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浅论OAS
浅论OAS
【摘要】【目的】探讨寡聚腺苷酸合成酶基因-1(OAS-1)位点rs2660的单核苷酸多态性(SNP)与慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者自发性HBeAg血清转换的关系。
【方法】收集126例慢性HBV感染者(HBeAg阳性组58例,HBeAb阳性组68例)和无HBV感染者(对照组72例)的外周血,进行DNA提取和扩增,再利用竞争分化聚合酶链反应(CD-PCR)进行扩增,并结合酶免疫法显色以检测该SNP的基因型,两组间基因型比例或等位基因频率采用?
字2检验和优势比(OR)计算。
【结果】在HBeAg阳性组SNPrs2660基因型GG+GA比例为%(17/58)、等位基因G频率为%(19/116),而在HBeAb阳性组分别为%(32/68)和%(39/136),对照组分别为%(38/72)和%(44/144);HBeAg阳性组与HBeAb阳性组或对照组之间的差异均存在统计学意义(基因型:
P=和;等位基因:
P=和),而HBeAb阳性组与对照组之间的差异无统计学意义(基因型:
P=;等位基因:
P=)。
【结论】SNPrs2660等位基因G可能有助于慢性HBV感染者发生自发性HBeAg血清转换,其基因型检测对于干扰素治疗慢性HBV感染者可能有一定的疗效预测价值。
【关键词】寡聚腺苷酸合成酶;单核苷酸多态性;乙型肝炎病毒;等位基因;基因型
Abstract:
【Objective】Theaimofthisstudywastoinvestigatetherelationshipbetweenthesinglenucleotidepolymorphism(SNP)rs2660ofoligoadenylatesynthetasegene-1(OAS-1)andspontaneousHBeAgseroconversiononpatientswithchronichepatitisBvirus(HBV)infection.【Methods】Bloodsampleswerecollectedfrom128patientswithchronicHBVinfection(58HBeAgpositive,68HBeAbpositive),and72normalcontrolcaseswithoutHBVinfection.ChromosomalDNAwasextractedandOAS-1genewasamplified.SNPgenotypingwasperformedwiththeenzymeimmunoassay(EIA)afterthecompetitivelydifferentiatedpolymerasechainreaction(CD-PCR).Oddsratioandchi-squaretestwereappliedinstatisticalanalysis.【Results】InHBeAgpositivegroup,frequenciesofgenotypeGGplusGAandalleleGwere%(17/58)and%(19/116)onSNPrs2660,respectively.Theywere%(32/68)and%(39/136)inHBeAbpositivegroup,%(38/72)and%(44/144)innormalcontrolgroup,respectively.DifferencesbetweenHBeAgpositivegroupandHBeAbpositivegroupornormalcontrolgroupwerestatisticallysignificant(genotype:
P= and;allele:
P= and).Buttheyweren?
蒺tbetweenHBeAbpositivegroupandnormalcontrolgroup(genotype:
P=;allele:
P=).【Conclusion】AlleleGonSNPrs2660ofOAS-1genemaybebenefitpatientswithchronicHBVinfectiontoachievespontaneousHBeAgseroconversion.GenotypingonthisSNPmaybepredictingvaluableforinterferontherapyforchronicHBVinfection.
人寡聚腺苷酸合成酶(oligoadenylatesynthetase,OAS)是一类由干扰素(interferon,IFN)诱导产生的酶蛋白,由OAS-1、OAS-2和OAS-3基因编码,具有激活潜在性RNA酶(latentRnase,RNaseL)降解病毒mRNA、抑制病毒蛋白合成和促进病毒感染细胞发生凋亡的作用,在先天性抗病毒免疫中发挥重要的作用[1-2]。
已有研究发现OAS-1基因上存在的多个SNP可能对丙型肝炎、SARS等病毒感染性疾病的转归产生影响[3-4],目前国内外关于OAS-1基因SNP对慢性乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)感染影响的研究甚少,孔晓飞等发现SNPrs2660与HBV自限性感染呈弱相关,具体可能机制未能阐述。
为此,本研究利用先前建立的相对经济和简便的竞争分化聚合酶链反应(competitivelydifferentiatedpolymerasechainreaction,CD-PCR)技术,对OAS-1基因上SNPrs2660进行基因型检测,探讨它与慢性HBV感染者自发性HBeAg血清转换的关系,了解检测该SNP基因型作为HBeAg血清转换预测指标的可能性。
1材料与方法
研究对象
收集2006年5月至2007年5月在我院感染科就诊的慢性HBV感染病例,根据入选前1个月内在本院的乙肝两对半检查结果(AXSYM)分成HBeAg阳性组和HBeAb阳性组,两组间的年龄、性别比例、谷丙转氨酶水平均具有可比性。
入选标准:
年龄8~30周岁,无接受IFN、核苷(酸)类似物等抗HBV药物治疗历史,无明确合并HCV、HDV、HIV感染,HBeAb阳性组者HBVDNA 1×105拷贝/mL(PE5700荧光定量PCR)和血清HBV前C区G1896A变异株阴性(方法参见文献)。
另外收集72名无HBV感染者作为正常对照。
采静脉血5mL肝素抗凝保存于-20℃冰箱待检。
引物探针
OAS-1基因cDNA的参考序列(GenBank,Acce.No.NC_000012),引物和探针用PrimerPremier软件自行设计并由Invitrogen公司合成(表1),用Milli-Q级ddH2O稀释成10nmol/mL。
试剂和设备
DNA提取试剂盒购自美国Omega公司,PCR试剂、T4DNA连接酶、JM109感受态细胞和内切酶NotⅠ、MluⅠ均购自Takara大连公司,质粒载体pCI-neo购自美国Promega公司,DNA凝胶纯化试剂盒购自德国QiaGen公司,辣根过氧化物酶标记的地高辛抗体(anti-DIC)和异硫氰酸荧光素抗体(anti-FIFC)购自瑞士Roche公司。
PCR扩增采用PTC-200热循环仪、DNA测序采用ABI3730XL测序仪,光密度测定采用LabsystemMK3酶标仪。
DNA提取和基础PCR扩增
取抗凝血细胞100μL用ddH2O200μL稀释,用Omega试剂盒进行DNA提取,DNA提取终液为50μL,保存于-20℃备用。
对SNP所在DNA片断进行基础PCR扩增,50μL反应体系组成:
10×PCR缓冲液(100mmol/LTris-HCl,pH,500mmol/LKCl,15mmol/LMgCl2)5μL、mmol/LdNTP液4μL、DNA提取液5μL、ddH2O34μL、引物OAS1-S和OAS1-A各1μL、TaqDNA聚合酶U;反应步骤:
94℃预热5min、94℃变性40s、52℃退火40s、72℃延伸60s、循环数35个、最后延伸5min。
制备CD-PCR阳性对照质粒DNA
随机取一例基因组DNA为模板,上游引物分别为OAS1-GC或OAS1-AC和下游引物OAS1-CLA进行扩增,除引物外50μLPCR反应体系组成和反应条件同基础PCR扩增,扩增产物经NotⅠ、MluⅠ双酶切后进行2%琼脂糖凝胶电泳,用QiaGenDNA纯化试剂盒提取DNA并与质粒载体pCI-neo连接,再用JM109感受态细胞进行转化,挑取克隆菌落在LB培养基增菌,随后提取质粒DNA作为CD-PCR检测两个SNP不同等位基因的阳性对照。
CD-PCR扩增
经优化得到25μL反应体系:
10×PCR缓冲液(100mmol/LTris-HCl,pH,500mmol/LKCl,15mmol/LMgCl2) μL、mmol/LdNTP溶液μL、TaqDNA聚合酶U、基础PCR产物μL、下游公共引物OAS1-1 μL、上游混合引物OAS1-G μL和OAS1-A μL,最后加ddH2O至总反应体积25μL;PCR反应条件:
94℃变性1min、56℃复性2min、72℃延伸2min、共2个循环,然后94℃变性30s、68℃复性30s、72℃延伸40s、最后72℃延伸5min,共20个循环。
酶免疫显色
用1×缓冲液(mol/LNa2CO3和mol/LNaHCO3,体积比为35:
65,5mmol/LEDTA,pH)配制探针液OAS1-P(OD/mL),然后进行包板。
取每个CD-PCR产物各10μL加上下对应两孔,每孔加入50μL变性液室温下变性10min,随后各孔加入50μL中和杂交液,60℃水浴30min后洗涤拍干。
上孔加入辣根过氧化物酶标记的anti-DIC酶标液(1:
1500)50μL以检测等位基因G,下孔加入辣根过氧化物酶标记anti-FITC酶标液(1:
2000)50μL以检测等位基因A,37℃水浴30min后洗涤拍干。
加入含有四甲基联苯胺的底物缓冲液,10min后显色并加入反应终止液,酶标仪进行A值测定(波长450nm),上下两孔A值比(R)≥判为基因型GG,R≤判为基因型AA, R 判为基因型GA。
数据统计
结果采用SPSS软件进行分析,两组间率的比较采用?
字2检验,并计算相应的优势比(oddsratio,OR)和95%置信区间(confidenceinterval,CI);P 认为差异具有统计学意义。
2结果
基础PCR扩增和酶反应显色结果
取基础PCR扩增的DNA液5μL在2%琼脂糖凝胶中进行电泳,结果显示符合目的片段468bp大小(图1A);取各样本CD-PCR产物各10μL加入上下对应两孔,经酶免疫反应酶标仪判读SNP基因型,显色效果如图1B。
CD-PCR产物测序结果
各取2例基因型分别为GG、GA和AA的CD-PCR扩增产物进行测序,测序结果验证了CD-PCR结合酶显色方法对SNP基因型检测的准确性。
CD-PCR基因型检测结果
所用标本的基因型均成功检测(表2),基因型GG和GA比例或等位基因G频率在HBeAg阳性组明显低于HBeAb阳性组或正常对照组,而HBeAb阳性组和正常对照组之间差异无统计学意义,提示等位基因G可能有利于宿主发生自发性HBeAg血清学转换(OR=,P=);同样地,基因型GG和GA可能有利于宿主发生自发性HBeAg血清学转换(OR=,P=)。
3讨论
IFN是机体抵抗病毒感染的先天性免疫中重要的细胞因子,OAS-RNaseL是IFN抗病毒感染的重要途径之一。
SNPrs2660位于OAS-1基因的3′-UTR区,对OAS-1基因转录活性的影响及其机制尚不十分清楚。
He等的研究认为SNPrs2660等位基因G对SARS有保护作用,机制并未阐明;孔晓飞等发现SNPrs2660与HBV自限性感染呈弱相关。
以上资料提示OAS-1基因的SNP对HBV感染的转归可能产生影响,其与HBeAg血清转换的关系也值得深入探讨。
事实上,本研究发现,在年龄小于30岁的HBV感染患者中,SNPrs2660等位基因G以及基因型GG和GA均有利于慢性HBV感染者发生自发性HBeAg血清转换。
本研究的观察对象为小于30岁的HBV感染患者,主要考虑到年龄小的患者在肝炎充分活动前就出现自发性HBeAg血清转换可能更能体现个体遗传素质的优越性,这也可能是本研究观察到OAS-1基因SNPrs2660与自发性HBeAg血清转换较强相关性的原因。
我们先前在OAS-1基因SNPrs10774671上有与此相似的发现,该SNP位于OAS-1外显子E下游,其等位基因决定了mRNA的剪接,当等位基因为G时表达相应产物为p46,而为A时表达产物为p48和/或p52[9-10]。
产物p46具有更高的酶催化活性,从而导致2′-5′OA合成增多[8,10],可能更有效地抑制病毒复制和病毒蛋白的合成。
而SNPrs2660位于rs10774671的下游,虽然本实验并没有对所有样本进行DNA测序验证,但已有一些研究发现这两个SNP存在不平衡连锁关系,这可能是SNPrs2660对HBeAg血清转换产生影响的真正原因。
目前,IFN仍然是抗HBV治疗的重要药物之一,在抗HBV治疗过程中出现HBVDNA载量下降伴随HBeAg血清转换往往是取得良好应答的重要评价指标。
而在本研究的结果提示,不同个体的OAS-1基因SNPrs2660等位基因可能与自发性HBeAg血清转换存在关系,因此该SNP基因型检测可作为自发性HBeAg血清转换或IFN抗HBV治疗疗效的预测指标。
【参考文献】
JustesenJ,HartmannR,KjeldgaardNO.Genestructureandfunctionofthe2′-5′-oligoadenylatesynthetasefamily[J].CelMolLifeSci,2000,57(11):
1593-1612.
Diaz-GuerraM,RivasC,EstebanM.ActivationoftheIFN-inducibleenzymeRNaseLcausesapoptosisofanimalcells[J].Virology,1997,236
(2):
354-363.
KnappS,YeeLJ,FrodshamAJ,etal.Polymorphismsininterferon-inducedgenesandtheoutcomeofhepatitisCvirusinfection:
rolesofMxA,OAS-1andPKR[J].GenesImmun,2003,4(6):
411-419.
HeJ,FengD,deVlasSJ,etal.AssociationofSARSsusceptibilitywithsinglenucleicacidpolymorphismsofOAS1andMxAgenes:
acase-controlstudy[J].BMCInfectDis,2006,6:
106.
孔晓飞,张欣欣,杨之寿,等.2′-5′寡聚腺苷酸合成酶1基因多态性与乙型肝炎病毒易感性和抗病毒疗效的相关性[J].中华肝脏病杂志,2007,15(10):
779-780.
PengXM,ChenXJ,LiJG,etal.NovelassayofcompetitivelydifferentiatedpolymerasechainreactionforscreeningpointmutationofhepatitisBvirus[J].WorldJGastroenterol,2003,9(8):
1743-1746.
黄绍萍,王冯滨.慢性乙型重型肝炎患者C区变异株检测及对预后的影响[J].实用肝脏病杂志,2006,9(6):
328-329.
陈禄彪,彭晓谋,曹红,等.OAS-1基因SNPrs10774671与慢性HBV感染者自发性HBeAg血清转换的关系[J].中华实验和临床病毒学杂志,2009,23
(1):
35-37.
Bonnevie-NielsenV,FieldLL,LuS,etal.Variationinantiviral2′,5′-oligoadenylatesynthetase(2′5′AS)enzymeactivityiscontrolledbyasingle-nucleotidepolymorphismatasplice-acceptorsiteintheOAS1gene[J].AmJHumGenet,2005,76(4):
623-633.
FieldLL,Bonnevie-NielsenV,PociotF,etal.OAS1splicesitepolymorphismcontrollingantiviralenzymeactivityinfluencessusceptibilitytotype1diabetes[J].Diabetes,2005,54(5):
1588-1591.
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