林木功能基因组学及其研究策略.pdf
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林木功能基因组学及其研究策略林木功能基因组学及其研究策略第30卷第6期2010年12月西南林学院JOURNALOFSOUTHWESTFORESTRYUNIVERSITYV01.30NO.6Dec.2O10林木功能基因组学及其研究策略卓仁英,邱文敏,刘明英,蒋晶,乔桂荣(中国林业科学研究院亚热带林业研究所,浙江富阳311400)摘要:
随着杨树等树木基因组测序的完成,林木育种进入了功能基因组学时代,林木功能基因组学研究面临的挑战是系统地对基因组中的所有预测基因进行注释和功能验证.林木功能基因组分析已经进入了高通量阶段,但要识别未知基因的确切功能,有必要了解每个基因在植物细胞所有基因活动网络中发挥的作用.因此,就必须了解各个基因在时间和空间上的表达模式.功能基因组学研究策略已经发展到能对这些成分细胞中基因的活性和浓度同时进行快速的测量.林木功能基因组学技术的最新研究进展能从全基因组进行功能分析,从而打开了林木未知基因功能研究的新途径.目前,广泛应用的林木功能基因组学研究策略有插入突变,FOX系统,蛋白质组学等.关键词:
林木;功能基因组学;插入突变;FOX;蛋白质组学中图分类号:
$718.46文献标识码:
A文章编号:
10037179(2010)06000105ResearchAdvancesinTreeFunctionalGenomicsandRelatedStrategyZHUORenying,QIUWenrain,LIUMing-ying,JIANGJing,QIAOGui-rong(ResearchInstituteofSubtropicalForestry,CAF,FuyangZhejiang311400,China)Abstract:
Asthecompletionofgenomesequencingforpoplarandsomeothertreespecies,treebreedinghasenteredfunctionalgenomicstage,thenextchallengetobefacedwillbetointerpretersystematicallyallpredictedgenesinthegenome,andtotestifythefunctionsofthesegenes.Theanalysisoffunctionalgenomefortreeplantshasenteredthehighthroughputstage.However,toidentifftheexactfunctionofunknowngenes,itisnecessarytounderstandeachgeneSroleinthecomplexorchestrationofallgeneactivitiesintheplantcel1.Genefunctionanalysisthereforenecessitatestheanalysisoftemporalandspatialgeneexpressionpatterns.Thestudystrategyoffunctionalgenomehasbeendevelopedtoenablefastmeasurementsofboththeactivityandconcentrationsofthegenesintheplantcells.Recentimprovementsintechnologiesfortreefunctionalgenomicsmadeitpossibletoconductthefunc-tionalanalysisonthewholegenome,whichsetupanewapproachtostudythefunctionsofunknowngenesintreeplants.Themostwidelyappliedresearchtechnologiesforfunctionalgenomeoftreeplantsincludedinsertionalmutagenesis,FOXhuntingsystemandproteomics,etc.Keywords:
tree;functionalgenomics;insertionalmutagenesis;FOXgenehunting;proteomics杨树全基因组测序的完成标志着林木育种进入了基因组学时代,林木基因组学研究使人们对林木基因组的物理结构和可能编码的所有基因有了比较全面深人的了解.目前,基因组学信息为在基因组的水平上全面系统分析某一生命活动所涉及的遗传背景提供了强大的工具.分析这些生命活动过程所涉及的基因及其所在的整个调控网络,可以解析林木性状形成的遗传背景,通过在基因组或系统水平上全面分析基因功能,使得生物学研究从单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质系统收稿日期:
20101026基金项目:
国家自然科学基金项目(30972340)资助;浙江省自然科学基金项目(R3090070)资助.第1作者:
卓英(1969一),男,副研究员.研究方向:
林木抗逆分子生物学.Email:
zhuorygmail.eom.2西南林学院第3O卷的研究.功能基因组学以高通量,大规模的试验方法及统计与计算机分析为特征,研究内容涉及基因表达谱的绘制,基因功能的鉴定,基因表达调控研究和比较基因组学研究等;采用的手段包括基因表达差异分析,基因表达的系统分析,cDNA微阵列7j,DNA芯片以及反向遗传学等,因此,选择适合于林木基因组高效解析的研究方法对于促进林木功能基因组研究的快速发展具有重要意义.1植物功能基因组学的特点及研究现状植物功能基因组学是当前植物学研究最前沿的领域之一,由于基因功能的研究涉及专利和知识产权,对一个国家的长远发展起战略性的作用,所以国际竞争日益加剧.拟南芥(Arabidopsisthaliana)是第1个完成基因组序列测定的高等植物,利用其作为模式植物进行植物功能基因组学的研究在世界各国开展得如火如荼,大量涉及重要生命过程的基因已被发现.拟南芥是典型的十字花科植物,广泛分布于欧洲,亚洲和北美,它作为模式植物有很多优势:
(1)生长周期短.整个生长周期,包括发芽,莲座叶的长成,到主花序的形成,第1粒种子的成熟可在6周内完成.
(2)体形小,占地少.成熟植株一般1520am高,莲座叶长度不超过5cm.(3)后代多.每株拟南芥可产生上百个果荚约5000粒种子.(4)核基因组小,拟南芥细胞核只有5对染色体,约120Mb(百万碱基).(5)可用浸花转化法进行遗传转化,转化率高达1.7%.(6)拟南芥基因组已测序完成,其基因组DNA包含25498个功能基因组及其所对应的11000个蛋白质家族.这些优势使得拟南芥成为植物科学研究的优良模式植物.水稻(Oryzasativa)是世界重要粮食作物之一,全世界50%以上的人口以其为主食,也是第1个完成基因组测序的禾本科植物.由于其基因组相对较小,遗传转化体系成熟,且与玉米(Zeamays),大麦(Hordeumvulgare)及小麦(Triticumaestivum)等禾本科粮食作物存在共线性,使其成为作物分子遗传学及基因组学研究的模式植物.1998年,中国,日本,美国等10个国家和地区启动了国际水稻基因组测序计划(InternationalRiceGenomeSequencingPro-ject,IRGSP),主要内容是开展遗传图和物理图的绘制,进行基因组序列的测定和注释分析基因序列等研究工作卜14.2005年,粳稻日本晴基因组的精确序列测定被完成.水稻基因组大小为389Mb,预测编码约32000个基因.至此水稻基因组研究全面进入到功能基因组研究时代.我国于21世纪初开始了大规模水稻功能基因组研究,主要包括水稻功能基因组研究的技术平台和重要农艺性状的功能基因组.借鉴拟南芥功能基因研究的技术平台,我国的水稻功能基因组主要创建了大型突变体库,全长cDNA文库,基因表达谱芯片以及相应的生物信息学分析平台.在重要农艺性状功能基因方面,瞄准高产,优质,抗逆等重要农艺性状,成功克隆了水稻分蘖控制基因和脆杆基因,水稻耐盐基因DSTl181,稻米产量关键基因GIF1【19等,在国际上产生重大影响.杨树基因组包含l9对染色体,基因组结构紧凑,微小,具有相当广泛的经济价值和环境保护作用,是一种理想的木本模式植物.2006年,美国能源部完成了对毛果杨无性系Nisqually一1的全基因组测序,拼接的基因组大小为485Mb,拼接成的序列骨架大小在2kb6.72Mb.杨树基因组测序的完成标志着树木育种已经进入功能基因组时代,但面对树木基因组的海量信息以及树木的特性,如世代周期长,杂合度高,形体庞大等,树木功能基因组学研究该如何开展是目前所面临的严峻问题.2林木功能基因组学研究现状杨树基因组测序的完成标志着林木育种新时代的开始.尽管目前尚处于破译4万多个基因功能及其对树木生长发育作用的早期分析阶段,但杨树基因组序列为分子育种提供了重要的资源和手段.林木功能基因组学已经成为林木遗传改良的研究热点.早在杨树基因组测序之前,国内外科学家已经利用各种技术手段探索开展杨树基因组研究.1996年,瑞典Umea植物科学研究中心对杨树形成层(包括活动期和休眠期),应力木,根,叶,树皮,茎尖等及胁迫条件下的组织共19个cDNA文库进行分析,共获得了102019条片段,建立了杨树EST库卜;1998年,加拿大不列颠哥伦比亚大学构建了杨树BAC库;2002年,美国能源部启动了杨树全基因组序列测定工作,并公布了测序结果.最近,美国能源部橡树岭国家实验室利用测序结果,获得了大量分布均匀的SSR序列,建立了高密度遗传图谱J,该图谱由19个连锁群包含544个通用标记组成,平均图距为5cm,覆盖了99.9%的杨树基因组,该图谱为杨树性状定位和克隆提供了框架.由于对制浆材的需求,木材形成的研究成为新第6期卓英等:
林木功能基因组学及其研究策略的热点,木质素合成途径所涉及的基因已被一一分离,鉴定,并用于木质素的基因工程改良,树木组织,器官的发育及逆境胁迫相关的EST分析,进一步解析了树木发育的分子机制,使越来越多的基因被发掘出来.如抑制4CL基因表达的杨树木质素下降高达55%,纤维素增加15%,而生长速度提高,木材解剖结构没有变化.我国也初步开展了林木功能基因组学研究.在木材形成方面,建立了杨树次生维管系统再生系统,采用蛋白质组学和基因芯片技术筛选了在木材形成中起关键作用的基因,其中5个候选基因通过转基因及突变体分析,证明其对次生维管系统的发育具有调控作用.在抗逆研究方面,通过NaHCO胁迫后的紫杆柽柳(Tamarixandrossowii)cDNA文库分离了硫氧还蛋白基因,MnSOD基因等,筛选盐处理的胡杨(Populuseuphratica)cDNA扣除文库获得了1个可能编码胡杨耐盐蛋白的基因,为林木抗逆分子育种奠定了基础.在抗虫方面,分离了抗杨树天牛的基因,接虫试验表明,转基因杨树植株能够明显抑制天牛的发育.在开花控制方面,构建并分析了毛白杨(P.tomentosa)雌,雄花芽的cDNA文库,为筛选与毛白杨开花相关的基因提供了有效的工具.以杨树黑斑病感抗无性系31l,油茶种子,茶树新梢等材料构建了相应的eDNA文库,对控制林木生长发育,脂肪酸合成,抗逆性等重要经济性状有了初步了解.此外还利用多功能激活标签开展了杨树突变体库构建研究,初步建立了高通量,低成本突变体库构建技术.随着杨树全基因组测序的完成,人们对林木基因组的物理结构和可能编码的所有基因有了比较全面深入地了解,并直接催生了杨树全基因组芯片的商业化,为研究细胞或组织在不同生理和环境条件下的基因表达谱信息提供了有效途径,通过鉴定控制该性状的基因以及揭示基因间的相互作用网络,为基因工程技术,分子育种提供理论基础和基因资源.林木功能基因组研究在林木遗传育种和研究领域具有广阔的应用前景和发展空间.有专家指出,包括林木在内的植物基因组结构和功能的阐明及其在育种中的应用,其价值和影响力不亚于人类基因组计划.3林木功能基因组学研究策略林木功能基因组研究利用基因组序列信息,发展和应用新的实验手段,在基因组水平上大规模,高通量地分析基因的功能.弄清林木机体中各组分是如何工作并形成有功能的细胞,组织及整个生物体.其目标是明确基因组中全部基因的功能,揭示植物生长发育,环境应答互作的分子网络,从而全面阐释树木的生物学基础.可以预见,功能基因组研究的成果最终将改变林木科学领域的面貌,并产生深远的影响.利用各种组织类型所构建的文库,EST库和囊括整个基因组的BAC文库,以及基于全基因组序列发展的蛋白质学及芯片分析技术对控制林木生长发育,抗逆性等性状的关键基因数量和功能有了较为深入的认识.树木全基因组的测序和功能基因的挖掘,为开发基于功能基因的分子标记提供了基础,特别是联合遗传学在林木上的应用,为林木性状的遗传解析提供了有效途径.传统的遗传学手段大致可以分为正向遗传学(forwardgenetics)和反向遗传学(reversegenetics)2类.正向遗传学是指,通过生物个体或细胞基因组的自发突变或人工诱变,寻找相关的表型或性状改变,然后从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因,并揭示其功能.反向遗传学的原理正好相反,首先是改变某个特定的基因或蛋白质,然后再去寻找有关的表型变化,如基因剔除技术或转基因研究.简单地说,正向遗传学是从表型变化研究基因变化,反向遗传学则是从基因变化研究表型变化.构建突变体库是林木功能基因组学研究的有效方法之一.通过理化诱变和生物技术构建的等基因系仅个别或者一些位点的DNA结构发生变化,总体的遗传背景是一致的,因此,在生物学研究特别是基因克隆和功能研究中受到高度重视.国外许多学者j将适用于拟南芥的TDNA标签和AC/DS系统等插入突变方法应用于杨树基因组研究.OregonStateUniversity建立了一个含有627个株系的杨树TDNA插入突变体库,并分离出一个控制杨树高生长的PtaGA20X1基因4oj.QueensUniversity的SharonRegan实验室构建了一个世界最大的杨树突变体库,含有1800个转基因株系,也发现了一批表型异常的突变体.研究发现,利用TDNA插入或激活标签可以有效获得表型异常的转基因株系,对建库的材料遗传背景要求较低,表型可见的突变体获得率为4%7%,突变类型覆盖叶形,微管束,木材形成,生长发育等方面.基因功能除了利用上述技术解析外,另一个不4西南林学院第3O卷得不采用的技术就是增强基因的表达,看是否出现了与基因knockout/knock.down相反的表型,还是出现了新的表型.日本研究人员为了研究众多基因的功能,发展了利用拟南芥大规模超量表达已经分离的全长cDNA的系统,即利用FoxHunting系统(Full-lengthcDNAOver-expressorGeneHunting)分别鉴定拟南芥全长基因和水稻已有全长基因.目前已经在水稻中产生了12000个由ubiq.uitin强启动子控制的独立FOX株系.蛋白质组学是在生物体或其细胞的整体蛋白质水平上进行的,从一个机体或一个细胞的蛋白质整体活动来解释生命规律.对蛋白质组学研究可以提供如下信息:
基因序列预测的基因产物是否以及何时被翻译,基因产物的相对浓度,翻译后被修饰的程度等.蛋白质组是动态的,具有时空性和可调节性,能反映某基因的表达时间,表达量,以及蛋白质翻译后的加工修饰和亚细胞的分布等.林木蛋白质组学研究主要集中在对杨树(Populusspp.),桉树(Euca一切spp.),橡树(Qrcpalustris)等阔叶树种及海岸松(Pinuspinaster),白松(Pinusbungeana),挪威云杉(Piceno6)等针叶树种的研究上.其中,对海岸松的研究较多.Costa等应用2一DE和氨基酸测序法研究了海岸松干旱胁迫下针叶蛋白表达的变化,共得到大约1000个蛋白点,发现38个受干旱影响的蛋白质,对其中11个蛋白质进行氨基酸序列分析,通过序列同源性搜索鉴定了10个蛋白质,包括与光合作用,细胞延长有关的蛋白质,表达受到抑制还有参与抗氧化代谢,木质化作用的蛋白质.Renaut等还应用蛋白质组学的方法研究了低温对杨树蛋白表达的影响,以在23条件下生长的植株为对照,分析了生长3个月的杨树暴露于4oC低温7d和14d时叶子蛋白质组的变化,共检测到800多个蛋白质,其中有60个蛋白质受到低温的影响.近年来,在转录水平上对木材形成进行研究备受关注,大规模cDNA测序以及基因表达谱分析可以鉴定参与该过程的一些关键基因.而蛋白质作为基因最终的表达产物,可能经过修饰后执行或失去功能.因此,蛋白质组分析是对转录本所获得的数据的重要补充.杨树由于基因组相对较小,遗传转化比较容易等特点已被广泛接受作为林木研究的模式树种.特别是其基因组草图的完成将为林木蛋白质组学研究提供重要信息.深入开展对模式树种的研究有利于阐明林木生长过程中特有的生命现象如休眠,适应性,木材形成等重要性状的分子机制,也为进一步开展其他木本植物的研究奠定了基础.4展望随着杨树等林木全基因组序列测定的完成以及植物基因组和蛋白质组学工具的开发,林木遗传与改良的功能基因组时代已经到来.在这一背景下,我国林木遗传育种应着重从基因的转录,翻译,翻译后修饰,细胞层次上的各种组学研究中开拓创新,进一步揭示林木重要基因在林木生长,发育过程及对环境反应的分子机制;克隆,鉴定与林木材性,抗逆,生长发育等相关的,具有重要育种价值和应用前景的功能基因,并对其功能进行验证,为培育速生,优质,抗性强的林木良种储备基因资源.杨树基因组测序的完成为全面而系统地了解林木生长发育特定的生物学过程奠定了基础.利用结构基因组学研究的结果和信息揭示某一生命过程所涉及的基因及其功能是功能基因组学的主要研究内容,包括大规模的基因分离,不同生长发育时期和外界环境信号诱导下的基因表达谱的建立,蛋白质组学分析和基于全基因组的突变体库的建立等,基因分离仍是植物功能基因组学的重要方面.根据我国的林木特点,社会发展需要以及现有工作基础,建议我国未来一段时间内树木功能基因组学研究侧重开展以下几方面工作:
(1)构建杨树等我国重要树种基于RNAi,TDNA激活标签等技术的突变体库,建立并公开侧翼序列,插入位点和突变体数据库;
(2)应用最新的焦磷酸测序技术,研究不同生理和环境条件下细胞或组织中基因表达谱信息,分离,鉴定控制林木重要经济性状的关键基因及其调控网络;(3)利用拟南芥,杨树,桉树等基因组信息,开展林木比较基因组学研究,分析林木相关基因的功能;(4)根据已公布的毛果杨(Populustricho-carpa)的基因组序列,开展我国特有胡杨派杨树的结构基因组研究,分析胡杨耐干旱,耐盐碱等性状与基因组结构的关联性;(5)开展重要针叶树全基因组测序及其功能基因发掘与利用的研究.参考文献1王柏臣,甘四明,卢孟柱,等.林木遗传学发展R.北京:
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