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生物论文氨基葡萄糖盐酸盐对糖尿病小鼠血糖的影响
正文
氨基葡萄糖盐酸盐对糖尿病小鼠血糖的影响
摘要:
目的探究氨基葡萄糖盐酸盐对四氧嘧啶所致糖尿病小鼠血糖的影响。
方法用盐酸水解柠檬酸废渣制取氨基葡萄糖盐酸盐,以50mg/kg,100mg/kg、200mg/kg浓度的氨基葡萄糖盐酸盐灌胃糖尿病小鼠,连续2周,取血清,测定空腹血糖(BG)、总胆固醇(TC)、胰脏和肝脏组织丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性。
结果
(1)与对照组相比,模型组各项生理指标存在显著差异(P<0.05);
(2)低、中剂量组的BG浓度、TC含量、胰脏和肝脏SOD水平、胰脏MDA含量与模型组差异显著(P<0.05),与对照组相比无明显差异(P>0.05),低、中剂量组可显著降低糖尿病小鼠BG浓度和TC含量,提高其胰脏和肝脏SOD水平,降低MDA含量,高剂量组无明显效果;(3)中剂量组肝脏MDA与模型组相比差异显著(P<0.05),与对照组相比无明显差异,中剂量的GAH可明显降低糖尿病小鼠肝脏MDA含量;结论较低浓度(50-100mg/kg)的氨基葡萄糖盐酸盐能有效降低糖尿病小鼠血糖浓度和血清TC,同时能有效提高肝脏和胰脏组织抗氧化能力。
关键词:
氨基葡萄糖盐酸盐糖尿病血糖
theinfluenceofGlucosaminehydrochloridetodiabeticmiceonthebloodglucose
Abstract:
ObjectiveToexploretheeffectofglucosaminehydrochlorideonalloxaninduceddiabeticmice.MethodsGlucosaminehydrochloridewaspreparatedbyusinghydrochloricacidhydrolysisofwastecitricacid,with50mg/kg,100mg/kg,200mg/kgconcentrationsofglucosaminehydrochlorideintragastricadministrationofdiabeticmicefor2weeks,thebloodwascollectedtotestfastingbloodglucose(BG),totalcholesterol(TC),pancreasandlivertissueweretakentotestmalondialdehyde(MDA)content,superoxidedismutase(SOD)activity.Result
(1)Comparedwiththecontrolgroup,themodelgroupofphysiologicalindexesweresignificantdifference(P<0.05);
(2)Comparedwithmodlegroup,thereweresignificantdifferenceatBGconcentration,TCcontent,MDAandSODlevelsofpancreasandliverinlow,middledosegroup(P<0.05),andnosignificantdifferencecomparedwiththecontrolgroup,BGconcentrationandTCcontentoflowandmiddledosegroupweresignificantlyreducedindiabeticmice,SODlevelswereimprovedthepancreasandliver,thecontentofMDAwasdecreased,highdosegroupshowednoobviouseffect;(3)Comparedwiththemodelgroup,liverMDAofmiddledosehadsignificantdifference(P<0.05)andnosignificantdifferencecomparedwiththecontrolgroup(P>0.05),thecontentofMDAoflivercouldbereducedbythemiddledosesofGAHindiabeticmice;ConclusionthebloodglucoseconcentrationandTCcontentcanbereducedeffectivelybythelowconcentrationofglucosaminehydrochloride,theantioxidantabilityofliverandpancreastissuecanalsobeimprovedeffectively.
Keywords:
glucosaminehydrochlorideglucosediabetes
引言
糖尿病是严重威胁人类健康的第三大疾病,目前对糖尿病的治疗还没有特别有效的手段。
药物虽然能较好地控制血糖,但长期服用多会产生不同程度的毒副作用。
长期的高血糖不仅仅是糖尿病患者的一种表现,也是损害胰岛素分泌和引起胰岛素抵抗的致病因素。
同时,长期的高血糖状态会加剧脂质及蛋白质糖化和氧化过程,而脂质过氧化物也能加剧糖化产物与蛋白质的交联反应。
因此,降低糖尿病患者的血糖水平和增强抗氧化能力,是防治糖尿病及其并发症的重要机制(严奉伟等2006)。
文献报道,D-氨基葡萄糖盐酸盐(D-GlucosamineHydrochloride,简称GAH)对人体具有重要的生理功能它参与肝脏解毒,发挥抗炎护肝作用;刺激婴儿肠道中双歧杆菌增长,对治疗风湿性关节炎病和肠胃溃疡疾病有良好的疗效,可抑制癌细胞的生长,是合成抗生素和抗癌药物的主要原料,并且GAH具有很强的抗氧化能力,能够清除体内自由基(张兰杰等2007;韩宝芹.刘成圣.王绪敏等2004)。
它还可以应用于食品,化妆品和饲料添加剂中,用途广泛,因此该产品已收到世界各国医药,工业界和研究人员的高度重视(陈忻等2000)。
本试验用自制的GAH探讨它对于糖尿病小鼠血糖的影响,为进一步开发利用GAH提供理论依据,对于糖尿病的防治具有重要的现实意义。
1材料与仪器
1.1材料
氨基葡萄糖盐酸盐(河西学院农业与生物技术学院解剖生理实验室提供)
1.2动物
昆明种小鼠(体重20~28g,兰大医学部实验动物中心提供,动物合格证号:
甘医动字14—006)
1.3试剂
四氧嘧啶;邻甲苯胺试剂;葡萄糖标准液;正丁醇;胆固醇;邻苯二甲醛;硫代巴比妥酸;氮蓝四唑(NBT);甲硫氨酸(Met);浓硫酸;冰醋酸。
1.4仪器
DKB--501数显超级恒温水浴锅(江苏金坛荣华仪器制造厂制);RE--52AAA旋转蒸发器(温州奥利生物医学仪器场制造);AL204电子天平;722型可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司制造)。
2实验方法
2.1糖尿病小鼠模型的建立
取正常小白鼠(20-26g)40只,连续两天腹腔注射四氧嘧啶,第一天80mg/kg,第二天120mg/kg,3d后尾静脉采血,测定糖尿病小鼠的空腹血糖浓度,若空腹血糖浓度>12.0mmol/L说明建模成功(刘智华.李青旺等2007;杨润军.李青旺等2006;严奉伟.严赞开等2006)
2.2实验动物的分组与处理
选取糖尿病模型小鼠32只,随机分为4组,每组8只,分别为糖尿病模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,其中低、中、高剂量组分别以50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg的GAH进行灌胃。
另取正常小鼠8只作为对照组,将糖尿病模型组和对照组在同样条件下以生理盐水灌胃,每日1次,饲养期间自由饮水和进食,连续两周。
末次灌胃前12h禁食,灌胃2h后摘除眼球采血,离心分离血清,并取其胰脏和肝脏,4℃冰箱冷藏。
3生化指标测定
3.1血糖浓度的测定
采用邻甲苯胺法进行测定(谭斯艺1992)。
3.1.1标准曲线的制作
配置葡萄糖标准溶液(5.0mg/mL),临用前稀释成1.0mg/mL;取6支试管,分别加入葡萄糖稀释液0.00mL、0.02mL、0.04mL、0.06mL、0.08mL、0.10mL,然后向以上试管中对应加入蒸馏水0.10mL、0.08mL、0.06mL、0.04mL、0.02mL、0.00mL,最后向6支试管中均加入邻甲苯胺试剂5.0mL。
加毕,温和混匀,于沸水浴中煮沸4min取下,冷却,放置30min,用1cm比色杯,试剂空白为参比,测定630nm处的吸光值,绘制标准曲线如下所示:
标准曲线方程:
y=16.221x-0.0405(
=0.9992)
葡萄糖标准曲线
standardcurveofglucose
3.1.2样品血糖浓度的测定
另取试管若干,编号后,按下表加入试剂,取0.02mL血清,加入0.08mL生理盐水稀释,加毕混合均匀后,于沸水浴中煮沸4min取下,放置30min,用1cm比色皿,以试剂空白为参比,测定波长630nm处吸光度值,根据标准曲线方程求样品血糖含量。
血糖浓度(mmol/L)=(16.221A-0.0405)×稀释倍数
3.2血清总胆固醇含量TC的测定
采用邻苯二甲醛法进行测定(阎永昌1999).
3.2.1标准曲线的制作
配置标准胆固醇贮存液(1mg/mL),临用前稀释成0.1mg/mL,取9支试管编号后,依次加入标准胆固醇0.00mL、0.05mL、0.10mL、0.15mL、0.20mL、0.25mL、0.30mL、0.35mL、0.40mL,然后分别加入冰醋酸补至0.40mL,向所有试管中加入邻苯二甲醛0.20mL,混合酸4.00mL,加毕混合均匀后,20—37℃下静置10分钟,用1cm比色皿,以试剂空白为参比,测定波长550nm处光度值,并绘制标准曲线。
标准曲线方程y=0.0017A+0.0123(
=0.9992)
总胆固醇标准曲线
standardcurveofTotalcholesterol
3.2.2血清总胆固醇(TC)的测定
另取试管若干,编号后,按下表加入试剂,与标准曲线同时做比色测定:
管号
稀释血清样品(mL)
冰醋酸(mL)
邻苯二甲醛试剂(mL)
混合酸(mL)
样品
0.40
0.00
0.20
4.00
测量前取0.1mL血清,加入冰醋酸稀释至4.00mL。
测量时取0.4mL稀释血清,加毕混合均匀后,20—37℃下静置10分钟,用1cm比色皿,以试剂空白为参比,测定波长550nm处光度值,并根据标准曲线计算。
总胆固醇浓度(mg/dL)=(0.0017A+0.0123)×稀释倍数
3.3胰脏、肝脏丙二醛(MDA)水平的测定
采用硫代巴比妥酸法进行测定(齐奋菊1999)。
取离心后的组织匀浆1mL,加20%的三氯乙酸(TCA)1mL,在3000r/min下离心10min,取其上清液1mL于10mL离心管,加0.67%硫代巴比妥酸(TBA)1mL,另取一管加入25mmol/L的四乙氧基丙烷1mL作为对照,混匀后在100℃水中煮60min,快速冷却后,加正丁醇与吡啶混合液(15:
1)4mL,振荡混匀,以正丁醇与吡啶混合液调零,在532nm处测定吸光度。
组织MDA含量(nmol/mL)=
×5×5
3.4胰脏、肝脏超氧化物歧化酶(SOD)的测定
采用氮蓝四唑(NBT)法进行测定(蒋传葵1979).
称取0.2g冷冻的肝脏组织(0.1g肾脏组织),加冷的磷酸缓冲液4mL(肾脏组织加2mL)在冷的研钵上研磨后于4℃3000r/min离心10min,取上清液,试管编号后,按下表加入试剂:
试剂(mL)
暗对照管
光对照管
测试管
PBS(pH8.0)
3.5
3.5
3.5
EDTA—Na2(100µmol/L)
0.5
0.5
0.5
Met(130mmol/L)
0.5
0.5
0.5
NBT(750µmol/L)
0.5
0.5
0.5
核黄素(20µmol/L)
0.5
0.5
0.5
组织液
—
—
0.1
蒸馏水
0.5
0.5
0.4
测试管加毕混匀后,在4000lx下光照处理20min,在波长为560nm处读出吸光度值;暗对照管为调零试剂管,需在无光条件下反应5min;光对照管加毕混匀后,经光处理5min后,读出560nm处吸光度值。
加入核黄素时,需在无光照条件下进行。
SOD活性(U/mL)=
:
光照管分光度值V:
样液总体积(mL)W:
样重(g)
:
样品管分光度值
4结果与分析
4.1氨基葡萄糖盐酸盐对小白鼠血糖浓度的影响
图1GAH对小白鼠血糖浓度的影响
Fig.1EffectofGAHonserumglucoseconcentrationindiabeticmice(x±s)
注:
*表示与模型组比较有显著差异(P<0.05);#表示与空白组比较有显著差异(P<0.05)。
由图1可知,模型组与空白对照组比较差异显著(P<0.05),而且血糖浓度≥12mmol/L表明建模成功;低、中剂量组与空白组比较差异不显著(P>0.05),与模型组比较差异显著(P<0.05);高剂量组和模型组比较不存在显著差异(P>0.05),与对照组比较存在显著差异(P<0.05),说明中、低剂量的GAH对糖尿病小鼠具有明显的降血糖作用,而高剂量的GAH无明显降血糖作用。
4.2氨基葡萄糖盐酸盐对小白鼠血清胆固醇含量的影响
由图2可知,模型组与空白组比较差异显著(P<0.05),说明四氧嘧啶引起血糖升高的同时也引起胆固醇含量的升高;低、中剂量组与空白组比较不存在显著差异(P>0.05),与模型组比较存在显著差异(P<0.05),高剂量组与空白组和模型组比较不存在显著差异(P>0.05),说明低、中剂量组的GAH对降低高血糖小鼠血清总胆固醇的作用明显。
图2GAH对小白鼠血清胆固醇含量的影响
Fig.2EffectofGAHFontotalcholesterolcontentsofdiabeticmice(x±s)
注:
*表示与模型组比较有显著差异(P<0.05);#表示与空白组比较有显著差异(P<0.05)。
4.3氨基葡萄糖盐酸盐对小白鼠胰脏丙二醛含量的影响
图3GAH对小白鼠胰脏丙二醛含量的影响
Fig.3EffectofGAHonmalonaldehyde(MDA)contentsinpancreasofdiabeticmice(x±s)
注:
*表示与模型组比较有显著差异(P<0.05);#表示与空白组比较有显著差异(P<0.05)
由图4可知,模型组与空白组存在显著差异(P<0.05),说明四氧嘧啶造成胰脏组织受损;低、中剂量组与空白组比较存在不显著差异(P>0.05),与模型组比较存在显著差异(P<0.05),高剂量组与空白组差异显著(P<0.05),而与模型组差异不显著(P>0.05),表明低、中剂量的GAH可能具有修复受损胰脏的作用。
4.4氨基葡萄糖盐酸盐对小白鼠胰脏SOD活性的影响
图4GAH对小白鼠胰脏SOD活性的影响
Fig.4EffectofGAHonheyocuprein(SOD)activityinpancreasofdiabeticmice(x±s)
注:
*表示与模型组比较有显著差异(P<0.05);#表示与空白组比较有显著差异(P<0.05)
由图5可知,模型组与空白组比较存在显著差异(P<0.05),说明四氧嘧啶造成小鼠胰脏细胞抗氧化能力明显下降;高剂量组与空白组比较差异显著(P<0.05),而与模型组比较差异不显著(P>0.05),中剂量组与空白组比较差异不显著(P>0.05),而与模型组存在显著差异(P<0.05),低剂量组与模型组和对照组均差异显著(P<0.05)表明中剂量的GAH对提高小鼠胰脏组织中SOD活性具有明显的作用。
4.5氨基葡萄糖盐酸盐对小白鼠肝脏丙二醛含量的影响
图5GAH对小白鼠肝脏丙二醛含量的影响
Fig.5EffectofGAHonheyocuprein(MDA)activityinliversofdiabeticmice(x±s)
注:
*表示与模型组比较有显著差异(P<0.05);#表示与空白组比较有显著差异(P<0.05)
由图5可知,模型组与对照组比较存在显著差异(P<0.05),模型组肝脏MDA含量明显高于对照组,说明对小鼠腹腔注射四氧嘧啶,会使小鼠的肝脏造成损伤,低剂量组与对照组比较差异显著(P<0.05),与模型组比较差异不显著(P>0.05),中剂量组与对照组比较差不异显著(P>0.05),与模型组存在显著差异(P<0.05),说明中剂量的GAH对提高小鼠肝脏组织中MDA活性具有影响的作用。
4.6氨基葡萄糖盐酸盐对小白鼠肝脏SOD活性的影响
图6GAH对小白鼠肝脏SOD活性的影响
Fig.6EffectofGAHonheyocuprein(SOD)activityinliversofdiabeticmice(x±s)
注:
*表示与模型组比较有显著差异(P<0.05);#表示与空白组比较有显著差异(P<0.05)
图6显示,模型组与对照组相比差异显著(P<0.05),模型组胰脏SOD活性明显低于对照组,说明对小鼠腹腔注射四氧嘧啶,会使小鼠胰脏的抗氧化能力下降。
各试验组与模型组相比差异显著(P<0.05),SOD活性呈上升趋势,说明GAH能够使超氧化物歧化酶活性上升。
与对照组相比,各试验组差异不显著(P>0.05),说明GAH能促进肝脏SOD活性提高。
5讨论
四氧嘧啶(ALX)是自由基激活剂,可选择性使胰岛组织中过氧化氢及超氧阴离子等自由基浓度增高,从而对胰岛B细胞产生毒性损害作用,导致大量胰岛B细胞的损伤及死亡,胰岛素原合成出现障碍,引起胰岛素分泌不足,从而导致糖尿病(左绍远等2001;刘彤云等2004;郑家铿等2001)。
大量资料显示,高血糖常常伴随高血脂,四氧嘧啶腹腔注射成功诱导小鼠血糖含量升高,同时伴随血脂中总胆固醇含量升高的并发症,引起小鼠实验性四氧嘧啶糖尿病。
结果表明其模型组BG浓度和TC含量与对照组相比存在显著差异(P<0.05),且血糖浓度>12.0mmol/L,表明建模成功。
在本试验中,低剂量和中剂量组其BG浓度和TC含量则明显低于模型组,与对照组无明显差异(P>0.05),高剂量组无明显效果。
由此可知而GAH能降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的血糖浓度,并且同样能降低其总胆固醇含量,证实GAH具有降血糖、降血脂作用。
SOD和MDA是细胞内的抗氧化酶,SOD能清除超氧阴离子自由基,检测其水平可反映清除自由基的程度;MDA是脂质过氧化作用的终产物,其含量可反映脂质过氧化水平,同时间接反映自由基损伤程度,是衡量细胞损伤的重要指标。
正常情况下,酶和自由基保持在一个稳定的状况,但当细胞受损时,SOD水平会降低,MDA含量会升高。
由于四氧嘧啶产生的大量自由基进入体内,会刺激肝脏和胰脏的酶活力升高,以清除体内过量的自由基,自由基越多,其升高越明显。
在本试验中模型组胰脏和肝脏组织SOD活性低于对照组,MDA含量显著高于对照组,说明四氧嘧啶对胰脏和肝脏组织有损伤,从而使细胞自身的抗氧化能力升高。
中剂量组胰脏和肝脏SOD活性显著高于模型组,MDA含量低于模型组,与对照组相比无明显差异(P<0.05),而高剂量组胰脏SOD活性和MDA含量与模型组相比无显著差异(P>0.05);证明低剂量的GAH能修复受损的胰脏和肝脏,使其恢复生理机能。
由此推测,GAH有增强胰脏、肝脏抗氧化能力的作用,其通过增强胰脏、肝脏的抗氧化能力而使一些受损伤的胰岛B细胞得到修复,从而产生胰岛素,在糖尿病小鼠体内起到降低血糖并阻止糖尿病并发症发展的作用。
在本实验中中浓度的GAH效果较佳,而高浓度反倒无明显效果,其原因还有待研究。
6结论
本试验结果表明,较低浓度(50-100mg/kg)的氨基葡萄糖盐酸盐能有效降低糖尿病小鼠血糖浓度和血清总胆固醇含量,同时能有效提高肝脏和胰脏组织抗氧化能力。
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