
例如,蔗糖从70-80μmolg-1细胞鲜重减少到30-35μmolg-1细胞鲜重,
图1在22℃和5℃下拟南芥细胞悬浮培养的生长。
细胞按照“材料和方法”描述的方法培养在Lamport营养培养基里。
这些细胞来源于维持在22℃成倍增长并在到达生长稳定期之前多次传代培养的细胞悬液。
细胞浓度(FW)在零时刻为5.0mgml-1。
在22℃(a),细胞在到达稳定期之前成倍增长了10天(在半对数图上呈线性)。
在第14天,细胞浓度稀释到最初的浓度(传代培养),经过两天的生长延迟之后恢复呈对数生长。
在5℃(b),细胞在到达稳定期之前成倍增长了40天。
在分组实验(图1b中的箭头),在5℃下培养20天之后将温度设回到22℃。
这项实验重复5次。
在半对数图中,符号的大小为标准偏差的数量级。
而柠檬酸盐从5.5-6.5μmolg-1细胞鲜重增长到40-48μmolg-1细胞鲜重,脯氨酸从2.5-3.5μmolg-1细胞鲜重增长到8.5-9.5μmolg-1细胞鲜重。
拟南芥细胞在22℃和5℃下都不包含13C核磁共振检测碳水化合物(附图2)。
这意味着无论培养温度如何,它们的细胞内浓度都低于0.5μmolg-1细胞鲜重。
至于有机酸,谷氨酰胺在低温下增加四倍,达到25-30μmolg-1细胞鲜重,而天冬氨酸增加两倍,达到9-10μmolg-1细胞鲜重。
相反,柠檬酸盐和苹果酸盐,而不是延胡索酸,显著下降。
在拟南芥细胞内存在的极低水平的可溶性糖类和低量的淀粉可以促成,为什么仅仅在糖丧失开始的几个小时之后,观察到生理活动大幅下降和大量的转录反应,导致细胞在24小时内死亡[25]。
事实上,在蔗糖饥饿[25]的第一个24小时期间,超过三分之一的悬浮培养的拟南芥细胞的蛋白质含量都减少,然而,这种现象发生在美国梧桐细胞上要2-3天[26,27]。
将在5℃下休眠培养一个月细胞增温至22℃,可导致这两种类型的细胞在几个小时内都恢复到标准13C核磁共振图谱的生长状态。
例如,脯氨酸和谷氨酰胺在低温下积累并且(或着)在缺磷酸[28-30]时的几个小时内代谢完。
可能是由于Lamport营养培养基的PH随时间碱化的事实导致柠檬酸盐和苹果酸盐在美国梧桐细胞上的积累[31]。
相反,观察到在Murashige和Skoog培养基上生长的拟南芥细胞却酸化。
31P-NMR光谱表明在5℃下美国梧桐细胞中的己糖磷酸盐和核苷酸的积累量几乎是22℃下的两倍(在5℃下6-磷酸葡萄糖浓度为0.70-0.80μmolg-1细胞鲜重,在22℃下为0.45-0.50μmolg-1细胞鲜重;在5℃下ATP浓度为140-160nmolg-1细胞鲜重,在22℃下为80-90nmolg-1细胞鲜重)。
在拟南芥细胞中除二磷酸甘油(GPG)在低温下的积累
图2在22℃和5℃下拟南芥细胞培养的高氯酸萃取物的质子-退偶的13C-NMR光谱。
细胞在22℃下传代培养5天(a),在5℃下传代培养20天(b)之后收获。
峰值分配如下:
ref,参照(马来酸盐)用于定量;s,蔗糖;g,葡糖糖;f,果糖;cit,柠檬酸盐;mal,马来酸盐;suc,琥珀酸盐;pro,脯氨酸。
(3)外,获得相似的结果。
GPG是一种磷酸二脂,涉及磷脂酰甘油的代谢,是叶绿体膜上唯一丰富的磷脂。
重要的是,在这两种细胞系中磷酸胆碱和天门冬酰胺都不积累,表明在细胞缺少碳供应时将导致细胞质的自体吞噬进程缺乏[15,16]。
在5℃下经过20天的休眠期细胞,温度升高到22℃导致磷酸己糖和核苷酸在10-15分钟内恢复到标准细胞浓度。
碳水化合物的贮存
营养培养基上的蔗糖消耗量与生长在培养基上的细胞数量成比例,因此,它成倍的增长与呈指数增长的细胞数量一致。
22℃下,美国梧桐细胞的蔗糖消耗率为40-50毫克蔗糖每天每克细胞鲜重(图4和表2)。
细胞大约花费10天时间消耗最初添加到营养培养基里的蔗糖,用于传代。
在5℃,每克鲜细胞的蔗糖消耗率要比22℃下低4-5倍(图4),并且需要花费5-6个星期才能将最初添加到营养培养基里的蔗糖消耗完。
测量在光照下培养的拟南芥细胞,获得相似的蔗糖吸收率。
在黑暗下蔗糖吸收率稍高(50-60毫克蔗糖每天每克细胞鲜重,22℃)。
在5℃下,最初添加到营养培养基的蔗糖只需4-5个星期就消耗完。
这表明光合作用对糖供应的贡献近乎补偿了这种细胞株略高的生长率。
在营养培养基里的蔗糖消耗完
图3在22℃和5℃下美国梧桐细胞培养的高氯酸萃取物的质子-退偶的13C-NMR光谱。
细胞在22℃下传代培养5天(a),在5℃下传代培养20天(b)之后收获。
峰值分配如下:
ref,参照(膦酸甲酯)用于定量;glc-6-p,6-磷酸葡萄糖;fru-6-p,6-磷酸果糖;Pi,无机磷酸盐;GPC,甘油磷酸胆碱;UDP-glc,二磷酸尿苷葡萄糖二钠盐。
后,细胞内的糖类也将被消耗,细胞自体吞噬开始[15]。
为此,有必要将传代细胞在5℃下至少培养4-5周。
表1在不同温度下拟南芥和美国梧桐细胞培养的O2-吸收
温度
美国梧桐
拟南芥
+2μmoll-1FCCP
+2μmoll-1FCCP
+light
22℃
350±25
550±50
480±40
780±40
330±30
5℃
72±6
145±12
105±10
200±15
30±3
5℃→22℃
360±30
560±50
470±40
750±70
290±25
在22℃下传代培养5天和在5℃下传代培养20天之后,收获的拟南芥和美国梧桐细胞的O2-吸收在它们各自的培养基里测量,22℃或5℃。
此外,在5℃下培养20天的细胞的O2-吸收在经过10分钟恢复(5℃→22℃)之后,在22℃下测量。
按照在“材料和方法”里指出的方法,除拟南芥细胞在具体指定(+light)的情况下外,O2-吸收率在黑暗条件下测量。
它们以nmolO2消耗min-1g-1细胞鲜重表示。
数值为平均值±SD(n=5)。
FCCP,羰基氰对三氟甲氧基笨腙。
图4温度和磷酸盐对美国梧桐细胞培养的营养培养基里蔗糖减少的影响。
蔗糖减少的时间过程在22℃和℃下美国梧桐细胞培养的缺磷或者不缺磷(Pi)的营养培养基里测量。
细胞最初在提供磷或不含磷的营养培养基里培养5天。
零时刻的细胞浓度(FW)在提供磷的营养培养基里的为20mgml-1培养液,在不含磷的营养培养基里的为3020mgml-1。
按照“材料和方法”里描述的那样量化蔗糖。
数值为平均值±SE(n=3)。
每月的细胞传代培养依然可以看成是一个过度的约束。
因此,这个问题是确定细胞糖类的消耗量是否可能进一步减少,尽管同时保持细胞悬液的生理安全。
由于几乎一半的多糖通过呼吸作用消耗掉而另一半则通过各种不同的代谢途径参与细胞生长[32],因此我们在降低温度之前停止细胞生长。
为此,我们在不含磷的营养培养基上培养细胞。
在5℃下磷饥饿培养基上进行细胞培养和恢复
在22℃下,假如蔗糖定期的添加到营养培养基里,细胞培养有可能在缺磷的营养培养基中存活几个月。
几天后,细胞里的磷、糖酵解过程中磷酸化的中间体和核苷酸的浓度大幅下降[17,32],然而磷脂/半乳糖脂的比值减少了大约70%[33,34]。
在这些培养条件下,美国梧桐和拟南芥细胞将在一个星期内停止生长(图5和附件4)。
然后,这两种细胞从营养培养基里摄取糖类的速率保持不变(图4)。
缺磷营养培养基里的细胞呼吸速率(表3)令人惊奇地只比在标准营养培养基里的低30%(表1)。
此外,剥夺磷和提供磷的细胞的解耦合呼吸速率相
表2在22℃和5℃下美国梧桐细胞培养在提供磷和磷饥饿的营养培养基里的蔗糖-吸收。
提供磷的NM
磷饥饿的NM
温度
22℃
5℃
22℃
5℃
蔗糖吸收(mgd-1g-1))
51±5
9.7±0.9
17±1.5
3.4±0.3
细胞最初在22℃的提供磷或者不含磷的Lamport营养培养基里培养5天。
在第5天,细胞在22℃或者5℃下继续培养,蔗糖-吸收按照“材料和方法”指出的方法测量并以mgd-1g-1细胞鲜重表示。
数值为平均值±SD(n=3)。
似,这表明磷饥饿并不更改线粒体最大的电势活动。
在磷添加到营养培养基后,细胞呼吸作用在数分钟内恢复到正常值,并且细胞的31P-NMR图谱在数小时内显示正常轮廓[17]。
当剥夺磷的细胞的培养温度下降到5℃时,观察到细胞的呼吸作用强度下降5倍(表3),上述提到的提供磷的细胞的情况也一样,并且细胞从营养培养基里吸收蔗糖也相应地减少(见图4的美国梧桐细胞)。
美国梧桐细胞的平均蔗糖吸收率接近3.4mgd-1g-1细胞鲜重(表2)。
这预示,因为它们的培养基最初含有20gl-1的蔗糖,使得在5℃下培养的20g细胞在一公升的不含磷的营养培养基里培养超过10个月,可以保持存活而不需要更新培养基。
图5美国梧桐细胞在不同培养条件下的生长。
美国梧桐细胞悬浮培养的生长在22℃不含磷的营养培养基里测量,随后细胞在5℃下保藏,并在22℃提供磷的营养培养基里恢复生长。
细胞按照“材料和方法”里描述的方法培养。
这些细胞来源于呈指数增长增长并在到达生长稳定期之前在不含磷的营养培养基里多次传代培养的细胞悬液。
在零时刻,细胞以5.0mgml-1浓度培养在22℃不含磷的Lamport营养培养基里。
经过短暂的对数生长期之后,温度设到5℃。
保藏6个月之后的细胞将在标准培养条件下培养和传代(190天)。
这项实验重复5次。
在半对数图中,符号的大小为标准偏差的数量级。
在5℃下培养了6个月细胞的不含磷的培养基,添加磷并将温度恢复到22℃之后,观察到细胞的呼吸作用在数分钟内恢复到标准值(表3)。
这表明,细胞悬液在低温不含磷的营养培养基上保存数月后仍保持生理同源性。
特别地,没有测量到明显的细胞死亡。
因此,图6和附加数据5向我们展示了一个例子,在5℃不含磷的营养培养基上培养了6个月之后,美国梧桐和拟南芥细胞的代谢物情况的恢复。
在0时刻,细胞的可溶性含磷化合物的浓度接近体内31P核磁共振的观测临界点,约为20nmol。
在磷酸盐添加到灌注营养培养基30分钟后,6-磷酸葡萄糖和UDP-葡萄糖的含量恢复到标准值,之后细胞质的磷和NTP的含量也快速的恢复到标准值,液泡的磷在他们恢复的一个小时之后也恢复到标准值。
2个小时后,美国梧桐和拟南芥细胞的体内31P核磁共振数值接近那些标准细胞。
事实上,在5℃磷饥饿培养超过6个月的细胞的代谢物情况恢复的时间过程与Pratt等人[17]在22℃不含磷的营养培养基里培养5天的细胞所观测到的相似。
体内光谱分析也表明,这两种类型细胞的细胞质的PH保持在7.4左右,一旦被明确标识(30分钟)就可通过细胞质的磷的化学位移测量得出。
这表明,细胞质PH的调节是由在低温下培养的磷饥饿细胞维持,正如在22℃情况下一样[32]。
在5℃下磷饥饿培养的细胞的体内13C核磁共振光谱将与相应的提供磷的细胞比较。
同样地,观察一个在几小时内完全恢复的情况:
己糖代谢完,同时氨基酸积累。
最后,在恢复到标准培养条件之后,在低温不含磷的营养培养基里培养的细胞的生长率快速的恢复到标准值。
特别地,没有观察到明显的延迟(图5),并且细胞可以进一步进行正常的传代培养。
这证明,细胞在低温不含磷的培养基上保藏培养不会使细胞生长,并且不需要添加生长抑制剂,也不会导致在生理和新陈代谢上长期存在的变化。
重要的是,体内和体外13C和31P核磁共振分析显示,观察到的在低温缺磷的营养培养基上培养的细胞的新陈代谢的变化,在恢复到标准培养条件之后快速的恢复。
此外,在细胞完全恢复呼吸率和生长率
期内不存在迟滞期表明,在保藏期内细胞种群保持生理同源性。
这个不需要经过数月的传代培养的细胞保藏方案在附件6中描绘成逐步地。
结论
美国梧桐和拟南芥细胞在5℃不含磷的营养培养基里培养数月可以保持细胞系存活。
这是由于在降低温度之前维持10天的磷饥饿的结果抑制细胞的生长和在低温下细胞的新陈代谢活动和呼吸作用大幅下降。
重要的是,没有观测到细胞死亡,并且细胞恢复到正常的生理和生化活动并没有长时间的延迟或者迟滞期。
表3在不同温度下不含磷的营养培养基里培养的拟南芥和美国梧桐细胞的O2-吸收。
温度
美国梧桐
拟南芥
+2μmoll-1FCCP
+2μmoll-1FCCP
22℃
250±25
510±50
320±30
690±60
5℃
59±6
135±12
70±7
190±15
5℃→22℃
370±30
530±50
470±40
720±60
美国梧桐和拟南芥细胞在22℃各自不含磷的营养培养基里最初培养5天以阻止细胞生长。
在第5天,细胞在22℃和5℃相同的营养培养基里继续培养。
经过在22℃下培养5天和在5℃下培养6个月之后,测量缺磷的细胞的O2-吸收。
此外,在5℃下培养6个月的细胞的O2-吸收在经过10分钟恢复(5℃→22℃)之后,在22℃标准的提供磷的培养基里测量。
所有细胞都在黑暗条件下培养。
O2-吸收率按照在“材料和方法”里指出的方法测量,并以nmolO2消耗min-1g-1细胞鲜重表示。
数值为平均值±SD(n=5)。
FCCP,羰基氰对三氟甲氧基笨腙。
图6体内质子-退偶31P-NMR光谱展示保藏超过6个月的美国梧桐细胞的恢复。
细胞在5℃不含磷的营养培养基里保藏超过6个月。
按照“材料和方法”里描述的方法,将这些细胞放在关注系统里进行体内NMR分析。
在零时刻,100μmoll-1的Pi添加到营养培养基里,并将温度设到22℃。
光谱是1500个0.6秒重复(15min)的瞬时时间的积累的结果。
峰值分配如下:
ref,参照(亚甲基二磷酸盐)用于测量化学位移和定量;glc-6-p,6-磷酸葡萄糖;fru-6-p,6-磷酸果糖;cyt-Pi,细胞质的无机磷酸盐;vac-Pi,液泡内的无机磷酸盐;NTP,三磷酸核苷;UDG-glc,二磷酸尿苷葡萄糖二钠盐。
总的来说,这个细胞保藏方案在这里描述成,开启了存储细胞系数月同时保持它们重新开始同源性生长的能力而没有延迟的可能。
这可以容易、常规地进行操作,而不需要特殊的设备、冷冻程序和添加生长抑制剂。
这个只需每6个月更新一下培养基的悬浮培养细胞系的保藏方法,现在在我们实验室是常用的。
材料和方法
植物材料和培养条件
美国梧桐(AcerpseudoplatanusL.)和拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)细胞按照Bligny和leguay[36]描述的那样,各自生长在Lamport[2]和Murashige-Skoog[35]营养培养基。
这两种细胞都在充有二氧化碳的转速为120rpm轨道摇床上培养,存于22℃的细胞培养室或者5℃的冷室。
无论在22℃或者5℃,拟南芥细胞都持续接受光合的光子通量密度(PPFD)为100umolm-2s-1的光照。
营养培养基含有20gl-1的蔗糖作为碳源。
在22℃下,细胞悬液每7天,即在营养培养基里的蔗糖消耗完之前传代培养一次,通过在800ml的烧瓶里添加40ml老细胞培养液和200ml新鲜的营养培养基获得起始细胞浓度约为5-10毫克鲜细胞每毫升悬液的培养液。
在5℃下,在最初添加到培养基里的蔗糖90%被消耗时传代培养一次。
利用核磁共振进行代谢物组学分析
利用高氯酸(PCA)萃取获得的细胞萃取物进行体外核磁共振分析或者利用收获的新鲜细胞进行体内核磁共振分析。
细胞萃取物经过快速过滤10克(湿重)处理的细胞,在0℃下用纯水冲洗获得,并储存于液氮中。
利用研钵和杵将冷冻细胞样本与0.7ml70%(v/v)的PCA在液氮温度下一起研磨成精细的粉末。
冷冻粉末然后在0℃下解冻,所产生的稠密的悬液在0℃相对离心力为15,000g下离心10分钟以去除微粒状杂质。
上清液用2mol/lKHCO3中和PH为5.0使PCA以KCLO4形式沉淀,然后在相对离心力为15,000g下离心5分钟,之后冷冻干燥。
存储于-20℃的冷冻干燥材料用含10%2H2O的2.0ml水溶解以便进一步进行核磁共振校正,水中含有的1μmoll-1的叠氮化纳防止解冻时材料发酵。
体内核磁共振分析在装有一个10mm多核探测器的BrukerAMX400宽孔光谱仪(Bruker仪器,曼哈顿药物杂物有限公司,比尔里卡,马萨诸赛州,美国)上进行。
探测器分别调频到100.6用于13C核磁共振检测和162.0MHz用于31P核磁共振检测。
2H2O的氘共振将用作一个锁定信号。
光谱将在温度为295K时记录下来。
13C核磁
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