浅谈HPLC法测定有关物质时已知杂质的计算方法.pdf
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中国药品标准2010年第11卷第4期278?
DrugStandardsofChina2010,Vol?
11No?
4作者简介:
余振喜,男,助理研究员。
学科及研究方向:
药品检验和质量标准研究。
联系电话:
010-67095319。
?
方法学研究?
浅谈HPLC法测定有关物质时已知杂质的计算方法余振喜,庾莉菊,黄海伟,张启明(中国药品生物制品检定所,北京100050)中图分类号:
R921?
2?
文献标识码:
A?
文章编号:
1009-3656(2010)-4-278-5DiscussionontheCalculationMethodsoftheKnownImpuritiesinRelatedSubstancesDeter?
minedbyHPLCYuZhen?
x,iYuLi?
ju,HuangHai?
we,iZhangQi?
ming(NationalInstitutefortheControlofPharmaceuticalandBiologicalProducts,Bei?
jing100050)?
药品注册的国际技术要求(ICH)指出原料药中的杂质是指存在于原料药中,但其化学结构与原料药不一样的任何一种成分;制剂中的杂质是指制剂中除了原料药或赋形剂以外的其他任何成分1。
根据ICH中杂质的含义,杂质分为有机杂质、无机杂质和残留溶剂。
有关物质是杂质的一种,主要是指有机杂质,它可能是原料药合成过程中带入的原料药前体、中间体、试剂、分解物、副产物、聚合体、异构体以及不同晶型、旋光异构的物质,也可能是制剂过程或是在贮藏、运输、使用过程中产生的降解物2?
3。
有关物质的检查方法很多,目前主要有薄层色谱法(TLC)、液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、紫外分光光度法(UV)及容量分析法等。
而其中的HPLC法具有专属性强、分离效果好、灵敏度高、分析速度快、重复性好、操作简便等诸多优点,且能与多种类型检测器联合应用,能满足大多数化合物种类的检测需要,比较符合有关物质检查时杂质含量低、种类多的特点2?
6。
随着液相色谱技术的进一步完善,新型检测器的不断开发,以及各种类型检测器的联合应用,HPLC将在有关物质检查中发挥更大的作用。
根据ICH要求,无论是原料还是制剂,只要是其中实际存在的、含量大于给定鉴定阈值的杂质都要进行鉴定1。
根据这一要求,药品中的一部分杂质应该是已知杂质。
HPLC法测定有关物质中已知杂质的测定方法很多,计算方法也相应很多,虽然某一药品中某一杂质的实际含量是一定的,但不同的计算方法会得出不同的结果,每种计算方法都有不同的意义及其优缺点,下面参考国内外药品标准和相关期刊文献,结合在药品检验中的实际工作,对这些计算方法作一简单探讨,以期为药品质量标准的建立或进行相关研究时对有关物质检查中已知杂质的计算方法的选择提供借鉴和参考。
表1是各种计算方法的计算公式及其主要优缺点。
1?
面积归一化法面积归一化法具有与称样量及进样量基本不相关的特点,因此重复性和重现性均良好,不需要折算,降低了实验中对称样量精密度的要求,降低了检验成本,操作更加简便、快捷,省去了计算过程7?
8。
但需要强调的是面积归一化法是在假设所有成分均出峰、所有杂质均与主成分分离并且所有杂质均与主成分响应因子相同的前提下,只有在这种假设的前提下,计算出的结果才可能完全真实地反映该杂质在样品中的比例。
可这毕竟只是假设,实际情况可能并非如此。
另外当杂质是微量的时候需增加方法的灵敏度,就要增加进样量,此时主成分可能超出仪器检测范围,或虽然在仪器检测范围内,理论上讲此时可能与主成分不在同一线性范围内,为防止此种情况的出现,才引入了不加校正因子的主成分自身对照法!
7。
正是由于各杂质的响应因子不同、含量较低和需要较宽的线性范围等因素的影响,中国药典#2005年版二部附录中特别强调本法通常只能用于粗略考察供试品中的杂质含量。
除另有规定外,一般不宜用于微量杂质的检查!
9,这也在一定程度上限制了本法的使用。
但片面的认为面积归一化法有弊端,不能采用,只有不加校正因子的主DrugStandardsofChina2010,Vol?
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4中国药品标准2010年第11卷第4期279?
表1?
各种计算方法的计算公式及其主要优缺点No?
计算方法计算公式(杂质含量%)优点缺点1面积归一化法Ai/Asp100%精密度好/操作简捷/无需杂质对照品需较宽的线性范围/响应因子不同带来误差2?
1不加校正因子的主成分自身对照法(AiCd)/(AdCs)100%操作简便/运算方便/无需杂质对照品响应因子不同带来误差2?
2加校正因子的主成分自身对照法(AiCd)/(AdCsF)100%结果较准确/无需杂质对照品杂质不容易定位3?
1不加校正因子的主成分对照品外标法(AiCr)/(ArCs)100%结果较准确/无需杂质对照品需主成分对照品/响应因子不同带来误差3?
2加校正因子的主成分对照品外标法(AiCr)/(ArCsF)100%结果准确/无需杂质对照品需主成分对照品/杂质不容易定位4杂质对照品外标法(AiCir)/(AirCs)100%结果准确需杂质对照品5加转换因子的杂质对照品外标法(AiCirZ)/(AirCs)100%结果准确需杂质对照品6加转换因子和校正因子的主成分对照品外标法(AiCrZ)/(ArCsF)100%结果准确/无需杂质对照品需主成分对照品/杂质不容易定位/运算复杂7内标法(AnC)/(ACn)(AiCsn)/(AsnCs)100%可抵消仪器和过程带来的误差需内标物质和对照品/操作和运算较繁琐注:
Ai?
供试品溶液中杂质的峰面积,Asp?
除溶剂峰以外的总色谱峰面积,Ad?
对照溶液中主峰面积,Ar?
主成分对照品溶液中主峰面积,Air?
杂质对照品溶液中主峰面积,Cd?
对照溶液浓度,Cs?
供试品溶液浓度,Cr?
主成分对照品溶液浓度,Cir?
杂质对照品溶液浓度,An、Cn与Asn、Csn分别指内标法中对照品溶液和供试品溶液中内标物质的峰面积和浓度,A与C分别指内标法中对照品溶液的峰面积和浓度,F?
校正因子,即各已知杂质相当于主成分响应的换算系数,Z?
转换因子,即主成分与杂质的分子量之比。
成分自身对照法才行,这种观点也是片面的7?
10。
如对已知杂质采用加校正因子的面积归一化法进行计算,则可提高结果的准确性,但这样仍没有解决液相系统要求的线性范围较大引起的系统误差,这也是面积归一化法的缺点所在。
2?
主成分自身对照法2?
1?
不加校正因子的主成分自身对照法本法是配制一个浓度与杂质限度相当的供试品溶液作为对照溶液,一般是由供试品溶液直接稀释得到。
对照溶液有二个用途:
一是用来调节仪器的灵敏度,二是用于与供试品溶液色谱图上的杂质峰面积进行比较(相当于一个外标),以计算杂质的含量6。
由于本法不需要杂质对照品,当无法获得杂质对照品时,可采用不加校正因子的主成分自身对照法来计算杂质的含量。
同面积归一化一样,本法也是在假定供试品溶液中所有成分均出峰、所有杂质均与主成分分离且各杂质和主成分的响应因子均相同的前提下进行的。
同面积归一化一样,本法的优点是操作简单、运算方便,无需杂质对照品;缺点是忽略了各杂质与主成分的响应因子可能不同的事实,导致了实验测得的杂质含量可能与真正的杂质含量不一致。
此外,不加校正因子的主成分自身对照法会存在稀释步骤、进样针和进样阀残留、进样误差等影响因素,往往也会导致计算出的杂质与真实含量之间存在一定的误差;但不加校正因子的主成分自身对照法可以解决面积归一化法中可能出现的仪器检测范围和线性范围问题。
鉴于目前我国药品研发和生产的现状,大多数药品生产企业没有对药品中的有关物质进行深入的研究,因此也就没有对相应的杂质进行定性鉴别;即使是对有些杂质进行了定性鉴别,但由于这些杂质对照品的获得和供应比较困难,最后也没有落实到药品标准中。
基于此,不加校正因子的主成分自身对照法仍是现行版中国药典#和其他国家药品标准及药品研发时制定的质量标准中应用最多、最广泛的有关物质的测定方法和计算方法。
2?
2?
加校正因子的主成分自身对照法该方法的操作步骤基本与2?
1相同,唯一不同的是在计算时把杂质相当于主成分的响应因子考虑进去。
本法相当于一个简化的内标法,同时也是对杂质对照品外标法的简化,即在研究方法学时,利用杂质对照品和主成分对照品,分别测定杂质和主成分的线性方程,以斜率之比计算杂质相对于主成分的校正因子,此校正因子可直接载入质量标准中,在常规检验时用以校正该杂质的实测峰面积。
在实际测定时,可采用相对保留时间进行杂质定位。
此法的优点是在日常检验中省去了杂质对照品(特别是在杂质不够稳定或将来供应有困难时显得尤其重中国药品标准2010年第11卷第4期280?
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4要),同时又考虑到了杂质与主成分的响应因子可能不同所引起的测定误差,所以本法操作比较方便、准确度较好;缺点是相对保留时间在不同实验室间可能有所波动,特别是当供试品中存在多个杂质而又分离不好时可能造成杂质定位困难6。
当然,在实际实验时,也可采用含有该杂质的药品粗品、含有该杂质的系统适用性试验用对照品或纯度不高的杂质对照品进行杂质定位。
需要指出的是,如果已知杂质对主成分的相对响应因子在0?
91?
1范围内时,可以直接采用不加校正因子的主成分自身对照法计算;超出0?
91?
1范围时,宜用加校正因子的主成分自身对照法或杂质对照品外标法法进行计算11。
总之,加校正因子的主成分自身对照法是一个比较方便、准确的对已知杂质进行计算的方法,虽然目前在国内应用较少,但在国外药品标准中应用比较广泛。
相信今后在我国的药品标准中一定会得到推广应用并将成为有关物质计算的主要方法。
3?
主成分对照品外标法主成分对照品外标法包括加不校正因子的主成分对照品外标法和加校正因子的主成分对照品外标法。
不加校正因子和加校正因子的主成分对照品外标法分别与不加校正因子和加校正因子的主成分自身对照法的意义、操作、计算和优缺点基本一样,唯一不同的是前者要用主成分对照品制备一个浓度与杂质限度相当的溶液作为对照品溶液,后者是由供试品溶液直接稀释得到一个浓度与杂质限度相当的溶液作为对照溶液。
但由于主成分对照品是经过标定的,其纯度或量值会比较准确,而制剂中主成分的实际含量与标示量有时会不完全一致,因此采用对照品外标法计算出的杂质的实际绝对含量要比自身对照法准确一些。
美国药典#多采用加校正因子或不加校正因子的主成分对照品外标法来对已知杂质进行计算。
当然,由于本法要使用主成分对照品,从而导致操作成本会提高一些,操作过程会繁琐一些。
4?
杂质对照品外标法杂质对照品外标法要求提供一定纯度的杂质对照品,分析时需制备一个浓度应与杂质限度相当的溶液作为杂质对照品溶液。
由于杂质对照品外标法可以解决上述几种测定方法和计算方法存在的种种问题,特别是杂质与主成分响应不一致的问题,因此,本法能反映药品中该杂质的真实含量。
如果杂质对照品容易获得并能持续供应,建议在有关物质检查中已知杂质的测定和计算时首选该法,特别是当该杂质与主成分的相对响应因子相差较大(超出0?
91?
1范围)或该杂质有毒副作用时,欧美药典中采用此法进行有关物质计算的品种也不在少数。
虽然杂质对照品的获得和供应比较困难,在国家药品标准中是否引入杂质对照品应权衡并慎重,但由于该法能真实反映药品中某一杂质的含量,因此采用杂质对照品外标法应该是今后有关物质检查时努力的方向。
5?
加转换因子的杂质对照品外标法加转换因子的杂质对照品外标法其实也是杂质对照品外标法的一种。
本法的操作方法与测定方法同杂质对照品外标法一样,不同的是在计算公式中多乘以一个转换因子,其意义就是把样品中某一杂质的含量转换成相当于主成分本身的重量百分比水平。
假设某一制剂的标示量为100mg,采用杂质对照品外标法计算出某一杂质的含量为主成分的1?
0%,若该杂质与主成分的分子量之比为1%2,则按加转换因子的杂质对照品外标法计算出的该杂质的含量为2?
0%,即该杂质的真实含量为1?
0mg,但通过分子量之比换算成相当于主成分的含量为2?
0mg。
由于杂质的分子量可能大于或小于主成分的分子量(即主成分的分子量/杂质的分子量可能小于1或大于1),因此采用本法计算出的某一杂质的含量结果也可能比面积归一化法、主成分自身对照法、主成分对照品外标法和杂质对照品外标法计算出的结果偏低或偏高。
6?
加转换因子和校正因子的主成分对照品外标法加转换因子和校正因子的主成分对照品外标法其实也是主成分对照品外标法的一种,就是在加校正因子的主成分对照品外标法的基础上乘以转换因子。
其操作和优缺点与加校正因子的主成分对照品外标法一样,其意义与加转换因子的杂质对照品外标法一样,也是通过杂质和主成分分子量之比的换算把该杂质的含量转换成相当于主成分本身的百分比水平。
7?
内标法按各品种项下的规定,分别精密量取含有一定浓度内标物质的对照品溶液和供试品溶液,注入液相色谱仪,记录色谱图,测定对照品溶液中对照品和内标物质的峰面积及供试品溶液中待测成分(这里指待测杂质)和内标物质的峰面积,根据表1中的公式计算杂质的含量。
这里的对照品可以是杂质对照品,也可以是主成分对照品。
当配制校正因子测定用的对照品溶液和含有内标物质的供试品溶液使DrugStandardsofChina2010,Vol?
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4中国药品标准2010年第11卷第4期281?
用等量同一浓度的内标物质溶液时,则配制内标物质溶液不必精密称(量)取9。
内标法主要是为了解决仪器进样精密度和药物中所含成分的回收率的问题,这种方法可以抵消仪器和过程带来的误差。
但在以常压六通阀定量环进样和回收率已经验证的情况下,意义已不大,加之内标物质的选择比较困难,内标物质的添加会导致分离难度的增大,操作过程更加烦琐等问题,本法已经使用很少12。
中国药典#1990年版和1995年版二部附录中所载的内标法(不加校正因子)测定供试品中杂质的总量限度!
的方法13?
14,由于实用性不大,已从中国药典#2000年版二部附录中予以删除15。
现版中国药典#二部含量测定中采用内标法的品种所占比例已经很小,预计今后还会减少,在有关物质测定时更加少用甚至没有采用(虽然中国药典#2005年版二部附录&D高效液相色谱法测定法中提及到)。
在上述HPLC法测定有关物质时计算已知杂质的几种方法中,其中的面积归一化法、不加校正因子的主成分自身对照法和不加校正因子的主成分对照品外标法也可以用于未知杂质的计算。
在实际工作中,我们关注的药物中的杂质一般仅占百分之几到千分之几,与主成分相差几十至几百倍,但随着现代液相色谱仪性能的提高,仪器的线性范围也越来越宽,在实际检测时,一般不会超出线性范围,所以面积归一化法与不加校正因子的主成分自身对照法和不加校正因子的主成分对照品外标法计算所得的结果理论上应该是基本一致的。
此外,需要指出的是,在采用外标法对杂质进行计算时,无论是杂质对照品外标法还是主成分对照品外标法,杂质含量的计算结果会因供试品溶液浓度的选择而不同,因为供试品溶液浓度可以选择实际含量测定的结果,也可以选择标示量,前者是杂质占主成分实际含量的百分率,后者是杂质占主成分标示量的百分率。
因此,如果含量测定结果与标示量相差较大时,建议还是选择前者对杂质进行计算比较合理。
采用HPLC法测定药品中有关物质时,在现行版中国药典#二部品种有关物质检查项下,大多是对未知杂质的检查和限定,这也从一个侧面反映了我们在药品研发和质量标准制订中相比于美国药典#、欧洲药典#和英国药典#还有许多需要完善和提高的地方,同时这也是中国药典有关物质检查中大多数品种采用不加校正因子的主成分自身对照法进行计算的原因。
现举例说明不同计算方法对HPLC法测定有关物质中已知杂质测定结果的影响。
抗高血压药马来酸依那普利片中有关物质的计算方法,中国药典#2005年版二部中所有杂质(包括已知杂质依那普利拉和依那普利双酮)采用的均是不加校正因子的主成分自身对照法9;英国药典#2008年版中已知杂质依那普利拉和依那普利双酮采用的是杂质对照品外标法,其他杂质采用的是不加校正因子的主成分自身对照法16;英国药典#31版中已知杂质依那普利拉采用的是加转换因子的杂质对照品外标法,依那普利双酮采用的是加转换因子和校正因子的主成分对照品外标法,其他杂质采用的是不加校正因子的主成分对照品外标法17。
由于不同计算方法所表示的意义不同,所以得出的结果也不相同。
表2就是某企业生产的马来酸依那普利片,按上述不同计算方法得出的杂质的含量结果。
表2?
不同方法计算马来酸依那普利片中有关物质得到的结果计算方法依那普利拉依那普利双酮其它杂质总杂质10.220.380.511.202.10.200.350.471.112.20.200.280.471.043.10.170.310.410.983.20.170.250.410.9240.240.330.411.0750.140.280.470.9860.200.380.471.14注:
依那普利拉和依那普利双酮与马来酸依那普利的转换因子分别为1?
41和1?
37;依那普利拉和依那普利双酮相当于马来酸依那普利响应的校正因子分别为1?
00和1?
25。
由表2可知,不同的计算方法得出有关物质中已知杂质和总杂质的含量不尽相同,如果采用统一的限度,就会出现同一杂质采用不同的计算方法,结果在有些情况下符合规定,而有些情况下不符合规定的现象,这种情况下只能根据不同的计算方法和有关要求制订合理的限度。
理论上讲,只要制定合理的限度,无论采用哪种计算方法,都同样可以有效控制杂质的含量,因此,根据测定和计算方法的选择确定合理的杂质限度才是最关键的。
但理想的杂质定量方法为已知杂质对照品法与未知杂质不加校正因子的主成分自身对照法两者的结合11,不过对于已知杂质,加校正因子的主成分自身对照法和加校正因子的主成分对照品外标法也是可以中国药品标准2010年第11卷第4期282?
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11No?
4优先考虑的,研究人员可根据实际情况选用合适的定量方法。
参考文献1?
周海钧主译?
药品注册的国际技术要求?
质量部分M?
北京:
人民卫生出版社,2006:
101?
103?
2?
谢沐风,罗霞萍,陈亚美?
如何建立HPLC法测定有关物质的方法J?
中国药品标准,2002,3(6):
6?
8?
3?
孔英梅,杨伯群?
新药有关物质检查中的一些问题J?
中国新药杂志,2000,9(7):
462?
464?
4?
许润娟,汤艳群?
HPLC法在药品有关物质检查中的应用探讨J?
国际医药卫生导报,2005,(7):
96?
97?
5?
许润娟?
药物的杂质及杂质检查J?
中医药学刊,2005,23(7):
1323?
1325?
6?
凌大奎?
有关物质及其高效液相色谱测定法J?
中国药学杂志,2000,35(8):
567?
569?
7?
张启明,李慧义?
色谱分析中面积归一化法测定有关物质的弊与利J?
中国药品标准,2005,6(4):
45?
468?
狄永平?
关于阿莫西林胶囊检查项中有关物质计算方法的讨论J?
中国实用医药,2007,2(22):
94?
95?
9?
国家药典委员会?
中国药典#2005年版?
二部S?
北京:
化学工业出版社,2005:
附录28?
30?
10?
陈悦,陈镇生?
HPLC面积归一化法测定有关物质的弊端J?
中国药品标准,2003,4(3):
29?
11?
国家食品药品监督管理局?
药物研究技术指导原则(2005年)?
北京:
中国医药科技出版社,2006:
17?
2712?
卢彩霞,林力行?
制订新药质量标准时有关HPLC法检查有关物质的点滴经验J?
江苏药学与临床研究,2004,12(3):
62?
63?
13?
中华人民共和国卫生部药典委员会?
中国药典#?
1990年版?
二部S?
北京:
化学工业出版社,人民卫生出版社,1990:
附录32?
34?
14?
中华人民共和国卫生部药典委员会?
中国药典#?
1995年版?
二部S?
北京:
化学工业出版社,广东:
广东科技出版社,1995:
附录25?
27?
15?
国家药典委员会?
中国药典#2000年版?
二部S?
北京:
化学工业出版社,2000:
附录32?
34?
16?
英国药典#?
Vol?
2008:
2661?
2662?
17?
美国药典#?
Ed31?
Vol(?
2008:
2056?
2058?
作者简介:
付丽娟,女,主任药师。
学科及研究方向:
药学及药品质量研究。
联系电话:
13720379239。
依诺沙星有关物质测定方法的完善付丽娟,陈蓉(武汉市食品药品检验所,武汉430012)摘要?
目的:
完善中国药典#2005年版二部依诺沙星有关物质检查方法。
方法:
在中国药典#2005年版二部依诺沙星有关物质检查方法的基础上,增加含高有机相流动相的洗脱步骤,使依诺沙星中低极性的有光毒性的杂质可以检测出来。
结果:
检测的样品中从依诺沙星原料、片剂、胶囊剂到滴眼剂均含有低极性杂质。
结论:
方法简便易行,是在2005年版药典有关物质测定方法基础上的延续,优于梯度洗脱方法。
关键词:
依诺沙星;有关物质;低极性杂质中图分类号:
921?
2?
文献标识码:
A?
文章编号:
1009-3656(2010)-4-282-6OptimazationofRelatedSubstancesTestMethodforEnoxacinFuLi?
juan,ChenRong(WuhanInstituteforFoodandDrugControl,Wuhan430012)Abstract?
Objective:
PerfectingrelatedsubstancestestmethodforEnoxacininChinesePharmacopoeia2005editionVol?
(?
Meth?
od:
ThemobilephaseBconsistingofmoreorganiccomponentwasneedfordetectinglowpolarityimpurityinEnoxacin?
Results:
Enoxacin,EnoxacinTablets,EnoxacinCapsulesandEnoxacinEyeDropsallcontainlowpolarityimpurity?
Conclusion:
Themethodissimple,rapidandbetterthanlineargradient?
KeyWords:
Enoxacin;RelatedSubstances;LowPolarityImpurity?
依诺沙星作为喹诺酮类抗感染药,其抗菌谱广。
在临床上已广泛采用。
为了控制其质量,中国药典#2000年版二部1,及2005年版二部2,均有收载。
2000年版含量采用容量法,有关物质采用薄层
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- 浅谈 HPLC 测定 有关 物质 已知 杂质 计算方法