植物乳酸杆菌对绵羊瘤胃上皮细胞SBD1表达的影响.docx
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植物乳酸杆菌对绵羊瘤胃上皮细胞SBD1表达的影响
乳酸杆菌诱导绵羊瘤胃上皮细胞内SBD-1表达的研究
范燕茹1,2,王佩1,2,金鑫1,2,杨银凤1,2*
(1.内蒙古农业大学兽医学院,呼和浩特市010018;2.农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室,呼和浩特市010018)
摘要:
为了解不同乳酸杆菌的刺激对绵羊瘤胃上皮细胞中绵羊β-防御素-1(SheepBeta-Defensin-1,SBD-1)的可能调节作用,本研究选用了两株具有益生作用的乳酸杆菌,即干酪乳杆菌Zhang(L.caseiZhang)和植物乳杆菌P-8(L.plantarumP-8),首先,运用实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)检测与乳酸杆菌共培养后的绵羊瘤胃上皮细胞细胞中SBD-1mRNA的相对表达量;其次,探讨了两株乳酸杆菌诱导SBD-1mRNA表达的差异性,选取优势菌株;最后,运用RT-qPCR技术和酶联免疫吸附测定(ELISA)的方法,检测优势菌株活菌、灭活菌及其培养上清液对SBD-1基因及蛋白水平表达的影响。
结果表明:
两株乳酸杆菌均能促进SBD-1mRNA的相对表达量,乳酸杆菌的浓度为107cfu·mL-1、刺激细胞8h时能极显著促进SBD-1mRNA的相对表达量(P<0.01),而L.plantarumP-8强于L.caseiZhang;进一步的研究表明L.plantarumP-8的灭活菌亦可显著诱导SBD-1的基因及蛋白表达(P<0.05),但弱于活菌。
本研究结果表明L.plantarumP-8和L.caseiZhang均可诱导绵羊瘤胃上皮细胞内SBD-1的差异性表达。
关键词:
β-防御素-1;瘤胃上皮细胞;乳酸杆菌;实时荧光定量PCR;酶联免疫吸附测定
中图分类号:
ResearchofLactobacillusInducetheExpressionofSBD-1intheRumenEpitheliumCellsofSheep
FANYan-ru1.2,WANGPei1.2,JINXin1.2,YANGYin-feng1.2*
(1.Collegeofveterinary,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot,010018;2.KeyLaboratoryofClinicalDiagnosisandTreatmentTechnologyinAnimalDisease,MinistryofAgriculture,Hohhot,010018)
Abstract:
Inordertoexplorethepossibleeffectofdifferentlactobacilliontheβ-defensin-1(SheepBeta-Defensin-1,SBD-1)expressioninculturedruminalepithelialcellsofsheep.Firstly,twostrainsofprobioticlactobacillithatL.caseiZhangandL.plantarumP-8werechosentoco-culturewithruminalepithelialcellsofsheep,thentherelativeexpressionofSBD-1mRNAwasdeterminedbyRT-qPCRexperiments.Secondly,thedominantstrainwasselectedbysignificanceanalysistotheeffectoftwolactobacilliontheSBD-1expression.Finally,epithelialcellswerestimulatedwithactive,inactiveandculturesupernatantoftheselectedlactobacillus,theexpressionofSBD-1mRNAandproteinweredeterminedbyRT-qPCRandELISArespectively.TheresultsshowedthattherelativeexpressionofSBD-1mRNAwasinducedbytwostrainsoflactobacilliandhadaverysignificantdifferencewhentheconcentrationofthelactobacilliwas107cfu·mL-1andcellsstimulated8h(P<0.01),butL.plantarumP-8wasstrongerthanL.caseiZhang.FurtherstudiesshowedthatinactivedL.plantarumP-8canalsosignificantlyinducedSBD-1geneandproteinexpression(P<0.05),butweakerthanlive.TheresultsofthisstudyindicatedthatL.plantarumP-8andL.caseiZhangcaninducedifferentiallyexpressionofSBD-1inruminalepithelialcellsofsheep.
Keywords:
β-defensin-1;ruminalepithelialcells;lactobacillus;real-timefluorescencequantitativePCR;enzyme-linkedimmunesorbentassay
抗菌肽(antimicrobialpeptides,AMPs)是一种小分子多肽,是参与宿主机体抵御病原的第一道防线。
防御素(defensins)是抗菌肽中的一个大家族,广泛存在于昆虫、植物和动物体内,具有广谱的抗微生物活性,直接对细菌、病毒、真菌等微生物感染产生免疫应答反应,属于生物体天然免疫系统。
成熟的防御素是一类富含精氨酸和半胱氨酸残基的内源性阳离子多肽,哺乳动物防御素分为三类:
α-防御素、β-防御素和θ-防御素[]。
其中β-防御素广泛分布于人、鼠、牛、羊、猪等的多种器官上皮细胞内[]。
目前,从绵羊体内鉴别出两种β-防御素,即绵羊β-防御素-1(sheepbetadefensin-1,SBD-1)和SBD-2[],研究表明SBD-1在绵羊的呼吸道和整个消化道内有广泛的表达,而SBD-2只表达于舌和远端回肠[],因此SBD-1是绵羊胃肠道中先天免疫应答的重要组成部分。
益生菌是对健康有益的微生物有机体[],大部分益生菌属于乳杆菌属,其种类多,分布广。
就哺乳动物而言,乳杆菌与全身各部分黏膜共生,其中在口腔和消化道定植的乳酸杆菌可抵御其他病原菌的侵害[]。
近几年,关于益生菌和上皮细胞之间的相互作用已经进行了大量的研究[]。
研究表明,乳酸杆菌对上皮细胞的刺激应答是多方面的,包括上皮屏障损伤的修复、抗菌物质的产生以及对能诱导上皮细胞凋亡因子的阻断[],所以说乳酸杆菌对提高上皮细胞的屏障功能及其免疫调节具有一定的作用[]。
同时又有大量研究表明乳酸杆菌能诱导抗炎因子和抗菌肽的产生[-][][]。
但是,现有的研究中多局限于乳酸杆菌对人的防御素表达的影响;近年来,人们也逐渐开始研究乳酸杆菌对断奶仔猪和鸡体内防御素水平的影响[-][][],然而关于乳酸杆菌与绵羊体内防御素表达的关系报道很少,因此,本试验进行了乳酸杆菌诱导绵羊瘤胃上皮细胞中SBD-1表达的研究。
本研究选用了两株具有益生作用的乳杆菌,即植物乳杆菌和干酪乳杆菌,旨在通过分别与体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞共培养,采用分子生物学的研究方法检测细胞中SBD-1的表达水平,从而验证不同乳酸杆菌的添加是否对绵羊瘤胃上皮细胞中SBD-1的表达具有促进作用,由此为乳酸杆菌诱导防御素的表达提供一个新的研究方向,同时为绵羊疾病预防提供一个新的途径。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验动物
自呼和浩特市北亚清真屠宰场挑选健康状况良好的绵羊,屠宰后立即剪取瘤胃内面乳头密集处组织一块,用生理盐水冲洗干净后放入磷酸盐缓冲液(PBS)中,低温保存备用。
1.1.2供试菌株
干酪乳杆菌Zhang(LactobacilluscaseiZhang,L.caseiZhang),植物乳杆菌P-8(LactobacillusplantarumP-8,L.plantarumP-8)均由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室分离保存。
1.1.3主要试剂及仪器设备
主要试剂:
DMEM/F12培养基(Hyclone)、MRS肉汤培养基(广东环凯)、RNAfast200总RNA极速抽提试剂盒(上海飞捷)、PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser(DRR047A)(TaKaRa)、SYBR
PremixExTaq™Ⅱ(DRR820A)(TAKARA)、绵羊防御素β1(DEFβ1)ELISA试剂盒(武汉新启迪)等。
仪器设备:
-80℃冰箱、二氧化碳培养箱(Thermo,美国)、移液器、核酸测定仪、冷冻离心机(Eppendorf,德国)、倒置相差显微镜(Olympus,日本)、电子天平(Sartorius,德国)、立式自动高压灭菌锅(TOMY,日本)、实时荧光定量PCR仪(VⅱA7,ABI,美国)、普通电冰箱(海尔,青岛)、水平离心机(北京医疗器械厂)、超净工作台(苏净,苏州)、数显鼓风干燥箱(上海博讯)。
1.2方法
1.2.1绵羊瘤胃上皮细胞的培养
将取来的新鲜瘤胃组织用4℃灭菌生理盐水(含100U·mL-1青霉素+0.05mg·mL-1链霉素,0.1µg·mL-1两性霉素B,20µg·mL-1庆大霉素)冲洗去除食糜及污染物后,浸入至4℃灭菌无Ca2+、Mg2+的PBS溶液(含500U·mL-1青霉素,250mg·mL-1链霉素,0.5µg·mL-1两性霉素B,100µg·mL-1庆大霉素)中,带进细胞培养室。
钝性分离瘤胃组织的黏膜上皮层和固有层,并取一块上皮层在上述PBS溶液中反复涮洗3次,再以不含抗生素的灭菌PBS溶液浸泡10min。
将清洗好的组织块置入消化液(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)中,37℃连续振荡消化。
待消化完成后在消化液中加入含10%FBS的培养液终止消化。
反复吹吸混匀,离心收集细胞。
加入绵羊瘤胃上皮细胞培养液(DMEM/F12+15%FBS+0.1mmol·L-1β-巯基乙醇+2μg·mL-1ITS+0.5µg·mL-1两性霉素B,100µg·mL-1庆大霉素+100IU·mL-1青霉素+0.05mg·mL-1链霉素)制成单细胞悬液放入细胞培养瓶中,于培养箱(37℃、5%CO2饱和湿度)中培养。
24h后观察有无染菌。
显微镜下观察其生长状况。
1.2.2乳酸杆菌的培养
两株益生菌菌株于灭菌脱脂乳中–80℃保存,使用前分别接种于MRS肉汤培养基,37℃无氧条件下培养24h,活化两代。
在MRS琼脂培养基上连续倍比稀释,菌落计数,以确定菌液浓度,用于后续试验。
使用前用基础培养基洗两次,调整制成合适浓度的菌液。
1.2.3灭活乳酸杆菌及培养上清液的制备
将培养好的乳酸杆菌以4000r·min-1离心10min,取上清液以0.22μm微孔滤膜过滤器滤过残留菌体,冻干保存。
菌体沉淀以无菌PBS重悬,离心,重复三次。
所得菌体沉淀以无菌PBS重悬至适宜浓度,置于80℃水浴中,连续震荡30min,灭活。
1.2.4乳酸杆菌与体外绵羊瘤胃上皮细胞的共培养
将绵羊瘤胃上皮细胞以1×106个/mL接种于细胞六孔培养板,培养三天,细胞汇合度达80%后,用基础培养基对细胞做饥饿处理12h。
之后将乳酸杆菌菌液以指定浓度(105、106、107、108、109cfu·mL-1)添加,同时设置空白对照,在37℃、5%CO2饱和湿度的环境中作用2h,后以灭菌无Ca2+、Mg2+的PBS溶液(含100U·mL-1青霉素,0.05mg·mL-1链霉素)洗三次,洗去细胞表面的乳酸杆菌,再换以新鲜的基础培养基(含100U·mL-1青霉素,0.05mg·mL-1链霉素),再在培养箱(37℃、5%CO2饱和湿度)中继续分别培养8h。
收集细胞培养上清液于–80℃保存,备用。
将细胞用消化液消化下来,离心收集沉淀于–80℃保存,备用。
1.2.5绵羊瘤胃上皮细胞中SBD-1mRNA表达的检测
将–80℃保存备用的细胞沉淀取出,4℃溶化后,根据RNAFast200说明书提取绵羊瘤胃上皮细胞总RNA,提取的RNA用核酸测定仪检测吸光度A260和A280,测定RNA浓度和纯度,同时用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定所提取的RNA的质量。
所提取的总RNA按PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser(TaKaRa)说明书进行反转录,反转录所得cDNA用于实时荧光定量PCR检测。
Step1,去除基因组DNA(总体系10μL):
5×gDNAEraserBuffer2.0μL,gDNAEraser1.0μL,totalRNA7.0μL。
反应条件:
42℃2min。
Step2,进行反转录(总体系20μL),Step1反应液10.0μL,5×PrimeScriptBuffer(forreal-timePCR)4.0μL,PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ、RTPrimerMix各1.0μL,RNaseFreedH2O4.0μL。
反应条件:
37℃15min,85℃5s。
所得cDNA按照SYBR
PremixExTaq™Ⅱ(DRR820A)(TAKARA)说明书,进行RT-qPCR反应,总体系为20μL:
SYBRPremixExTaqⅡ(2×)(TliRNaseHPlus)10μL,上、下游引物(100mmol·L-1)各0.4μL,cDNA2μL,RNaseFreedH2O7.2μL。
引物由上海生工公司合成(表1)。
RT-qPCR反应条件:
95℃预变性30s;95℃变性5s、63℃退火34s,同时采集荧光信号,40循环;之后,65~95℃测定溶解曲线,采集荧光信号。
PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳。
表1SBD-1和β-actin基因的引物序列
Table1PrimerssequencesofSBD-1andβ-actingenes
基因
引物
PCR产物大小
Genes
Primers(5’-3’)
Lengthofamplifiedfragments(bp)
SBD-1
F:
GGCTCCATCACCTGCTCCTC
206
R:
CGTCTTCGCCTTCTGTTACTTCTT
β-actin
F:
GTCACCAACTGGGACGACA
208
R:
AGGCGTACAGGGACAGCA
1.2.6绵羊瘤胃上皮细胞共培养上清液中SBD-1蛋白表达的检测
将–80℃保存备用的细胞培养上清液取出,4℃溶化后,根据绵羊防御素β1(DEFβ1)ELISA试剂盒的说明书,采用双抗体夹心法,与标准品比对,对上清液中SBD-1的蛋白含量进行检测。
将样品和生物素标记抗体先后加入至预先包被了抗绵羊DEFβ1单克隆抗体的酶标板孔反应后,TBS洗涤,随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应,经过TBS的彻底清洗后用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色,颜色的深浅与样品中的SBD-1呈正相关,之后用多功能酶标仪测定各样品OD值(450nm),并用Curveexpert1.4软件进行标准曲线绘制,计算结果。
1.2.7数据分析
各试验数据经计算整理后,采用GraphPadPrism5.0统计软件进行方差分析。
2结果与分析
2.1绵羊瘤胃上皮细胞培养结果
自绵羊瘤胃上皮组织上消化下来的细胞经37℃、5%CO2培养72h后,大部分细胞已经贴壁,有的单个存在,有的呈岛屿状生长(如图1A);96h后细胞生长迅速,增殖明显,小岛屿状的细胞团生长成大片细胞,进入对数生长期(如图1B)。
随后的7~8d,细胞生长融合成片,呈典型的铺路石状(如图1C),此时细胞汇合度基本达80%,可进行传代。
传代后细胞生长迅速,呈单层状生长,4d后细胞汇合度即达到80%以上(如图1D),可进行后续试验。
A.培养72h后的绵羊瘤胃上皮细胞(100×);
A.Theruminalepithelialcellsinsheepafter72hprimaryculture(100×);
B.培养96h后的绵羊瘤胃上皮细胞(100×);
B.Theruminalepithelialcellsinsheepafter96hprimaryculture(100×);
C.培养7d后的绵羊瘤胃上皮细胞(100×);
C.Theruminalepithelialcellsinsheepafter7dprimaryculture(100×);
D.传代培养4d后的绵羊瘤胃上皮细胞(100×)。
D.Theruminalepithelialcellsinsheepafter4dayssubculture(100×).
图1绵羊瘤胃上皮细胞的培养
Fig1Thecultureofsheeprumenepithelialcells
2.2提取瘤胃上皮细胞总RNA的检测结果
为了检测所提取总RNA是否适于后续试验,将RNA用核酸测定仪测定A260和A280,结果显示其比值均在1.8~2.0之间,表明所提取RNA质量好,且无蛋白及DNA污染。
之后再进行1%的琼脂糖凝胶电泳检查,通过凝胶成像系统分析(图2),可见图中有三条带,从上到下依次为28srRNA、18srRNA和5.8srRNA,5.8srRNA的条带相对比较模糊,加样孔中没有亮带出现,说明提取出来的总RNA是比较完整的,可以用于后续试验。
1.总RNA;M.DL2000DNAMarker
1.TotalRNA;M.DL2000DNAMarker
图2瘤胃上皮细胞总RNA
Fig.2ThetotalRNAofruminalepitheliumcells
2.3检测上皮细胞中SBD-1mRNA相对表达量的结果
2.3.1RT-qPCR扩增曲线、熔解峰曲线和扩増效率曲线
以绵羊β-actin为内参基因,SBD-1为目的基因,将反转录得到的cDNA经RT-qPCR反应,得到各样品扩增曲线(图3A)表明扩增效果良好,从熔解曲线上(图3B)看,SBD-1和β-actin基因的PCR扩增产物分别在86℃、88.5℃时出现单一峰,且没有出现杂峰及异常增宽的主峰,同时熔解峰对应的Tm值与扩增产物的理论Tm值相近,说明荧光定量PCR的扩增产物为单一的具有特异性的产物。
A.扩增曲线;A.Theamplificationcurve;
B.溶解峰曲线;B.Themeltpeakcurve.
图3SBD-1和β-actin扩增曲线及熔解峰曲线
Fig.3TheamplificationcurveandmeltpeakcurveofSBD-1andβ-actin
将β-actin和SBD-1基因cDNA分别以10倍浓度稀释,进行RT-qPCR扩增。
本试验通过荧光定量仪自动绘制的扩增曲线、扩增效率曲线(图4)可以看出,这两个基因的扩增效率接近1,其直线回归相关系数分别为R2(β-actin)=1、R2(SBD-1)=0.999;表明可以用qPCR相对定量法检测SBD-1基因的表达情况,并可以通过运用2-ΔΔCt公式进行目的基因相对表达量的计算。
A.β-actin基因扩增曲线;A.Theamplificationcurveofβ-actin;
B.β-actin基因扩增效率曲线;B.Theamplificationefficiencycurveofβ-actin;
C.SBD-1基因扩增曲线;C.TheamplificationcurveofSBD-1;
D.SBD-1基因扩增效率曲线;D.TheamplificationefficiencycurveofSBD-1;
图4β-actin基因和SBD-1基因扩增曲线及扩增效率曲线
Fig.4Theamplificationcurveandamplificationefficiencycurveofβ-actinandSBD-1
2.3.2不同浓度的活乳酸杆菌与SBD-1mRNA相对表达量的关系
两株乳酸杆菌分别用105、106、107、108、109cfu·mL-1五个浓度(不添加菌作为对照组)与瘤胃上皮细胞共培养,运用RT-qPCR的方法检测细胞内SBD-1mRNA的相对表达量,计算分析后得到结果(图5)。
两株活乳酸杆菌分别对绵羊瘤胃上皮细胞进行8h的诱导中,与对照组相比,两株菌在一定浓度范围内对SBD-1mRNA的表达均有不同程度的促进作用,L.plantarumP-8在106~109cfu·mL-1与空白相比差异显著,而L.caseiZhang范围较小在106~108cfu·mL-1时差异显著(P<0.05),但二者都在浓度为107cfu·mL-1时,与空白相比差异极显著(P<0.01),而且在最高表达处L.plantarumP-8优于L.caseiZhang。
A.L.plantarumP-8浓度与SBD-1mRNA相对表达量的关系
A.TherelationshipbetweenrelativeexpressionofSBD-1mRNAandconcentrationofL.plantarumP-8
B.L.caseiZhang浓度与SBD-1mRNA相对表达量的关系
B.TherelationshipbetweenrelativeexpressionofSBD-1mRNAandconcentrationofL.caseiZhang
C.乳酸杆菌浓度对SBD-1mRNA相对表达量影响的比较
C.EffectoflacticacidbacteriaconcentrationtimeonSBD-1mRNAexpressionbycomparison
图5乳酸杆菌浓度与SBD-1mRNA相对表达量的关系(
±S)
*P<0.05,**P<0.01,与空白组比较
Fig.5Therelationshipb
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